SN/T4299—2015 猪捷申病毒性脑脊髓炎检疫技术规范 Quarantine protocol for teschovirus encephalomyelitis 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 2015-09-02发布 2016-04-01实施 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准参照国际动物卫生组织（OIE）《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》（2012版）（Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 2012）中2.8.10规定的主要诊断技术编制。两者的主要差异如下： —本标准未采用2.8.10提出的聚合酶链式反应。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国江西出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：张强、熊炜、王巧全、李树清、李健、张志灯、杨春华、王艳、蒋静、林颖、吴绍强、张永宁。 1 范围 本标准规定了猪捷申病毒性脑脊髓炎病毒分离、病毒中和试验、间接免疫荧光试验、血清中和试验和酶联免疫吸附试验的技术规范。本标准适用于猪捷申病毒性脑脊髓炎的诊断及流行病学调查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和分析方法 GB/T 18088 出入境动物检疫采样 GB 19489 实验室生物安全通用要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CPE 细胞病变 ELISA 酶联免疫吸附试验 EDTA 乙二胺四乙酸 FITC 异硫氰酸盐荧光素 IBRS-2 猪肾细胞系 OD值 光密度值 PBS 磷酸盐缓冲液 PK15 猪肾细胞系 PTV 猪捷申病毒 ST 猪睾丸细胞系 TCID50 组织培养半数感染量 Tris 三羟甲基氨基甲烷 4 临床诊断 4.1 临床症状 临床症状主要表现为神经性症状，分急性和亚急性，参见附录A中A.1。 4.2 病理变化 主要病变出现在神经组织，参见A.2。 4.3 流行病学 不同年龄、品种的家猪和野猪均易感，参见A.3。 4.4 初步诊断 根据临床症状、病理变化和流行病学可以作出初步判断，进一步确诊应采集样品进行实验室检测。 5 实验室诊断 5.1 设备、材料和试剂 本标准所用水应符合GB/T 6682中二级水的规格。下列试剂除特殊规定外，均指分析纯试剂。 5.1.1 PTV标准毒株 5.1.2 标准阳性血清 5.1.3 标准阴性血清 5.1.4 细胞：PK15、IBRS-2、ST细胞系 5.1.5 胎牛血清：56℃水浴灭活30min 5.1.6 细胞培养液、细胞维持液、细胞分散液、PBS (0.01mol/L, pH 7.4) 缓冲液、病毒培养液：见附录B 5.1.7 FITC标记的兔抗猪IgG：购买商品化试剂，按说明书稀释 5.1.8 0.01%伊文斯蓝：见附录B 5.1.9 甘油缓冲液：见附录B 5.1.10 0.1mol/L, pH 8.6的Tris缓冲液 5.1.11 0.01mol/L, pH 7.4的TEN缓冲液：见附录B 5.1.12 辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG 5.1.13 封闭液、底物液、稀释液、终止液：见附录B 5.1.14 生物安全柜 5.1.15 倒置显微镜 5.1.16 荧光显微镜 5.1.17 37℃恒温培养箱 5.1.18 二氧化碳培养箱 5.1.19 微量移液器 5.1.20 高速冷冻离心机 超速离心机 洗板机 酶标仪 5.2 采样 5.2.1 采样标准 按GB/T 18088规定采样。涉及病原的检测应在二级生物安全实验室进行，样品保存和废弃物处理应按照GB 19489要求进行。 5.2.2 病料的采集 将发病猪扑杀，无菌采集病猪的脑和脊髓。疑似病例，也可采集粪便样品。不能立即鉴定的样品，需保存于pH 7.4磷酸甘油缓冲液（等体积的0.01mol/L pH 7.4 PBS和甘油）中。 5.2.3 血样的采集制备 无菌采集动物血，每头不少于5mL。自然凝固后无菌分离血清，分装，加盖密封，做好标示后冷藏保存。 5.3 病毒分离 5.3.1