中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4322—2015 食品接触材料 高分子材料 双酚A残留量的测定 酶联免疫法 Food contact material Polymer materials Determination of bisphenol A residue - Enzyme linked immunosorbent assay 2015-09-02 发布 2016-04-01 实施 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、上海近岸科技有限公司。 本标准主要起草人：杨捷琳、缪文彬、冉晓园、朱化星、王敏、蒋伟、何宇平、潘良文、朱洪坤、吕蓉、陈相、陶海华。 1 范围 食品接触材料 高分子材料 双酚A残留量的测定 酶联免疫法 本标准规定了高分子材料中双酚A残留量的酶联免疫测定方法。本标准适用于高分子材料中双酚A残留量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 方法提要 试样中残留的双酚A与试剂盒中的双酚A竞争性结合已包被在板上的双酚A特异性抗体。再与随后加入的酶标二抗，形成抗原-一抗-二抗复合物。复合物与显色剂发生反应，用酶标仪测定吸光度值。吸光度值与试样中双酚A残留量呈负相关。 4 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均采用分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T 6682中一级水的规格。 4.1 双酚A标准物质（Bisphenol A，CAS号：80-05-7）：纯度≥99%。 4.2 甲醇。 4.3 1×样品提取液：试剂盒中提供8×样品提取液，使用前按照1:7（8×样品提取液：水）稀释，样品提取液主要成分为磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution）。 4.4 双酚A抗试剂（一抗）。 4.5 双酚A酶标物（二抗）。 4.6 洗涤液（1×）：试剂盒中提供10×浓缩洗涤液，使用前按照1:9（10×浓缩洗涤液：水）稀释。 4.7 底物液A液。 4.8 底物液B液。 4.9 终止液。 4.10 双酚A标准工作溶液：可使用试剂盒中提供的标准工作溶液，浓度为0、0.3、1、3、10、30、100 ng/mL，也可以自行配制标准工作溶液。标准工作溶液配制方法如下：准确称取50.0 mg双酚A标准物质（4.1）于100 mL容量瓶中，加入少量甲醇（4.2）溶解后，用甲醇定容至刻度，浓度为50 mg/mL，然后根据需要的标准溶液工作浓度进行稀释。 4.11 双酚A酶联免疫吸附测定试剂盒（参见附录A）。 5 仪器和设备 5.1 酶标仪：波长450 nm。 5.2 天平：感量为0.1 mg。 5.3 均质器。 5.4 旋涡振荡器。 5.5 离心机：转速不低于4000 r/min。 5.6 注射过滤器：2 mL，并带有孔径为0.45 μm的水相针头式过滤膜。 5.7 微量单道/多道移液器：10 μL～300 μL。 6 测定方法 6.1 试样提取 将塑料制品切割或剪成长1 cm、宽2 mm的小段。称取（0.5±0.01）g塑料制品至玻璃管中，加入1×样品提取液（4.3）10 mL，于70~80℃超声提取60 min；取适量的样品上清液用注射过滤器过滤。吸取300 μL滤液，冷却至室温后用于酶联免疫分析。 6.2 酶联免疫测定 试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温（20℃～24℃）后方可使用。将测定所需的微孔条插入微孔架上，记录标准工作溶液与样液等在微孔架上的位置。分别加入50 μL的标准工作溶液（4.10）和100 μL样液于对应的孔中；在每孔中加入双酚A抗试剂（4.4），轻轻摇动微孔板以圆周运动方式混匀；室温（20℃～25℃）孵育30 min；洗板3次，每次加入250 μL 1×洗液，最后一次尽量吸干；每孔加入150 μL 1×二抗（4.5）；室温（20℃～25℃）孵育80 min；洗板3次，每次加入250 μL 1×洗液，最后一次尽量吸干；加入50 μL的底物A溶液（4.7）和50 μL的底物B溶液（4.8），室温避光显色15 min；加入100 μL的终止液（4.9）终止反应，10 min内用波长450 nm的酶标仪测定吸光度值。 6.3 平行试验 按以上步骤，对同一标准溶液、同一样品溶液均应进行平行试验测定。 6.4 空白试验 除不加试样外，均按上述测定步骤进行。 6.5 监控试验 每次测定均应做一