SN/T 4299-2015
基本信息
标准号： SN/T 4299-2015
中文名称：猪捷申病毒性脑脊髓炎检疫技术规范
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4299-2015.Quarantine protocol for teschovirus encephalomyelitis.
1范围
SN/T 4299规定了猪捷申病毒性脑脊髓炎病毒分离、病毒中和试验、间接免疫荧光试验、血清中和试验和酶联免疫吸附试验的技术规范。
SN/T 4299适用于猪捷申病毒性脑脊髓炎的诊断及流行病学调查。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分 析实验室用水规格和分析方法
GB/T18088出人境动物检疫采样
GB 19489实验室生物安 全通用要求
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
CPE细胞病变
ELISA酶联免疫吸附试验
EDTA乙二胺四乙酸
FITC异硫氰酸盐荧光素
IBRS-2猪肾 细胞系
OD值光密度值
PBS磷酸盐缓冲液
PK15猪肾 细胞系
PTV猪捷申病毒
ST猪睾丸细胞系
4临床诊断
4.1临床症状
临床症状主要表现为神经性症状,分急性和亚急性,参见附录A中A.1。
4.2病理 变化
主要病变出现在神经组织,参见A.2。
1范围
SN/T 4299规定了猪捷申病毒性脑脊髓炎病毒分离、病毒中和试验、间接免疫荧光试验、血清中和试验和酶联免疫吸附试验的技术规范。
SN/T 4299适用于猪捷申病毒性脑脊髓炎的诊断及流行病学调查。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分 析实验室用水规格和分析方法
GB/T18088出人境动物检疫采样
GB 19489实验室生物安 全通用要求
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
CPE细胞病变
ELISA酶联免疫吸附试验
EDTA乙二胺四乙酸
FITC异硫氰酸盐荧光素
IBRS-2猪肾 细胞系
OD值光密度值
PBS磷酸盐缓冲液
PK15猪肾 细胞系
PTV猪捷申病毒
ST猪睾丸细胞系
4临床诊断
4.1临床症状
临床症状主要表现为神经性症状,分急性和亚急性,参见附录A中A.1。
4.2病理 变化
主要病变出现在神经组织,参见A.2。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4299—2015
猪捷申病毒性脑脊髓炎检疫技术规范Quarantine protocol for teschovirus encephalomyelitis2015-09-02发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-04-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4299—2015
本标准参照国际动物卫生组织（OIE《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》（2012版）（ManualofDiagnosticTestsandVaccinesforTerrestrialAnimals，2012)中2.8.10规定的主要诊断技术编制。两者的主要差异如下：
—本标准未采用2.8.10提出的聚合酶链式反应。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国江西出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：张强、熊炜、王巧全、李树清、李健、张志灯、杨春华、王艳、蒋静、林颖、吴绍强、张永宁。
1范围
猪捷申病毒性脑脊髓炎检疫技术规范SN/T4299—2015
