SN/T 4338-2015.Rules of potato leaf roll virus elimination by thermotherapy.
1范围
SN/T 4338规定了热处理脱除马铃薯卷叶病毒的程序及再生苗的病毒检测方法。
SN/T 4338适用于对感染马铃薯卷叶病毒的马铃薯块茎、组培苗进行热处理。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 2627-2010马铃薯 卷叶病毒检疫鉴定方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1热处理thermotherapy
将植物置于热水或热空气中(温度高于植物正常的生长温度)一段时间,剥取新梢或茎尖进行培养，得到新的再生植株，以达到脱除病毒目的的方法。
3.2脱毒苗virus-free seedlings
经过脱毒处理过程且病毒检测结果为阴性的再生苗。
4原理
植物培养在高于正常生长的温度条件下，体内的病毒活性被钝化,病毒在植物体内增殖减缓或停止。热处理一段时候后,切取植物新梢或茎尖,因热处理增大了新梢或茎尖的无毒区域,因此取下这部分进行培养,可得到无毒的再生植株。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4338—2015
热处理脱除马铃薯卷叶病毒技术规程Rules of potato leaf roll virus elimination by thermotherapy2015-09-02发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
刮涂层查真伪
2016-04-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准负责起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准起草人：王仁睿、李明福、牟海青、李桂芬、马洁。SN/T4338—2015
1范围
热处理脱除马铃薯卷叶病毒技术规程本标准规定了热处理脱除马铃薯卷叶病毒的程序及再生苗的病毒检测方法。本标准适用于对感染马铃薯卷叶病毒的马铃薯块茎、组培苗进行热处理。2规范性引用文件
SN/T4338—2015
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件，SN/T2627—2010马铃薯卷叶病毒检疫鉴定方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
热处理
thermotherapy
于植物正常的生长温度）一
将植物置于热水或热空气中（温度高段时间，剥取新梢或茎尖进行培养，得到新的再生植株，以达到脱除病毒目的的方法3.2
virus-free seedlings
脱毒苗
经过脱毒处理过程且病毒检测结果为阴性的再生苗。4原理
植物培养在高于正常生长的温度条件下，体内的病毒活性被钝化，病毒在植物体内增殖减缓或停止。热处理一段时候后，切取植物新梢或茎尖，因热处理增大了新梢或茎尖的无毒区域，因此取下这部分进行培养，可得到无毒的再生植株。仪器、用具和试剂
5.1仪器
恒温恒湿箱/植物光照培养箱、超净工作台/生物安全柜、天平（感量1/10000g）、解剖镜、高压灭菌锅、酶标仪、PCR仪、电泳仪、电泳槽、恒温水浴锅、电镜。5.2用具
量筒、容量瓶、三角瓶、pH计/pH试纸、镊子、剪刀、接种针、酶联板、微量移液器（20μL，100uL，200μL1000uL，5000μL）、研钵。1
SN/T4338—2015
5.3试剂
5.3.1组织培养
MS培养基粉末或MS母液、琼脂、GA、KT。5.3.2DAS-ELISA
马铃薯卷叶酶联试剂盒、包被缓冲液（coatingbuffer，2.93g碳酸氢钠、1.59g碳酸钠、0.2g叠氮化钠分别溶于1000mL蒸馏水，调pH值到9.6）、洗涤液（PBSTBuffer，1.15g无水碳酸氢二钠、0.2g氯化钾、0.2g无水碳酸二氢钾、8.0g氯化钠、0.5g吐温-20，分别溶于1000mL蒸馏水，调pH值到7.4）、样品抽提液（GEBbuffer，1.3g无水硫酸钠、20.0g聚乙烯比咯烷酮、0.2g叠氮化钠、2.0gⅡ级鸡蛋清白蛋白粉、20g吐温-20，分别溶于1000mL蒸馏水，调pH值到7.4）、酶标抗体稀释缓冲液（ECIBuffer，0.2g牛血清白蛋白或脱脂奶粉、2.0g聚乙烯比咯烷酮、0.02g叠氮化钠，分别溶于1000mL蒸馏水，调pH值到7.4)底物缓冲液（PNPBuffer，0.01g氯化镁、0.02g叠氮化钠、9.7mL二乙醇胺分别溶于100mL蒸馏水，调pH值到9.8）、底物溶液（PNPsubstate，5mg对硝基苯磷酸盐溶于5mL底物缓冲液）、终止液（12g氢氧化钠溶于100mL蒸馏水）。5.3.3RT-PCR
莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶（MMLV，100U/μL）、1×TAE缓冲液（40mmol/LTris-HCl、20mmol/L乙酸钠、2mmol/LEDTA，冰乙酸调pH至8.0）、5×RT缓冲液（50mmol/LTris-HClpH7.5，100mmol/L氯化钠，0.1mmol/LEDTA，10mmol/LDTT，0.01%NP-40，50%甘油）、10×PCR缓冲液（100mmol/LTris-HClpH8.3,500mmol/L氯化钾）、25mmol/L氯化镁、RNA酶抑制剂（10U/μL）、RT增强剂、无水乙醇、RL裂解液、去蛋白液、Taq酶（2.5U/μL）、dNTPMixture（10mmol/L）、漂洗液、双蒸水、2-硫基乙醇、液氮、引物：上游引物（P1）碱基序列：52-AGGCGCGCTAACAGAGTTCA-3’，下游引物（P2）碱基序列：5-CTTGAATGCCGGACAGTCTG-3，用双蒸水稀释至20μmol/L。
6热处理脱除马铃薯卷叶病毒的操作流程6.1种薯
将带有马铃薯卷叶病毒的种薯打破休眠，放进恒温恒湿箱/植物光照培养箱中，温度调为40℃（4h）)/20℃（16h），黑暗状态，相对湿度调为75%，处理时间为8周，将处理完的种薯种植到温室里，温度为23士2℃，待苗长出4周～6周后开始进行病毒检测（见附录A）。6.2组培苗
将带有马铃薯卷叶病毒的组培苗放进恒温恒湿箱/植物光照培养箱中，温度调为30℃～35℃（8h黑暗）、37℃～40℃（16h光照），相对湿度调为75%～85%，处理时间为4周，处理完的组培苗剥取0.2mm~0.5mm长的茎尖（分生组织带1~2片叶原基），茎尖培养在MS+GA31.0mg/L+KT0.1mg/L，使其萌发，再生苗培养在MS上，继代周期是3周，继代两次后开始进行病毒检测（见附录A）。
7再生苗的病毒检测
7.1免疫学检验（DAS-ELISA）
SN/T4338—2015
再生苗的第一次病毒检测采用免疫学检验法，即DAS-ELISA。热处理后的种薯播种到温室，温室温度为23℃士2℃。苗长出4周～6周后开始进行。热处理后的组培苗继代两次（6周）后开始进行。具体操作步骤参考SN/T2627一2010附录A执行。在阴性对照OD值≤0.1，且阳性对照OD值大于阴性对照OD值2倍的前提下，样品孔OD值大于阴性对照OD值2倍时，判定为阳性反应，结果呈阳性的再生苗判定为带毒材料，予以销毁或再行脱毒处理；否则判定为阴性反应，结果呈阴性的再生苗标记好，继续培养，用以分子生物学检测。7.2
分子生物学检测（RT-PCR）
再生苗的第二次病毒检测采用分子生物学检验。种薯继续生长4周后进行RT-PCR检测，组培苗继续继代两至三次（6周～9周)后进行RT-PCR检测。具体操作步骤按SN/T2627一2010附录B执行。在阴性对照无扩增条带，且阳性对照出现222bp目标条带的前提下，样品RT-PCR产物电泳结果在222bp处出现目标条带，判定为阳性反应，结果呈阳性的再生苗判定为带毒材料，予以销毁或再行脱毒处理：否则判定为阴性反应，结果皇阴性的再生苗判定为脱毒苗，予以要当标记和保存8综合判定
经DAS-ELISA和RT-PCR检测均为阴性的再生苗判定为脱毒苗，予以妥当标记和保存，否则判定为非脱毒苗。
SN/T4338—2015
附录A
（规范性附录）
热处理脱除马铃薯卷叶病毒流程图感染马铃薯卷叶病毒的种薯
打破休眠
热处理：40℃（4h）/20免费标准bzxz.net
(16h），黑暗状态
种植到温室(23℃±2℃)
DAS-ELISA检测
阳性销毁或再进行
脱毒处理
阴性继续种植
RT-PCR检测
阳性销毁或再进行
脱毒处理
阴性保留，紫殖
感染马铃薯卷叶病毒的组培苗
35℃(8h黑暗）、37℃~40℃
热处理：30℃
（16h光照），
相对湿度调为75%~85%
剥取0.2mm~0.5mm长度的茎尖（分生组织带12片叶原基)进行培养
再生苗进行继代
继代两次(6周）
DAS-ELISA检测
阳性销毁或再进行
脱毒处理
阴性继代
继代两至三次(6周～9周）
RT-PCR检测
阳性销毁或再进行
脱毒处理
阴性保留，繁殖
热处理脱除马铃薯卷叶病毒流程图图A.1
参考文献
SN/T4338—2015
[1]A.Hamid and S.B.Locke,Heat inactivation of leafroll virus in potato tuber tissues.AmericanPotatoJournal.1961,38(9)：304-310.[2]C.N.Paet and A.B.Zamora,Efficancy of thermotherapy and group culture of isolated potatomeristems for the elimination of single and mixed infections of potato virus Y,potato virus S and po-tatoleaf rollvirus.PhilippJournal CropScience.1990,15(2):113-118.
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