SN/T 4406-2015
基本信息
标准号:
SN/T 4406-2015
中文名称:竹花叶病毒的检疫鉴定方法
标准类别:商检行业标准(SN)
标准状态:现行
出版语种:简体中文
下载格式:.zip .pdf
下载大小:6959341
相关标签:
花叶病毒
检疫
鉴定
方法
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4406-2015.Detection and identification of Bamboo mosaic virus.
1范围
SN/T 4406规定了竹花叶病毒检测的程序和方法。
SN/T 4406适用于进出境竹子上竹花叶病毒的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3原理
中文名称:竹花叶病毒
学名:Bamboo mosaic virus,缩写: BaMV
分类地位:线形病毒科(Alphaflexiviridae),马铃薯X病毒属( Potexvirus)。
竹花叶病毒的血清学、分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据。竹花叶病毒的寄主范围、病害症状、分布地区、传播途径、粒体形态、基因组等其他信息参见附录A。
4仪器设备、用具及试剂
4.1仪器设备
高速冷冻离心机、PCR仪酶标仪、凝胶成像分析系统等。
4.2 用具
各种量程的可调移液器(1000μL、200μL、100μL、20μL、10μL、2μL)、PCR反应管、Eppendorf离心管(1.5 mL)、研钵等。
4.3 试剂
间接ELISA试剂见附录B、RT-PCR试剂见附录C。
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4406—2015
竹花叶病毒的检疫鉴定方法
Detection and identificationof Bamboo mosaic virus2015-12-04发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-07-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4406—2015
本标准起草单位:中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、福建农林大学。本标准主要起草人:沈建国、廖富荣、蔡伟、林双庆、陈雅菁、李敏、张永江、金晶、高芳銮、吴祖建。I
1范围
竹花叶病毒的检疫鉴定方法
本标准规定了竹花叶病毒检测的程序和方法,本标准适用于进出境竹子上竹花叶病毒的检测。2规范性引用文件
SN/T4406—2015
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3原理
中文名称:竹花叶病毒
学名:Bamboomosaicvirus
S.缩写:BaMV
分类地位:线形病毒科(Alphafleriviridae),马铃薯X病毒属(Potervirus)。竹花叶病毒的血清学、分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据。竹花叶病毒的寄主范围、病害症状、分布地区、传播途径、粒体形态、基因组等其他信息参见附录A。4
仪器设备、用具及试剂
仪器设备
高速冷冻离心机、PCR仪、酶标仪、4.2用具
胶成像分析系统等
各种量程的可调移液器(1000pL、200离心管(1.5mL)、研钵等。
4.3试剂
100μL、2
间接ELISA试剂见附录B、RT-PCR试剂见附录C。5检测与鉴定
5.1抽样
抽样方法按照SN/T2122中规定执行。5.2
间接ELISA
具体方法见附录B。
μl1oμL、2μL)、PCR反应管、Eppendorf1
SN/T4406—2015
RT-PCR
具体方法见附录C。
结果判定与记录
结果判定
结果判定如下:
当间接ELISA检测结果为阳性,且RT-PCR检测结果为阳性时,则判定为检出BaMV,否则判定为未检出BaMV。
当RT-PCR检测结果呈阳性,且测定的序列为BaMV序列,则判定为检出BaMV,否则判定为未检出BaMV。
2结果记录
记录各项实验数据,包括样品来源、种类、时间,实验的时间、地点、方法和结果等,并要有经手人和实验人员的签字。血清学检测结果保留吸光值的数据报告,分子生物学检测结果保留电泳照片,序列测定结果保留测序报告图。
样品的保存
经检测结果判定为阳性的样品应妥善保存在一80℃超低温冰箱中,并作好登记和标记工作,以备复核用。
A.1寄主范围
附录A免费标准bzxz.net
(资料性附录)
竹花叶病毒的背景资料
SN/T4406—2015
已报道的自然寄主为竹子,包括绿竹、蓬莱竹、长枝竹、泰山竹、麻竹、孟宗竹、箭竹等。A.2
病害症状
BaMV侵染竹子均为系统性感染,一般在叶片引起黄化或褐化的条斑症状,以嫩叶上尤为明显,在竹笋与竹茎横剖面上可观察到褐色到黑色的斑点,上下延伸后在纵剖面上则呈现短钉状病斑,导致竹笋组织硬化,感病后期或数年后,造成竹笋产量显著减少。分布地区
主要分布于中国台湾、巴西、澳大利亚及夏威夷。传播途径
主要通过机械传播。可通过带毒竹子种苗进行远距离传播。A.5
5粒体形态
病毒粒体为长丝状,大小约490nm×15nm,如图A.1。图A.1BaMV病毒粒体(LapierreH和SignoretP,2004)A.6病毒基因组
基因组为正义单链RNA,全长约6366bp。3
SN/T4406—2015
B.1试剂
包被缓冲液(pH9.6)
碳酸钠(Na2CO)
碳酸氢钠(NaHCO)
叠氮化钠(NaNs)
附录B
(规范性附录)
间接ELISA
加人蒸馏水900mL,用HCI调节pH值到9.6,然后加蒸馏水至1L,4℃储存。B.1.2
磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)
氯化钠(NaCI)
磷酸二氢钾(KH,PO)
磷酸氢二钠(NazHPO,)
氯化钾(KCI)
叠氮化钠(NaN3)
加人900mL蒸馏水溶解,用NaOH或HC/调节pH值到7.4,然后加水至1L。B.1.3
每升PBS中加人0.5mL的吐温
酶标抗体稀释缓冲液
1XPBST缓冲液