本标准规定了猪捷申病毒性脑脊髓炎病毒分离、病毒中和试验、间接免疫荧光试验、血清中和试验和酶联免疫吸附试验的技术规范、本标准适用于猪捷申病毒性脑脊髓炎的诊断及流行病学调查。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和分析方法GB/T18088出人境动物检疫采样
GB19489实验室生物安全通用要求3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
CPE细胞病变
ELISA酶联免疫吸附试验
乙二胺四乙酸
异硫氰酸盐荧光素
IBRS-2
猪肾细胞系
OD值光密度值
PBS磷酸盐缓冲液
猪肾细胞系
猪捷申病毒
猪睾丸细胞系
TCIDso
组织培养半数感染量
Tris三羟甲基氨基甲烷
临床诊断
临床症状
临床症状主要表现为神经性症状，分急性和亚急性，参见附录A中A.1。病理变化
主要病变出现在神经组织，参见A.2。1
SN/T4299—2015
4.3流行病学
不同年龄、品种的家猪和野猪均易感，参见A.3。4.4初步诊断
根据临床症状、病理变化和流行病学可以作出初步判断，进一步确诊应采集样品进行实验室检测。5实验室诊断
5.1设备、材料和试剂
本标准所用水应符合GB/T
6682中二级水的规格。下列试剂除特殊规定外，均指分析纯试剂。PTV标准毒株、标准阳性血清、标准阴性血清。5.1.1
细胞：PK15、IBRS-2、ST细胞系胎牛血清：56℃水浴灭活30min。细胞培养液、细胞维持液、细胞分散液、PBS(0.011mol/LpH7.4)缓冲液、病毒培养液：见附录B。FITC标记的兔抗猪IgG：购买商品化试剂，按说明书稀释。0.01%伊文斯蓝：见附录B
s甘油缓冲液：见附录B。
0.1mol/LpH8.6的Tris
0.01mol/LpH7.4TEN
的缓冲液：见附录B。
辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG。封闭液、底物液、稀释液、终止液：见附录BS
生物安全柜。
倒置显微镜。
荧光显微镜。
37℃恒温培养箱。
二氧化碳培养箱。
微量移液器。
高速冷冻离心机。
超速离心机。
洗板机。
酶标仪。
采样标准
按GB/T18088规定采样。
涉及病原的检测应在二级生物安全实验室进行，样品保存和废弃物处理应按照GB19489要求进行。
5.2.2病料的采集
将发病猪扑杀，无菌采集病猪的脑和脊髓。疑似病例，也可采集粪便样品。不能立即鉴定的样品，需保存于pH7.4磷酸甘油缓冲液（等体积的0.01mol/LpH7.4PBS和甘油）中。2
血样的采集制备
SN/T4299—2015
无菌采集动物血，每头不少于5mL。自然凝固后无菌分离血清，分装，加盖密封，做好标示后冷藏保存。
5.3病毒分离
5.3.1病料处理
5.3.1.1称取1g组织块，切碎，研磨，用PBS(0.01mol/LpH7.4)制成质量分数为10%的悬液；粪便样品取0.1g固体粪便或0.1mL液体粪便，再加人1mLPBS，置于涡旋振荡器混匀。5.3.1.2样品悬液800g转速离心
10min。
U青霉素和100mg链霉素，4℃放置12h。5.3.1.3每毫升上清液加人100IU5.3.1.4上清液用于接种单层细胞培养物，粪便样品上清液做梯度稀释后接种细胞；无菌血清样品可直接接种单层细胞培养物。
2操作步骤
长满单层细胞的25cm2细胞培养瓶弃去生长培养基，在细胞瓶内接人1mL可疑组织上清液；接种的细胞瓶置37℃培养箱感作1h：倒掉接种液，细胞层用无菌PBS洗1次～2次，补充无胎牛血清维持液；置37℃二氧化碳培养箱培养，每天观察CPE，连续观察3d~4d,若无CPE，则收取培养物，反复冻融3次后接种到长满单层的细胞上，盲传3代。出现CPE，收取培养物，一70℃以下保存待鉴定。粪便样品接种24h内出现细胞死亡，可能由于粪便的毒性作用所致。试验同时设未接种样品的细胞
对照。
5.3.3结果判定
