SN/T 4344-2015.Detection and identification of A pricot chlorotic leafroll phytoplasma.
1范围
SN/T 4344规定了杏褪绿卷叶植原体的检疫和鉴定方法。
SN/T 4344适用于进出境杏、桃及李子苗木中杏褪绿卷叶植原体的检疫和鉴定。
2杏褪绿卷叶植原体基本信息
学名:Candidatus Phytoplasma prunorum
异名:Apricot chlorotic leafroll phytoplasma; European stone fruit yellows phytoplasma; Apricot chlorotic leaf roll virus ; Peach chlorotic leaf roll virus
分类地位:软壁菌门,柔膜菌纲,无胆甾原体目,无胆甾原体科,植原体候选属,16SrX-B植原体组。
传播途径:田间近距离扩散以媒介叶蝉(Fieberiellaflori)和嫁接传播为主，远距离以无症带菌苗木传播为主。
杏褪绿卷叶植原体的其他信息参见附录A。
3方法原理
杏褪绿卷叶植原体的生物学特性和基因序列等分子生物学信息是该检疫鉴定方法的依据,DAPI荧光染色法和透射电子显微镜法在本标准中作为一种初步筛选植原体的方法;PCR技术与RFLP技术结合作为鉴定杏褪绿卷叶植原体的准确方法。
4仪器设备和主要试剂
4.1 仪器设备
PCR仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、涡旋震荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统、透射电子显微镜、荧光显微镜。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4344—2015
杏褪绿卷叶植原体检疫鉴定方法Detection and identification of Apricotchloroticleafrollphytoplasma2015-09-02发布
中华人民共和国
利涂层查真伪
国家质量监督检验检疫总局
2016-04-01实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4344—2015
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准起草人：黄新、侯立华、郭欣硕、牟海青、赵文军、张琪、张琰、朱水芳、王有福。1范围
否褪绿卷叶植原体检疫鉴定方法本标准规定了杏褪绿卷叶植原体的检疫和鉴定方法本标准适用于进出境否、桃及李子苗木中否褪绿卷叶植原体的检疫和鉴定。2杏褪绿卷叶植原体基本信息
学名：CandidatusPhytoplasmaprunorumSN/T4344—2015
异名：Apricotchloroticleafrollphytoplasma;Europeanstonefruityellowsphytoplasma;Apricotchloroticleaf rollvirus;Peachchloroticleaf rollvirus分类地位：软壁菌门，柔膜菌纲，无胆留原体目，无胆留原体科，植原体候选属，16SrX-B植原体组。传播途径：田间近距离扩散以媒介叶蝉（Fieberiellaflori)和嫁接传播为主，远距离以无症带菌苗木传播为主。
杏褪绿卷叶植原体的其他信息参见附录A。3方法原理
杏褪绿卷叶植原体的生物学特性和基因序列等分子生物学信息是该检疫鉴定方法的依据，DAPI荧光染色法和透射电子显微镜法在本标准中作为一种初步筛选植原体的方法；PCR技术与RFLP技术结合作为鉴定否褪绿卷叶植原体的准确方法。4仪器设备和主要试剂
4.1仪器设备
PCR仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、涡旋震荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统、透射电子显微镜、荧光显微镜4.2主要试剂
植原体细胞富集缓冲液（100mL）：无水磷酸氢二钾1.67g，磷酸二氢钾0.41g，蔗糖10g，牛血清白蛋白0.15g，聚乙烯吡咯烷酮2g，维生素C0.53g，用5mol/L的KOH调节pH值至7.6。DNA提取缓冲液：2%十六烷基三甲基溴化铵（50℃左右溶解），1.4mol/L氯化钠，20mmol/L乙二胺四乙酸，100mmol/LTris-HCl(pH8.0)。除另有规定外，所有试剂均为分析纯，5病菌的鉴定
5.1症状检查
仔细观察寄主植物种苗、叶片等，感病植株典型症状是卷叶，叶片沿着从叶柄到叶尖的直线卷曲，叶1
SN/T4344—2015
片脉间失绿，不规则或形成圆锥形或多角形轮廓。症状描述参见附录A。5.2DAPI染色
选取幼嫩组织（叶脉、侧芽），切片，用1μg/mLDAPI溶液（4，6-二基-2-苯基吲哚）染色，在460nm激发条件，荧光显微镜观察，在韧皮部筛管部位有明显的蓝色荧光信号表明有植原体存在。因植株内植原体分布不均，故每样品需选取不同部位的幼嫩材料进行检测。5.3通用引物PCR凝胶电泳及RFLP检测按附录B提取DNA。
通用引物PCR凝胶电泳及RFLP检测见附录C。5.4特异性引物PCR凝胶电泳检测特异性引物PCR凝胶电泳检测见附录D。5.5植原体形态观察
对采集的植物样品制备超薄切片，通过透射电镜观察植原体形态方法（见附录E）。6结果判定
6.1表现症状与A.2描述一致，并且DAPI染色观察结果显示蓝色荧光或者电镜超薄切片在韧皮部筛管细胞中存在大量植原体，可初步判定为植原体6.2在5.3检测中，若PCR产物凝胶电泳检测结果为阳性，而且RFLP分析片段大小与描述相符，可判定该样品携带16SrX组的植原体
6.3在5.4检测中，若通过ECA-F、ECA-+R引物PCR扩增产物经凝胶电泳检测结果为阳性，在237bp处检测到特异性扩增条带，可判定该样品携带杏褪绿卷叶植原体。7
