SN/T4462—2016 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 国境口岸O1群和O139群霍乱弧菌和霍乱肠毒素三重实时PCR的检测方法 Detection method for O1 serotype, O139 serotype Vibrio cholera and enterotoxin by triplex real-time fluorescence PCR at frontier port 2016-03-09 发布 2016-10-01 实施 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：周冬根、王燕、李红、孙大为、郑剑宁、裘炯良、倪敏君、张升、张绮、杨天赐、莫秋华。 1 范围 本标准规定了国境口岸O1群和O139群霍乱弧菌以及霍乱肠毒素基因三重实时PCR检测方法的检验对象、标本采集、检验程序及结果判定。本标准适用于国境口岸对O1群和O139群霍乱弧菌以及霍乱肠毒素基因的实验室检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 WS/T 230 临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 O1 serotype O1群霍乱弧菌 菌体抗原由3种抗原因子A、B、C组成，又可分为3个血清型：小川型、稻叶型和彦岛型。根据表型差异，O1群霍乱弧菌的每一个血清型还可分为2个生物型，即古典生物型和El Tor生物型。 3.2 O139 serotype O139群霍乱弧菌 其临床表现及传播方式上与O1群霍乱弧菌完全相同，但不能被O1群霍乱弧菌诊断血清所凝集，抗O1群的抗血清对O139菌株无保护性免疫。在水中的存活时间较O1群霍乱弧菌长。 3.3 Vibrio cholera enterotoxin 霍乱肠毒素 是目前已知的致泻毒素中最为强烈的毒素，是肠毒素的典型代表。作用于肠细胞膜表面上的受体，导致肠黏膜细胞分泌功能大为亢进，使大量体液和电解质进入肠腔而发生剧烈吐泻。 4 检测对象 4.1 疑似病人的排泄物、呕吐物。 4.2 被霍乱弧菌污染或有霍乱弧菌污染嫌疑的交通工具、行李、货物、集装箱、邮包、饮用水、压舱水、污水、餐饮用具、生活用品。 5 主要仪器设备 本方法使用的主要仪器如下： 超净工作台；二级生物安全柜；微型混合器、涡旋振荡器；冰箱（4℃；-20℃）；恒温金属浴；普通台式离心机；高速冷冻离心机（离心力可达20000g）；可调式微量加样器（10μL、100μL、1000μL）及配套带滤芯吸头；荧光PCR检测仪。 6 主要试剂 本方法使用的主要试剂如下： Qiagen multiplex PCR kit检测试剂盒；无DNA酶的DEPC水； 引物和探针：引物和探针序列见表1。 表1 荧光PCR检测的引物和探针 | 引物/探针名称 | 序列 (5'-3') | 扩增片段大小/bp | | :--- | :--- | :--- | | O1-F | CCAGATTGTAAAGCAGGATGGA | 163 | | O1-R | GGTCATCTGTAAGTACAAC | 120 | | O1-P | FAM-CCCGGAGTTTGTAAGCCCACTACCGGG-DABCYL | 80 | | O139-F | CATACCAACGCCCTTATCCATTGCATGACTGGCATCCCAAAAT | - | | O139-R | TCCGGAGCATAGAGCTTGGA | - | | O139-P | HEX-CGGGTGAGAAAAGACAGCAATAACACCCG-DABCYL | - | | ctxA-F | TCGATGATCTTGGAGCATTCC | - | | ctxA-R | (未提供) | - | | ctxA-P | CY5-CCGTGGATTCATCATGCACCGCCACGG-DABCYL | - | 7 检验程序 7.1 样本采集 7.1.1 粪便样本采集 采集自然排出的新鲜大便于灭菌容器中；水样便采集1mL～3mL；成形便采集1g～3g；亦可用已湿润的直肠棉拭由肛门插入直肠内3cm～5cm处并轻轻旋转，确保退出的棉拭上有可见的粪便，把棉拭放入灭菌容器中。粪便样本宜在发病早期（发病4d内），服用抗菌药前采集。