5.3.3.1对照细胞正常，接种样品的细胞盲传3代后无CPE，判为阴性2初期出现小病灶，病灶中的细胞圆缩，有折光性。进一步培养，CPE增多，所有细胞脱壁。经5.3.3.2
过连续传代后，病毒生长良好，可在24h～48h后产生完全的CPE。出现上述典型CPE的培养物，可用病毒中和试验或间接免疫荧光试验进一步鉴定血清型。5.3.3.3
5.4病毒中和试验
5.4.1操作步骤
从细胞培养物中收获的分离物用维持液从10-1到10-6作10倍梯度稀释。若鉴定捷申病毒血清型，每个梯度都要有对应的血清型，则需要加12列。50μL1：10稀释的PTV-1～PTV-11型标准阳性血清依次加到1列～11列孔内，50μL标准阴性血清加到最后一列。振荡混匀后混合物置4℃反应过夜或37℃反应1h，随后转人长满单层培养物的微孔板孔内。接种后细胞置37℃二氧化碳培养箱继续培养。72h后开始观察CPE，其后每天1次，根据CPE出现情况，一直观察10d。5.4.2结果判定
如果分离物在PTV-1型标准阳性血清对应列的滴度比阴性血清列低103以上，就可判定该分离病毒属于PTV-1，依此类推。
SN/T4299—2015
5.5间接荧光抗体试验
5.5.1操作步骤
5.5.1.1把可疑分离物接种在长满单层细胞的多孔载玻片上。同时进行阴、阳性样品对照试验，5.5.1.237℃5%COz培养箱培养12h~16h后将细胞玻片取出，用PBS(0.01mol/LpH7.4）冲洗3次，冷丙酮固定5min~15min。
5.5.1.3将细胞玻片放人湿盒内，加人用PBS(0.01mol/LpH7.4)1：10稀释的PTV标准阳性血清。5.5.1.4盖好湿盒，置37℃孵育60min。5.5.1.5取出细胞玻片，用PBS(0.01mol/LpH7.4)）冲洗3次，然后加人0.01%伊文斯蓝稀释的FITC标记免抗猪荧光抗体。置37℃孵育30min。5.5.1.6细胞玻片用PBS(0.01mol/LpH7.4)冲洗3次，风干，用0.1mol/LpH8.6的Tris甘油缓冲液封片。
5.5.2判定标准
细胞玻片经处理后，用荧光显微镜检查，阳性对照在细胞浆中和细胞核外周出现特异性黄绿色荧光，阴性对照无荧光，则试验成立。受检样本检出黄绿色荧光，可判为阳性；否则，判为阴性。5.6微量血清中和试验
5.6.1操作步骤
5.6.1.1将血清置56℃水浴中灭活30min。2用细胞培养液将待检血清在96孔平底微量细胞培养板中从1：2开始作倍比稀释，稀释至5.6.1.2
1：64，每个稀释度加4孔，每孔加50μL。同时设阳性血清和阴性血清以及细胞和培养液对照，5.6.1.3用细胞培养液预先将原种病毒稀释成100TCIDsc/50μL工作液，每孔加50μL，振荡混匀。5.6.1.4微量板加盖，37℃孵育1h，剩余病毒（稀释好而未用完的100TCIDso/50μL病毒）同样置37℃孵育1h。
5病毒回归滴定，将剩余病毒作4个10倍系列稀释（10-1～10-\），每稀释度加4孔，每孔加5.6.1.5
50μL。
5每孔加50μL细胞悬液（细胞浓度为5×105/mL）。5.6.1.6
5.6.1.7将微量板振荡摇匀后密封，置37℃二氧化碳培养箱中培养2d～8d。5.6.2结果判定
5.6.2.1用倒置显微镜观察到微量板孔中出现特征性CPE，且病毒回归滴定结果在30TCIDso～300TCIDso之间，标准阳性血清滴度与原测定滴度相差在0.3log10单位以内，阴性对照血清在最低稀释（1：2)时无中和效价，不加病毒的细胞孔正常，则试验成立。5.6.2.2按照Spearman-Karber法计算待检血清中和50%病毒的稀释度，如果对应的血清中和病毒的稀释度在1：8或更高，则判为阳性。5.7酶联免疫吸附试验（ELISA）5.7.1
抗原制备
5.7.1.1用细胞增殖病毒，同时用未接毒的细胞做阴性对照抗原。5.7.1.2
2收毒，反复冻融3次，200g离心15min，取上清液，加50%饱和硫酸铵，4℃沉淀120min。未4
接毒的细胞对照抗原同步提取。SN/T4299-—2015
