SN/T 4466-2016.Detection method for Middle east respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) using real-time qRT-PCR at frontier port.
1范围
SN/T 4466规定了中东呼吸综合征冠状病毒的实时荧光RT-PCR检测方法,包括检测对象、标本采集和处理、检测程序、结果判定及表述。
SN/T 4466适用于对出入境人员疑似感染中东呼吸综合征冠状病毒的实验室检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安 全通用要求
wS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则
WHO中东呼吸综合征冠状病毒实验室检测推荐方案(2014版[LaboratoryTestingforMiddle East Respiratory , Interim recommendations(revised)，September 2014]
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1中东呼吸综合征冠状病毒 Middle east respiratory syndrome coronavirus ; MERS-CoV
2012年在中东地区新发现的一种冠状病毒,属于冠状病毒科和冠状病毒属,为分节段的正链RNA病毒，主要编码upE、ORFla.RNP等几种蛋白基因。该病毒引起严重急性呼吸道感染症状,严重程度类似SARS,临床主要表现为发热、咳嗽、呼吸急促和呼吸困难。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4466—2016
国境口岸中东呼吸综合征冠状病毒实时荧光RT-PCR检测方法
Detection method for Middle east respiratory syndrome coronavirus(MERS-CoV)usingreal-timeqRT-PCRatfrontierport2016-03-09发布
中华人民共和国
金连道
国家质量监督检验检疫总局
2016-10-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4466—2016
本标准起草单位：中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院本标准主要起草人：周冬根、王燕、翟敏、李红、郑剑宁、胡孔新、施惠祥、裘炯良、卢岳云、阮晨孙学婷。
1范围
国境口岸中东呼吸综合征冠状病毒实时荧光RT-PCR检测方法
SN/T4466—2016
本标准规定了中东呼吸综合征冠状病毒的实时荧光RT-PCR检测方法，包括检测对象、标本采集和处理、检测程序、结果判定及表述本标准适用于对出人境人员疑似感染中东呼吸综合征冠状病毒的实验室检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则WHO中东呼吸综合征冠状病毒实验室检测推荐方案（2o14版[LaboratoryTestingforMiddleEastRespiratory,Interimrecommendations(revised),September2ol4]3术语和定义
下列术语和定义适用于本文
中东呼吸综合征冠状病毒
Middleeast respiratory syndrome coronavirus;MERS-Cov2012年在中东地区新发现的一种元冠状病毒科和冠
冠状病毒，属于完
状病毒属，为分节段的正链RNA
病毒，主要编码upE、ORFla、RNP等几和蛋白基因。
该病毒引起严重
急性呼吸道感染症状，严重程度类似SARS，临床主要表现为发热、咳嗽、呼吸急促和呼吸困难4检测对象
疑似感染中东呼吸综合征冠状病毒的出人境人员5实验室生物安全要求
5.1实验室应遵循GB19489和WS233对生物安全2级（BSL-2)实验室的生物安全要求。5.2
使用过的实验用品应遵照GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理。6仪器和设备
本方法使用的主要仪器如下：
荧光定量PCR仪；
SN/T4466—2016
生物安全柜；
普通冰箱；
-70℃超低温冰箱；
普通台式离心机；
高速冷冻离心机（转速可达20000g）；微量可调移液器（10μL、100μL、1000μL)及配套带滤芯吸头；离心管（1.5mL）；
涡旋振荡器。
7试剂
核酸提取试剂
用病毒RNA提取试剂盒QIAampViralRNAKit，德国Qiagen公司产品，详见说明书。或采用具有类似功能的核酸提取试剂进行核酸提取。7.2
荧光RT-PCR试剂
用AgPath-IDTMOne-StepRT-PCRKit，美国LifeTechnologies公司产品，详见说明书。或采用具有类似功能的反应试剂进行配制。7.3
DEPC水
DEPC处理过的不含RNA酶的水。
实时荧光RT-PCR检测引物和探针针对中东呼吸综合征病毒以及人核糖核酶P基因核苷酸高度保守区进行设计，引物和探针序列见表1。中东呼吸综合征冠状病毒实时荧光RT-PCR检测的引物和探针表1
引物/探针名称
upE-FP
upE-RP
upE-PP
RNP-FP
RNP-RP
RNP-PP
序列（5'-3\）
GCAACGCGCGATTCAGTT
GCCTCTACACGGGACCCATA