样品保存
7.1样品保存与处理
样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出杏褪绿卷叶植原体的样品应保存于一20℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。7.2结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片。7.3复核bZxz.net
由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责。主要考察实验记录、照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验。2
A.1形态特征
附录A
（资料性附录）
杏褪绿卷叶植原体其他相关信息形态为杆状或者球形颗粒，是在大小和形态上可变的多形性结构。A.2
2症状特征
感病植株典型症状是卷叶，叶片沿SN/T4344—2015
十柄到叶尖的直线卷曲，叶片脉间失绿，不规则或形成圆锥形或多角形轮廊。该病原物也能侵染李树，症状与感病杏树相似但不典型，叶片小、红色，形成圆柱状卷曲。
A.3寄主范围
寄主主要是杏、桃和李子，此外，也能寄生在一些杂草如田旋花和狗牙根自然寄主上。A.4分布
除了在南非未经证实外，杏褪绿卷叶植原体在欧洲被发现。法国（杏栽培地区普遍存在）、德国、希腊、意大利、匈牙利、罗马尼亚、西班牙、瑞士等均有分布。
SN/T4344—2015
植原体细胞的富集
附录B
（规范性附录）
植原体DNA的提取
称取新鲜样品叶中脉1.5g，加人7mL～8mL新制备的提取缓冲液，50mg的石英砂，于研钵中研磨。冰上放置10min～15min，加入5mL相同的缓冲液并摇晃均匀；将悬浊液转移至15mL离心管，5000r/min，使用预冷的离心转头（BeckmanJA20)4℃离心5min，将上清液移至另一个离心管中，19000r/min离心20min，干燥沉淀并用60℃预热的2mL2%CTAB溶液，重悬沉淀；60℃水浴中温浴10min～20min，将1mL的溶液转至干净的2mL的微管中，用于接下来的DNA提取。B.2
2DNA提取
将1mL植原体细胞富集液转移至2mL离心管。加人1mLDNA提取缓冲液；将离心管置于65℃水浴中温浴1h1.5h，每隔20min左右将离心管颠倒混匀；2000r/min，4℃离心2min；将离心后的上清液转移至一个新的离心管中，加人三氯甲烷/异戊醇（24/1)1mL，混匀，形成乳浊液；将乳浊液在13000r/min，4℃离心5min；将上清液转入新管，加人RNase2μL，37℃温浴30min；加人三氯甲烷/异戊醇（24/1)1mL，13000r/min，4℃离心5min；上清液转人新管，加人800μL预冷的异丙醇，13000r/min，4℃离心10min；弃上清液，加人500μL的70%的乙醇，在13000r/min，4℃离心5min；弃掉上清液，干燥沉淀，加人100μL的灭菌蒸馏水溶解。其他的DNA提取方法也可以借鉴，也可以选择使用商业DNA提取试剂盒，提取的DNA在一80℃的条件下可以冻存一年。
引物序列
附录C
（规范性附录）
通用引物PCR扩增以及RFLP分析
SN/T4344—2015
植原体通用引物:P1：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGA-3，P7：5'-CGTCCTTCATCGGCT CTT-3
PCR反应体系及参数
PCR反应体系
见表c.1。
PCR反应体系
试剂名称
10×PCR反应缓冲液
正向引物
反向引物
TaqDNA聚合酶
DNA模板
补H,0至
注：DNA模板的取量应根据DNA的提取浓度、纯度而调节C.2.2
阴性对照、阳性对照和空白对照的设置C.2.2.1
阴性对照：以健康的杏叶片DNA为模板。C.2.2.2
终浓度
2.5mmol/L
0.2mmol/L
阳性对照：以携带有杏褪绿卷叶植原体16SrDNA序列的DNA为模板，空白对照：设两个，一是提取DNA时设置的提取空白对照（以HO代替样品），二是PCR反应的空白对照（以H2O代替DNA模板）。c.2.3
PCR的反应参数
P1/P7：94℃/5min；94℃/30s，55℃/30s，72℃/1min，40个循环；72℃/10min。注：不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。C.3
琼脂糖凝胶电泳
制备1%的琼脂糖凝胶，以DNAMarker作为分子量标记，进行电泳分析，电泳结束后在凝胶成像SN/T4344—2015
仪观察并记录结果，分子大小1767bp左右。C.4
RFLP分析
所用限制性内切酶为AluI，反应体系：总体系20μL；1×缓冲液，2UAluI，10μL的PCR产物。置于37℃温育至少4h，电泳同c.3。C.5
结果判断
对X组GeneBank序列用AluI分析，其共有序列为476bp、229bp、189bp和91bp。可判定该样品携带杏褪绿卷叶植原体或16SX组的成员。S
特异性引物序列
附录D
（规范性附录）
特异性引物PCR凝胶电泳检测
SN/T4344—2015
ECA-F:5'-AAT AAT CAA GAA CAA GAA GT,ECA-R:5'-GTT TAT AAA AAT TAATGACTC。
PCR反应体系
同c.2.1。
PCR的反应参数
ECA-F/ECA-R：94℃/5min94℃/30s.53℃/40s，72℃/30min，40个循环；72℃/10min。注：不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。D.4
琼脂糖凝胶电泳
同c.3。
结果判定
琼脂糖凝胶电泳出现237bp的特异性扩增片段，可以判定所测样品携带杏褪绿卷叶植原体。7
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