5.7.1.32000g离心15min，取沉淀用0.01mol/LpH7.4的TEN缓冲液悬浮至原体积的1%。5.7.1.4浓缩的病毒悬液加氟里昂（体积比为3：1)萃取，4℃10min，期间不断摇动。5离心后分为两层，上层中含有病毒抗原，取上层液体过柱（2.5cmX40cm的SephadexG25）5.7.1.5
脱盐。
5.7.1.6将含病毒悬液160000g超速离心3h。5.7.1.7
沉淀用0.01mol/LpH7.4的TEN缓冲液悬浮，最终量为原体积的1/1000。2000g离心10min，分离不溶性蛋白，取上清液作为ELISA试验的抗原。5.7.1.8
操作步骤
用pH7.4的PBS稀释抗原，将稀释好的抗原加人酶标板奇数列孔内，每孔加100μL，4℃包5.7.2.1
被过夜；偶数列用细胞对照抗原按同样方法处理。5.7.2.2用300L洗涤液冲洗微量板5次。5.7.2.3每孔加封闭液200μL，37℃反应1h。5.7.2.4洗板5次。
5.7.2.5待检血清用稀释液作1：20稀释，把稀释好的血清加入已包被阳性和阴性抗原孔各两孔，每孔50μL；同时设立阳性血清、阴性血清对照（见附录C)。置37℃孵育1h。5.7.2.6
洗板5次。
把稀释好的辣根过氧化酶标记的兔抗猪IgG加人各孔，每孔加50μL，置室温反应1h。洗板5次。
每孔加底物溶液100μL，室温避光反应30min。5.7.2.9
每孔加50μL终止液终止反应，以492nm波长测OD值结果判定
每份检测样品的两个抗原孔平均OD值与两个阴性对照孔平均OD值之差即为样品OD值。待检血清平均OD值高于阴性血清对照平均OD值2倍以上者，判为阳性。5
SN/T4299—2015
A.1临床症状
附录A
（资料性附录）
病症资料
急性捷申病毒性脑脊髓炎由于病毒毒力和感染量的不同，其潜伏期范围为4d～28d。发病初期体温升高，可达41℃～42℃，甚至更高。病猪精神较差，厌食，后肢动作失调。随着病情的发展，会出现脑炎症状，如四肢僵硬、眼珠震颤、抽搐甚至出现阵挛性惊厥。受到刺激时会出现角弓反张。在最后临床期，可见到全身麻痹，温度调节中心的麻痹导致高温，呼吸肌麻痹可致动物死于室息。病猪一般在出现症状后3d～4d死亡。个别病例会拖延数月或不死，但常会留下肌肉萎缩和麻痹的后遗症。亚急性捷申病毒性脑脊髓炎症状较温和，发病率和死亡率较低。14日龄内的猪发病较常见且症状严重，极幼龄猪的发病率和死亡率可达100%,3周龄以上猪较少发病。该病发生迅速，消失也迅速。病猪食欲不振，体温略有升高。神经症状通常数日后出现。14日龄内的仔猪表现感觉过敏，共济失调，向后退着走，呈犬坐姿势，最终会出现脑炎症状。2病理学变化
剖检常无肉眼可见病变，仅可见到脑、脑膜充血和水肿。死亡胎儿可见皮下和大肠等肠系膜水肿，巴小出血
胸腔、心包积液，脑膜和肾皮质可见病理组织学变化为在脊髓、脑干和小脑血管周围淋巴细胞浸润，形成血管套，病灶性神经胶质增生，神经元坏死和嗜神经细胞作用引起非化脓性脑脊髓炎。患病后期会出
现神经元变性（肿胀、溶解、坏死、嗜神经现象、轴突变性)，并逐渐转变成星形胶质细胞增生。病毒在消化道及其有关淋巴结内增殖，引起病毒血症。在肺的心叶、尖叶和中间叶有灰色实变区，肺泡及支气管内有渗出液。严重的出现心肌坏死和浆液性纤维素性心包炎病变
A.3流行病学
本病仅见于家猪和野猪，不同年龄和品种的猪均有易感性，幼龄猪比成年猪更易感，成年猪多为隐性感染。其中急性型的发病率为50%，致死率为70%～90%，哺乳仔猪感染后几乎100%死亡。亚急性型的发病率5%左右。全世界范围均有发生病猪和带毒猪为主要传染源，以隐性感染猪为主。病毒可通过粪便排出，污染饲料和饮水，经消化道感染。病毒也可通过飞沫和气溶胶进行传播，猪群经呼吸道、眼结膜、生殖道黏膜感染等多种方式感染。猪群感染PTV后，带毒时间较长，怀孕母猪带毒期为3个月，病毒可通过胎盘感染胎儿。另外，本病可通过人和动物的运输、移动而间接传播。6
附录B
（规范性附录）
溶液配制
B.10.01mol/LpH7.4PBS（磷酸盐缓冲液）氯化钠（NaCI)
氯化钾（KCI)
磷酸氢二钠（NazHPO,·12H,O)