FAM-CTCTTCACATAATCGCCCCGAGCTCG-BHQIGGCACTGAGGACCCACGTT
TTGCGACATACCCATAAAAGCA
HEX-CCCCAAATTGCTGAGCTTGCTCCTACA-BHQ2CTGTTTGGGCTCTCTGAAAGTG
AGAAGCGCTGCTCGGCA
CY5-CGCCAAGGCTGCGGTGTCCACC-BHQ2靶标基因
RNaseP
给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则1）
可使用这些等效产品。
8检测程序
样品类型
SN/T4466—2016
采集疑似人员的上呼吸道标本，包括鼻拭子、咽拭子、鼻咽抽取物及漱口液等，也可采集下呼吸道标本，包括痰液、气管吸取物、肺洗液及肺组织标本等。也可采集疑似人员的血清样本、尿液样本等，具体可参考《WHO中东呼吸综合征冠状病毒实验室检测推荐方案（2014版）》。标本应保存在4℃条件下，24h内运送至实验室；未能24h内送至实验室的，应置一70℃或以下保存。8.2
核酸提取
样本核酸提取按照试剂盒相关操作说明进行RNA核酸提取。阳性对照、阴性对照和空白对照设置阳性对照可为中东呼吸综合征冠状病毒核酸，也可为根据中东呼吸综合征冠状病毒目标扩增核苷酸序列体外合成的RNA片段（参见附录A)；阴性对照为不含中东呼吸综合征冠状病毒核酸的标本；空白对照为DEPC水
8.4实时荧光RT-PCR检测
8.4.1实时荧光RT-PCR反应液准备实时荧光RT-PCR反应体系采用以下参数配制：反应组分
2XRT-PCR
缓冲液
upE-FP
upE-RP
upE-PP
RNP-FP
RNP-FP
RNP-FP
RT-PCREnzymeMix
终浓度
0.4μmol/L
0.4μmol/L
0.2μmol/L
0.4μmol/L
0.4μmol/L
0.2μmol/L
0.2μmol/L
0.2μmol/L
0.1μmol/L
最终加RNA模板5.0μL，并加水补足至25μL。8.4.2扩增程序
程序设置以ABIPrism7500fast型全自动荧光定量PCR检测仪为例说明，荧光信号设置为：荧光报告基团为：FAM、HEX及CY5通道，淬灭基团为BHQ1、BHQ2，PassiveReference：NONE。荧光RT-PCR扩增程序按照表2中的程序进行设置，反应总体积为25μL。对于其他型号的荧光定量PCR仪应按实际机型进行反应程序设置，没有ROX荧光通道的荧光定量PCR仪，不进行ROX的设置2）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。
SN/T4466—2016
逆转录
扩增及荧光收集
结果判定及表述
9.1荧光域值的设定
反应温度
样本反应扩增程序
是否采集荧光信号
循环数
RT-PCR反应完成后应设定荧光阈值以分析样品的Ct值。以PCR反应的前3个～15个循环的荧光信号作为基线信号（噪音），Ct值理论上定义为基线信号的标准偏差的10倍。在实际应用中可以根据仪器基线信号进行人工调整，设定原则是以阅值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且不出现Ct值为准实时荧光RT-PCR反应的质量控制9.2
对照反应结果应同时符合以下三个条件，否则此次取样或试验结果无效：阳性对照FAM及HEX通道具有明显扩增曲线阴性对照、空白对照均无扩增曲线；样本的CY5通道具有明显扩增
曲线，若无明显扩增曲线，则此样本不合格，需重新采样检测。9.3
实时荧光RT-PCR检测结果判定及表述9.3.1结果判定
当同时进行的阳性、阴性和空白对照实验结果正常，本方法检验结果判定如下：检测样品FAM通道及HEX通道有明显的荧光增幅曲线月Ct值≤35时，判为阳性，
检测样品FAM通道及HEX通道荧光增曾幅曲线的Ct值介于35和40之间时，建议采用浓缩方式处理核酸样本，再重新进行实时荧光PCR检测
曲线有明显的对数增长期，判为阳性，否则判为阴性若重新检测的Ct值有明显减少趋势，且检测样品FAM通道及HEX通道，其中一个通道具有明显荧光增幅曲线，另一个通道无荧光增幅曲线，此类样本建议用其他方法进一步检测验证。检测样品FAM通道及HEX通道均无荧光增幅曲线，判为阴性。9.3.2结果表述
实时荧光RT-PCR检测阳性结果表示样本中东呼吸综合征冠状病毒核酸阳性，实时荧光RT-PCR检测阴性结果表示样本中东呼吸综合征冠状病毒核酸阴性。4
附录A
（资料性附录）
阳性对照制备程序
SN/T4466—2016
将upE基因目标扩增序列与NP基因目标扩增序列通过一段结构为TTTT的Spacer连接，通过体外化学合成DNA片段，然后克隆于载体上，用转录试剂盒进行体外转录，形成RNA阳性对照模板。序列片段：
TTTCGTGCCT
ATCGCCCCGA
ACTATGGGTC
CTGAGGACCC
TACAGCCAGT
TAGGCTTGCT
TGCGGTGTCC
GCAACGCGCGbzxZ.net
ATTCAGTTCC
GCTCGCTTATCGTTTAAGCA
CCGTGTAGAGGCTAATCCAT
ACGTTGG
GCTTTTATGG
GTTTGGGCTC
ACCAACTGCC
CAAATTGCTG
GTATGTCGCA
TCTGAAAGTG
GAGCAGCGCT
TCTTCACATA
TCGGCA
TGCTCC
ATTTAAACTT
ACGCCAAGGC
TCTCCATGGA
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