SN/T4344—2015 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 杏褪绿卷叶植原体检疫鉴定方法 Detection and identification of Apricot chlorotic leaf roll phytoplasma 前言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。 本标准起草人：黄新、侯立华、郭欣硕、牟海青、赵文军、张琪、张琰、朱水芳、王有福。 1 范围 本标准规定了杏褪绿卷叶植原体的检疫和鉴定方法。本标准适用于进出境杏、桃及李子苗木中杏褪绿卷叶植原体的检疫和鉴定。 2 杏褪绿卷叶植原体基本信息 学名：Candidatus Phytoplasma prunorum 异名：Apricot chlorotic leaf roll phytoplasma; European stone fruit yellow sphytoplasma; Apricot chlorotic leaf roll virus; Peach chlorotic leaf roll virus 分类地位：软壁菌门，柔膜菌纲，无胆留原体目，无胆留原体科，植原体候选属，16SrX-B植原体组。 传播途径：田间近距离扩散以媒介叶蝉（Fieberiella flori)和嫁接传播为主，远距离以无症带菌苗木传播为主。 杏褪绿卷叶植原体的其他信息参见附录A。 3 方法原理 杏褪绿卷叶植原体的生物学特性和基因序列等分子生物学信息是该检疫鉴定方法的依据。DAPI荧光染色法和透射电子显微镜法在本标准中作为一种初步筛选植原体的方法；PCR技术与RFLP技术结合作为鉴定杏褪绿卷叶植原体的准确方法。 4 仪器设备和主要试剂 4.1 仪器设备 PCR仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、涡旋震荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统、透射电子显微镜、荧光显微镜。 4.2 主要试剂 植原体细胞富集缓冲液（100mL）：无水磷酸氢二钾1.67g，磷酸二氢钾0.41g，蔗糖10g，牛血清白蛋白0.15g，聚乙烯吡咯烷酮2g，维生素C0.53g，用5mol/L的KOH调节pH值至7.6。 DNA提取缓冲液：2%十六烷基三甲基溴化铵（50℃左右溶解），1.4mol/L氯化钠，20mmol/L乙二胺四乙酸，100mmol/LTris-HCl(pH8.0)。 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。 5 杏褪绿卷叶植原体检疫鉴定方法 5.1 症状检查 仔细观察寄主植物种苗、叶片等，感病植株典型症状是卷叶，叶片沿着从叶柄到叶尖的直线卷曲，叶片脉间失绿，不规则或形成圆锥形或多角形轮廓。症状描述参见附录A。 5.2 DAPI染色 选取幼嫩组织（叶脉、侧芽），切片，用1μg/mL DAPI溶液（4,6-二基-2-苯基吲哚）染色，在460nm激发条件，荧光显微镜观察，在韧皮部筛管部位有明显的蓝色荧光信号表明有植原体存在。因植株内植原体分布不均，故每样品需选取不同部位的幼嫩材料进行检测。 5.3 通用引物PCR凝胶电泳及RFLP检测 按附录B提取DNA。通用引物PCR凝胶电泳及RFLP检测见附录C。 5.4 特异性引物PCR凝胶电泳检测 特异性引物PCR凝胶电泳检测见附录D。 5.5 植原体形态观察 对采集的植物样品制备超薄切片，通过透射电镜观察植原体形态方法（见附录E）。 6 结果判定 6.1 表现症状与附录A.2描述一致，并且DAPI染色观察结果显示蓝色荧光或者电镜超薄切片在韧皮部筛管细胞中存在大量植原体，可初步判定为植原体。 6.2 在5.3检测中，若PCR产物凝胶电泳检测结果为阳性，而且RFLP分析片段大小与描述相符，可判定该样品携带16SrX组的植原体。 6.3 在5.4检测中，若通过ECA-F、ECA-+R引物PCR扩增产物经凝胶电泳检测结果为阳性，在237bp处检测到特异性扩增条带，可判定该样品携带杏褪绿卷叶植原体。 7 样品保存 7.1 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出杏褪绿卷叶植原体的样品应保存于-20℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。 7.2 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片。 7.3 复核 由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责。主要考察实验记录、照片等资料。