磷酸二氢钾（KH2PO,）
加蒸馏水至
1000mL
SN/T4299—2015
将上述成分依次溶解，分装，121℃高压灭菌15min。室温保存，有效期1个月。B.2
细胞培养液
含10%灭活胎牛血清的1640营养液，加人终浓度为100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素，用5.6%碳酸氢钠（NaHCO）调pH值至7.2。B.3
细胞维持液
含2%～5%灭活胎牛血清的
1640营养液，加入终浓度为100IU/mL青霉素和100ug/mL链霉素，用5.6%碳酸氢钠（NaHCO）调pH值至7.2B.4
细胞消化液（胰酶-EDTA）
氯化钠(NaCI)
氯化钾（KCI)
无水葡萄糖
碳酸氢钠（NaHCO，）
1%酚红
以上各成分依次溶解于500mL双蒸水中，充分溶解后定容至1000mL。过滤除菌，分装后一20℃保存备用。
1%酚红溶液
1mol/L氢氧化钠（NaOH）
双蒸水
定容至100mL免费标准bzxz.net
待酚红充分溶解后，加双蒸水定容。用滤纸过滤，4℃保存备用。
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猪捷申病毒性脑脊髓炎检疫技术规范Quarantine protocol for teschovirus encephalomyelitis2015-09-02发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-04-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4299—2015
本标准参照国际动物卫生组织（OIE《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》（2012版）（ManualofDiagnosticTestsandVaccinesforTerrestrialAnimals，2012)中2.8.10规定的主要诊断技术编制。两者的主要差异如下：
—本标准未采用2.8.10提出的聚合酶链式反应。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国江西出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：张强、熊炜、王巧全、李树清、李健、张志灯、杨春华、王艳、蒋静、林颖、吴绍强、张永宁。
1范围
猪捷申病毒性脑脊髓炎检疫技术规范SN/T4299—2015
本标准规定了猪捷申病毒性脑脊髓炎病毒分离、病毒中和试验、间接免疫荧光试验、血清中和试验和酶联免疫吸附试验的技术规范、本标准适用于猪捷申病毒性脑脊髓炎的诊断及流行病学调查。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和分析方法GB/T18088出人境动物检疫采样
GB19489实验室生物安全通用要求3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
CPE细胞病变
ELISA酶联免疫吸附试验
乙二胺四乙酸
异硫氰酸盐荧光素
IBRS-2
猪肾细胞系
OD值光密度值
PBS磷酸盐缓冲液
猪肾细胞系
猪捷申病毒
猪睾丸细胞系
TCIDso
组织培养半数感染量
Tris三羟甲基氨基甲烷
临床诊断
临床症状
临床症状主要表现为神经性症状，分急性和亚急性，参见附录A中A.1。病理变化
主要病变出现在神经组织，参见A.2。1
SN/T4299—2015
4.3流行病学
不同年龄、品种的家猪和野猪均易感，参见A.3。4.4初步诊断
根据临床症状、病理变化和流行病学可以作出初步判断，进一步确诊应采集样品进行实验室检测。5实验室诊断
5.1设备、材料和试剂
本标准所用水应符合GB/T
6682中二级水的规格。下列试剂除特殊规定外，均指分析纯试剂。PTV标准毒株、标准阳性血清、标准阴性血清。5.1.1
