中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4466—2016 国境口岸中东呼吸综合征冠状病毒实时荧光RT-PCR检测方法 Detection method for Middle east respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) using real-time qRT-PCR at frontier port 发布日期：2016-03-09 实施日期：2016-10-01 前言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：周冬根、王燕、翟敏、李红、郑剑宁、胡孔新、施惠祥、裘炯良、卢岳云、阮晨、孙学婷。 1 范围 本标准规定了中东呼吸综合征冠状病毒的实时荧光RT-PCR检测方法，包括检测对象、标本采集和处理、检测程序、结果判定及表述。本标准适用于对出入境人员疑似感染中东呼吸综合征冠状病毒的实验室检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 WS 233 微生物和生物医学实验室生物安全通用准则 WHO 中东呼吸综合征冠状病毒实验室检测推荐方案（2014版）[Laboratory Testing for Middle East Respiratory, Interim recommendations (revised), September 2014] 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文： 3.1 中东呼吸综合征冠状病毒 (Middle east respiratory syndrome coronavirus; MERS-CoV) 2012年在中东地区新发现的一种冠状病毒，属于冠状病毒科和冠状病毒属，为分节段的正链RNA病毒，主要编码upE、NP、RNP等几种蛋白基因。该病毒引起严重急性呼吸道感染症状，严重程度类似SARS，临床主要表现为发热、咳嗽、呼吸急促和呼吸困难。 4 检测对象 疑似感染中东呼吸综合征冠状病毒的出入境人员。 5 实验室生物安全要求 5.1 实验室应遵循 GB 19489 和 WS 233 对生物安全2级（BSL-2）实验室的生物安全要求。 5.2 使用过的实验用品应遵照 GB 19489 对废弃物的处理要求进行无害化处理。 6 仪器和设备 本方法使用的主要仪器如下： - 荧光定量PCR仪； - 生物安全柜； - 普通冰箱； - -70℃超低温冰箱； - 普通台式离心机； - 高速冷冻离心机（转速可达20000g）； - 微量可调移液器（10μL、100μL、1000μL）及配套带滤芯吸头； - 离心管（1.5mL）； - 涡旋振荡器。 7 试剂 7.1 核酸提取试剂 用病毒RNA提取试剂盒 QIAamp Viral RNA Kit，德国 Qiagen 公司产品，详见说明书。或采用具有类似功能的核酸提取试剂进行核酸提取。 7.2 荧光RT-PCR试剂 用 AgPath-ID™ One-Step RT-PCR Kit，美国 Life Technologies 公司产品，详见说明书。或采用具有类似功能的反应试剂进行配制。 7.3 DEPC水 DEPC处理过的不含RNA酶的水。 7.4 实时荧光RT-PCR检测引物和探针 针对中东呼吸综合征病毒以及人核糖核酶P基因核苷酸高度保守区进行设计，引物和探针序列见表1。 表1 中东呼吸综合征冠状病毒实时荧光RT-PCR检测的引物和探针 1. 靶标基因 upE: - upE-FP: GCAACGCGCGATTCAGTT - upE-RP: GCCTCTACACGGGACCCATA - upE-PP: FAM-CTCTTCACATAATCGCCCCGAGCTCG-BHQ1 2. 靶标基因 NP: - NP-FP: GCACTGAGGACCCACGTTTTGCGACATACCCATAAAAGCA - NP-RP: HEX-CCCCAAATTGCTGAGCTTGCTCCTACA-BHQ2 - NP-PP: CTGTTTGGGCTCTCTGAAAGTG 3. 靶标基因 RNaseP: - RNP-FP: AGAAGCGCTGCTCGGCA - RNP-RP: CY5-CGCCAAGGCTGCGGTGTCCACC-BHQ2 - RNP-PP: [未提供] 给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品可替代。