牛血清白蛋白(BSA)
聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)
叠氮钠(NaN)
用蒸馏水定容至1L,4℃条件下贮存。底物(pNPP)缓冲液(pH9.8)
氯化镁(MgCl2)
叠氮化钠(NaN)
二乙醇胺
溶于800mL蒸馏水中,用HCl调pH值至9.8,蒸馏水定容至1L,4℃储存。B.1.6抗体
病毒抗体:BaMV抗体。
酶标抗体:碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG。4
B.2程序
B.2.1样品制备
SN/T4406—2015
称取0.5g~1.0g待测样品,按1:10(质量:体积)比例加人包被缓冲液,用研钵研磨成浆,8000r/min离心5min,上清液即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应的处理或按说明书进行。
B.2.2包被抗原
加入制备好的检测样品,同时设备阴性对照、阳性对照和空白对照。每个处理至少设2个重复。
100μL/孔,37℃孵育1h或4℃冰箱孵育过夜,倒去酶联板孔中溶液,用PPBST洗涤4次~6次。
B.2.3加病毒抗体
将病毒抗体按说明稀释至工作浓度,加人到酶联板的孔中,100μL/孔,37℃孵育1h,倒去酶联板孔中溶液,用PBST洗涤4次~6次。B.2.4加酶标抗体
农度,加人到酶联板的孔中,100μL将酶标抗体按说明将稀释至工作浓板孔中溶液,用PBST洗涤4次6次。B.2.5加底物
孔,37℃孵育1h,倒去酶联
将底物pNPP加人到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL(现配现用)按100μL/孔,加人到酶联板中,室温避光孵育。
B.2.6吸光值的测定
用酶联仪在405nm处读OD值
B.3结果判断
在满足阴性对照孔的OD40s值<0.15阳性对照孔的OD405值/阴性对照孔的OD405值>5~10,孔的重复性基本一致的质量要求:
样品ODaos值/阴性对照OD4os值>2,判为阳性。样品OD4o5值/阴性对照OD405值<2,判为阴性。样品OD405值/阴性对照OD405值在阈值附近,判为可疑样品,需重新做一次,或用其他方法加以验证。
SN/T4406—2015
C.1试剂
C.1.1TRIzol裂解液
25×TBE缓冲液
Tris碱
硼酸(HBO)
0.5mol/LEDTA(pH8.0)
附录C
(规范性附录)
RT-PCR检测方法
补充蒸馏水至1L。用时加蒸馏水稀释至0.5×TBE36×加样缓冲液
0.25%溴酚蓝
40%(质量:体积)蔗糖水溶液。C.1.4RNA提取试剂
TrizoL、氯仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC(焦碳酸二乙酯)处理过的ddH,O。5RT-PCR试剂
RT缓冲液、dNTPs(10ommol/L)、M-MLVRT(20oU/μL)、RNasin(40U/μL)、TaqDNA聚合酶(5U/μL)、PCR缓冲液、MgClz(25mmol/L)。C.2
引物序列
根据已报道的BaMV基因序列设计一对用于特异性扩增的引物上游引物BaMVf:5'-TCTGGAACTGGAACGGGAACT-3上游引物BaMVr:5'-GATTGTCTAATGGCGAACGTC-3RT-PCR产物大小437bp。
总RNA提取
取0.05g~0.1g样品组织置于研钵中,液氮研细,加人1mLTRIzol试剂充分研磨,15℃~30℃下静置5min;4℃,12000r/min离心10min,取上清;加入氯仿300μL,剧烈震荡15s,室温静置5min,4℃,12000r/min离心15min,取上层水相;加人等体积的异丙醇,颠倒混匀后室温下静置15min,4℃,12000r/min离心10min,弃上清;加人1mL75%的乙醇洗涤沉淀2次,每次4℃,7500r/min离心3min,弃上清;RNA沉淀干燥后,用20μL~40μL经DEPC(焦碳酸二乙酯)处理过的ddHz0溶解,一80℃保存备用。注:RNA提取也可用商业化的试剂盒。6
C.4cDNA合成
SN/T4406—2015
在PCR管中加人3μL总RNA,1μL下游引物BaMVr(10μmol/L),ddHO(DEPC处理)4μL,70℃水浴10min,迅速冰浴5min,再加人下列试剂:5×RT缓冲液2.5μL、dNTPs(10mmol/L)1μL、M-MLVRT(200U/μL)0.5μL、RNasin(40U/μL)0.5μL。42℃水浴60min,70℃水浴10min,自然冷却至室温,一20℃保存备用。c.5
PCR扩增
PCR反应体系见表C.1,每个反应设置2个重复。检测时以含有病毒目标片段的质粒或含病毒材料作为阳性对照,以不含病毒的健康植物组织作阴性对照,同时以水代替模板作为空白对照。PCR反应条件:94℃预变性3min,然后94℃变性30s、56℃退火45s、72℃延伸1min,35个循环,最后一个循环结束后72℃继续延伸10min。PCR反应体系
试剂名称
TaqDNA聚合酶(5U/μL)
dNTPs(10mmol/L)
10×PCR缓冲液(Mg+Free)
25mmol/LMgCl2
上游引物(10μmol/L)
下游引物(10 μmol/L)
总体积
加样量/μL
注:RT-PCR反应体系中各种试剂的量可根据具体情况进行适当调整,也可采用商业化的一步或两步法试剂盒。C.6
琼脂糖凝胶电泳
制备1.5%的琼脂糖凝胶,对PCR产物进行电泳,电压120V,缓冲液0.5×TBE。电泳结束后染色,再在凝胶成像系统中观察是否扩增出预期的特异性DNA电泳带,拍照并做记录。.7
结果判断
如果阴性对照和空白对照无特异性扩增,待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带,则判定为阳性。
如果阳性对照、阴性对照和空白对照正常,待测样品未出现与阳性对照一致的扩增条带,则判定为阴性。
小提示:此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容,若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。