细胞：PK15、IBRS-2、ST细胞系胎牛血清：56℃水浴灭活30min。细胞培养液、细胞维持液、细胞分散液、PBS(0.011mol/LpH7.4)缓冲液、病毒培养液：见附录B。FITC标记的兔抗猪IgG：购买商品化试剂，按说明书稀释。0.01%伊文斯蓝：见附录B
s甘油缓冲液：见附录B。
0.1mol/LpH8.6的Tris
0.01mol/LpH7.4TEN
的缓冲液：见附录B。
辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG。封闭液、底物液、稀释液、终止液：见附录BS
生物安全柜。
倒置显微镜。
荧光显微镜。
37℃恒温培养箱。
二氧化碳培养箱。
微量移液器。
高速冷冻离心机。
超速离心机。
洗板机。
酶标仪。
采样标准
按GB/T18088规定采样。
涉及病原的检测应在二级生物安全实验室进行，样品保存和废弃物处理应按照GB19489要求进行。
5.2.2病料的采集
将发病猪扑杀，无菌采集病猪的脑和脊髓。疑似病例，也可采集粪便样品。不能立即鉴定的样品，需保存于pH7.4磷酸甘油缓冲液（等体积的0.01mol/LpH7.4PBS和甘油）中。2
血样的采集制备
SN/T4299—2015
无菌采集动物血，每头不少于5mL。自然凝固后无菌分离血清，分装，加盖密封，做好标示后冷藏保存。
5.3病毒分离
5.3.1病料处理
5.3.1.1称取1g组织块，切碎，研磨，用PBS(0.01mol/LpH7.4)制成质量分数为10%的悬液；粪便样品取0.1g固体粪便或0.1mL液体粪便，再加人1mLPBS，置于涡旋振荡器混匀。5.3.1.2样品悬液800g转速离心
10min。
U青霉素和100mg链霉素，4℃放置12h。5.3.1.3每毫升上清液加人100IU5.3.1.4上清液用于接种单层细胞培养物，粪便样品上清液做梯度稀释后接种细胞；无菌血清样品可直接接种单层细胞培养物。
2操作步骤
长满单层细胞的25cm2细胞培养瓶弃去生长培养基，在细胞瓶内接人1mL可疑组织上清液；接种的细胞瓶置37℃培养箱感作1h：倒掉接种液，细胞层用无菌PBS洗1次～2次，补充无胎牛血清维持液；置37℃二氧化碳培养箱培养，每天观察CPE，连续观察3d~4d,若无CPE，则收取培养物，反复冻融3次后接种到长满单层的细胞上，盲传3代。出现CPE，收取培养物，一70℃以下保存待鉴定。粪便样品接种24h内出现细胞死亡，可能由于粪便的毒性作用所致。试验同时设未接种样品的细胞
对照。
5.3.3结果判定
5.3.3.1对照细胞正常，接种样品的细胞盲传3代后无CPE，判为阴性2初期出现小病灶，病灶中的细胞圆缩，有折光性。进一步培养，CPE增多，所有细胞脱壁。经5.3.3.2
过连续传代后，病毒生长良好，可在24h～48h后产生完全的CPE。出现上述典型CPE的培养物，可用病毒中和试验或间接免疫荧光试验进一步鉴定血清型。5.3.3.3
5.4病毒中和试验
5.4.1操作步骤
从细胞培养物中收获的分离物用维持液从10-1到10-6作10倍梯度稀释。若鉴定捷申病毒血清型，每个梯度都要有对应的血清型，则需要加12列。50μL1：10稀释的PTV-1～PTV-11型标准阳性血清依次加到1列～11列孔内，50μL标准阴性血清加到最后一列。振荡混匀后混合物置4℃反应过夜或37℃反应1h，随后转人长满单层培养物的微孔板孔内。接种后细胞置37℃二氧化碳培养箱继续培养。72h后开始观察CPE，其后每天1次，根据CPE出现情况，一直观察10d。5.4.2结果判定
如果分离物在PTV-1型标准阳性血清对应列的滴度比阴性血清列低103以上，就可判定该分离病毒属于PTV-1，依此类推。
SN/T4299—2015
5.5间接荧光抗体试验
5.5.1操作步骤
5.5.1.1把可疑分离物接种在长满单层细胞的多孔载玻片上。同时进行阴、阳性样品对照试验，5.5.1.237℃5%COz培养箱培养12h~16h后将细胞玻片取出，用PBS(0.01mol/LpH7.4）冲洗3次，冷丙酮固定5min~15min。
