中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4399—2015 国境口岸伯氏疏螺旋体实时荧光PCR检测方法 Detection with real-time PCR for Borrelia burgdorferi at frontier port 发布日期：2015-12-04 实施日期：2016-07-01 前言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、军事医学科学院微生物流行病学研究所。 本标准主要起草人：瀚文东、杨德文、王艳梅、孙毅、程成、徐宁、付维明、丁淑丽、包力。 1 范围 本标准规定了国境口岸伯氏疏螺旋体（三种常见基因型 B. garinii, B. b. s. s. 和 B. afzeli）的检验对象、方法、生物安全要求及结果判定。本标准适用于国境口岸伯氏疏螺旋体的实时荧光PCR检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 SN/T 1312 国境口岸森林脑炎监测规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件： 3.1 伯氏疏螺旋体 (Borrelia burgdorferi)：细胞外寄生、微嗜氧型的螺旋体，经蜱传播，是引起人体莱姆病 (Lyme disease) 的病原体，引起的临床症状多样，除慢性游走性红斑和关节炎外，还常伴有心脏损害和神经系统受累等症状。 4 检测对象 4.1 疑似感染伯氏疏螺旋体的临床样本，如血液及其他组织样本。 4.2 从出入境交通工具、集装箱及口岸地区等场所采集的游离蜱及从上述场所宿主动物体表采集的寄生蜱。 4.3 出入境交通工具、集装箱及口岸地区等场所的宿主动物。 5 生物安全和分子生物学检测防污染要求 5.1 检测工作中的个人防护按照 GB 19489 的规定执行。 5.2 实验室应遵循 GB 19489 对生物安全2级实验室 (BSL-2) 的生物安全要求。 5.3 使用过的实验用品应按照 GB 19489 对废弃物的处理要求进行无害化处理。 6 仪器和试剂 6.1 仪器和器材 本方法使用主要仪器和设备如下： 实时荧光定量 PCR 仪及配套 PCR 反应管； 生物安全柜； 高速台式离心机（最高离心力 12000g 以上）； 台式离心机（最高离心力 2000g 以上）； 漩涡振荡器； 恒温水浴锅； 高压灭菌锅； 低温冷藏、冷冻冰箱； 微量可调移液器（10μL, 100μL, 200μL, 1000μL）及配套带滤芯吸头；Eppendorf 管。 6.2 主要试剂 除另有规定外，所有化学试剂均采用分析纯。实验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。 溶菌酶 (20g/L)、蛋白酶 K (10g/L)、RNA 酶 (10g/L)、150μL 酚、三氯甲烷、异戊醇混匀液。 PCR 反应液：ABI 公司的 PCRMIX!，品名为 Taqman Universal Master Mix I, with UNG 1-pack。 荧光 PCR 引物、探针：应为色谱纯。阳性菌株或质粒：与相应 PCR 引物、探针匹配。 用于荧光 PCR 检测的伯氏疏螺旋体通用引物和探针序列如下： Reverse primer: 5'-AGCCTTAATAGCATGC/TAAGCAAAATG-3' Forward primer: 5'-CTAGTGTTTTGCCATCTTCTTTGAAAA-3' Probe: 5'-GCGCTGTTTTTTTCATCAAGGCTGCTAAC-3'-TAMRA 7 检测程序 7.1 样本的采集 7.1.1 血液样本：无菌方法采集血液，EDTA 抗凝后无菌试管 4℃ 保存，立即送检。 7.1.2 人体组织样本：人体组织样本，如典型红斑或溃疡斑组织切片、关节液、脑脊液等可作为病原学检测样本，无菌保存后立即送检。 7.1.3 蜱及宿主动物样本：蜱及宿主动物采集后首先进行分类鉴定，按照 SN/T 1312 进行。 7.2 样本的运送与保存 样本运输采用冰壶加冰或泡沫盒加冰密封运输。对于不立即检测的样本，可保存于 -20℃ 待检。 7.3 样本的前处理 7.3.1 血液样本：无需处理。