5.5.1.3将细胞玻片放人湿盒内，加人用PBS(0.01mol/LpH7.4)1：10稀释的PTV标准阳性血清。5.5.1.4盖好湿盒，置37℃孵育60min。5.5.1.5取出细胞玻片，用PBS(0.01mol/LpH7.4)）冲洗3次，然后加人0.01%伊文斯蓝稀释的FITC标记免抗猪荧光抗体。置37℃孵育30min。5.5.1.6细胞玻片用PBS(0.01mol/LpH7.4)冲洗3次，风干，用0.1mol/LpH8.6的Tris甘油缓冲液封片。
5.5.2判定标准
细胞玻片经处理后，用荧光显微镜检查，阳性对照在细胞浆中和细胞核外周出现特异性黄绿色荧光，阴性对照无荧光，则试验成立。受检样本检出黄绿色荧光，可判为阳性；否则，判为阴性。5.6微量血清中和试验
5.6.1操作步骤
5.6.1.1将血清置56℃水浴中灭活30min。2用细胞培养液将待检血清在96孔平底微量细胞培养板中从1：2开始作倍比稀释，稀释至5.6.1.2
1：64，每个稀释度加4孔，每孔加50μL。同时设阳性血清和阴性血清以及细胞和培养液对照，5.6.1.3用细胞培养液预先将原种病毒稀释成100TCIDsc/50μL工作液，每孔加50μL，振荡混匀。5.6.1.4微量板加盖，37℃孵育1h，剩余病毒（稀释好而未用完的100TCIDso/50μL病毒）同样置37℃孵育1h。
5病毒回归滴定，将剩余病毒作4个10倍系列稀释（10-1～10-\），每稀释度加4孔，每孔加5.6.1.5
50μL。
5每孔加50μL细胞悬液（细胞浓度为5×105/mL）。5.6.1.6
5.6.1.7将微量板振荡摇匀后密封，置37℃二氧化碳培养箱中培养2d～8d。5.6.2结果判定
5.6.2.1用倒置显微镜观察到微量板孔中出现特征性CPE，且病毒回归滴定结果在30TCIDso～300TCIDso之间，标准阳性血清滴度与原测定滴度相差在0.3log10单位以内，阴性对照血清在最低稀释（1：2)时无中和效价，不加病毒的细胞孔正常，则试验成立。5.6.2.2按照Spearman-Karber法计算待检血清中和50%病毒的稀释度，如果对应的血清中和病毒的稀释度在1：8或更高，则判为阳性。5.7酶联免疫吸附试验（ELISA）5.7.1
抗原制备
5.7.1.1用细胞增殖病毒，同时用未接毒的细胞做阴性对照抗原。5.7.1.2
2收毒，反复冻融3次，200g离心15min，取上清液，加50%饱和硫酸铵，4℃沉淀120min。未4
接毒的细胞对照抗原同步提取。SN/T4299-—2015
5.7.1.32000g离心15min，取沉淀用0.01mol/LpH7.4的TEN缓冲液悬浮至原体积的1%。5.7.1.4浓缩的病毒悬液加氟里昂（体积比为3：1)萃取，4℃10min，期间不断摇动。5离心后分为两层，上层中含有病毒抗原，取上层液体过柱（2.5cmX40cm的SephadexG25）5.7.1.5
脱盐。
5.7.1.6将含病毒悬液160000g超速离心3h。5.7.1.7
沉淀用0.01mol/LpH7.4的TEN缓冲液悬浮，最终量为原体积的1/1000。2000g离心10min，分离不溶性蛋白，取上清液作为ELISA试验的抗原。5.7.1.8
操作步骤
用pH7.4的PBS稀释抗原，将稀释好的抗原加人酶标板奇数列孔内，每孔加100μL，4℃包5.7.2.1
被过夜；偶数列用细胞对照抗原按同样方法处理。5.7.2.2用300L洗涤液冲洗微量板5次。5.7.2.3每孔加封闭液200μL，37℃反应1h。5.7.2.4洗板5次。
5.7.2.5待检血清用稀释液作1：20稀释，把稀释好的血清加入已包被阳性和阴性抗原孔各两孔，每孔50μL；同时设立阳性血清、阴性血清对照（见附录C)。置37℃孵育1h。5.7.2.6
洗板5次。
把稀释好的辣根过氧化酶标记的兔抗猪IgG加人各孔，每孔加50μL，置室温反应1h。洗板5次。
每孔加底物溶液100μL，室温避光反应30min。5.7.2.9
每孔加50μL终止液终止反应，以492nm波长测OD值结果判定
每份检测样品的两个抗原孔平均OD值与两个阴性对照孔平均OD值之差即为样品OD值。待检血清平均OD值高于阴性血清对照平均OD值2倍以上者，判为阳性。5
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A.1临床症状
附录A
（资料性附录）
病症资料
急性捷申病毒性脑脊髓炎由于病毒毒力和感染量的不同，其潜伏期范围为4d～28d。发病初期体温升高，可达41℃～42℃，甚至更高。病猪精神较差，厌食，后肢动作失调。随着病情的发展，会出现脑炎症状，如四肢僵硬、眼珠震颤、抽搐甚至出现阵挛性惊厥。受到刺激时会出现角弓反张。在最后临床期，可见到全身麻痹，温度调节中心的麻痹导致高温，呼吸肌麻痹可致动物死于室息。病猪一般在出现症状后3d～4d死亡。个别病例会拖延数月或不死，但常会留下肌肉萎缩和麻痹的后遗症。亚急性捷申病毒性脑脊髓炎症状较温和，发病率和死亡率较低。14日龄内的猪发病较常见且症状严重，极幼龄猪的发病率和死亡率可达100%,3周龄以上猪较少发病。该病发生迅速，消失也迅速。病猪食欲不振，体温略有升高。神经症状通常数日后出现。14日龄内的仔猪表现感觉过敏，共济失调，向后退着走，呈犬坐姿势，最终会出现脑炎症状。2病理学变化
剖检常无肉眼可见病变，仅可见到脑、脑膜充血和水肿。死亡胎儿可见皮下和大肠等肠系膜水肿，巴小出血
胸腔、心包积液，脑膜和肾皮质可见病理组织学变化为在脊髓、脑干和小脑血管周围淋巴细胞浸润，形成血管套，病灶性神经胶质增生，神经元坏死和嗜神经细胞作用引起非化脓性脑脊髓炎。患病后期会出
现神经元变性（肿胀、溶解、坏死、嗜神经现象、轴突变性)，并逐渐转变成星形胶质细胞增生。病毒在消化道及其有关淋巴结内增殖，引起病毒血症。在肺的心叶、尖叶和中间叶有灰色实变区，肺泡及支气管内有渗出液。严重的出现心肌坏死和浆液性纤维素性心包炎病变
A.3流行病学
本病仅见于家猪和野猪，不同年龄和品种的猪均有易感性，幼龄猪比成年猪更易感，成年猪多为隐性感染。其中急性型的发病率为50%，致死率为70%～90%，哺乳仔猪感染后几乎100%死亡。亚急性型的发病率5%左右。全世界范围均有发生病猪和带毒猪为主要传染源，以隐性感染猪为主。病毒可通过粪便排出，污染饲料和饮水，经消化道感染。病毒也可通过飞沫和气溶胶进行传播，猪群经呼吸道、眼结膜、生殖道黏膜感染等多种方式感染。猪群感染PTV后，带毒时间较长，怀孕母猪带毒期为3个月，病毒可通过胎盘感染胎儿。另外，本病可通过人和动物的运输、移动而间接传播。6
附录B
（规范性附录）
溶液配制
B.10.01mol/LpH7.4PBS（磷酸盐缓冲液）氯化钠（NaCI)
氯化钾（KCI)
磷酸氢二钠（NazHPO,·12H,O)
磷酸二氢钾（KH2PO,）
加蒸馏水至
1000mL
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将上述成分依次溶解，分装，121℃高压灭菌15min。室温保存，有效期1个月。B.2
细胞培养液
含10%灭活胎牛血清的1640营养液，加人终浓度为100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素，用5.6%碳酸氢钠（NaHCO）调pH值至7.2。B.3
细胞维持液
含2%～5%灭活胎牛血清的
1640营养液，加入终浓度为100IU/mL青霉素和100ug/mL链霉素，用5.6%碳酸氢钠（NaHCO）调pH值至7.2B.4
细胞消化液（胰酶-EDTA）
氯化钠(NaCI)
氯化钾（KCI)
无水葡萄糖
碳酸氢钠（NaHCO，）
1%酚红
以上各成分依次溶解于500mL双蒸水中，充分溶解后定容至1000mL。过滤除菌，分装后一20℃保存备用。
1%酚红溶液
1mol/L氢氧化钠（NaOH）
双蒸水
定容至100mL免费标准bzxz.net
待酚红充分溶解后，加双蒸水定容。用滤纸过滤，4℃保存备用。
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