中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4632—2016 小西葫芦黄花叶病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Zucchini yellow mosaic virus 前言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国河南出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、广西大学、中国农业科学院郑州果树研究所。 本标准起草人：赵忠懿、韩英、李萌、宋南、廖富荣、朱英芝、彭发青、代玉华、吴会杰。 1 范围 小西葫芦黄花叶病毒检疫鉴定方法本标准规定了小西葫芦黄花叶病毒的检疫鉴定方法。 本标准适用于进出境种子、苗木、组培苗等植物性繁殖材料及新鲜或保鲜瓜果中小西葫芦黄花叶病毒的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T 1840 植物病毒免疫电镜检测方法 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样方法 3 小西葫芦黄花叶病毒基本信息 学名：Zucchini yellow mosaic virus 缩写：ZYMV 分类地位：马铃薯Y病毒科（Potyviridae）、马铃薯Y病毒属（Potyvirus）。其他信息参见附录A。 4 方法原理 小西葫芦黄花叶病毒的血清学特性和分子生物学特性是检疫鉴定的主要依据。 5 仪器设备和主要试剂 5.1 仪器设备 酶联检测仪、天平（感量：1/10000g）、pH计（测量精度：±0.05pH）、微量榨汁机、高速冷冻离心机、植物光照培养箱（温度可调范围0℃～50℃）、隔离温室、透射电子显微镜（放大倍数：20万倍）、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、恒温水浴锅、低温冰箱等。 5.2 用具 微量移液器（2.5μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL）、酶联板、研钵、eppendorf管、铜网（40目）、滴管、尖头小镊子、Whatman滤纸、塑料培养皿、洁净玻璃片、Parafilm、花盆、灭菌土等。 5.3 主要试剂 酶联免疫吸附测定试剂（见附录B）、RT-PCR检测试剂（见附录C）。 6 抽样与样品制备 6.1 抽样 按照 SN/T 2122 的规定执行。 6.2 样品制备 6.2.1 种子样品 将种子播于灭菌土中，于25℃生长并进行症状观察。待长出3片～4片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号。采集叶片进行酶联免疫吸附测定及RT-PCR检测。 6.2.2 苗木样品 将苗木种植于隔离温室中，于25℃生长并进行症状观察。有症状的苗木或种薯单独检测。没有症状的分组检测，分组方法和检测方法同6.2.1。 6.2.3 组培苗样品 直接取组培苗进行分组和检测，方法同6.2.1。 6.2.4 瓜果样品 直接取新鲜或保鲜瓜果样品（重点选取带有畸形、变色等病毒病症状的样品）进行分组和检测，方法同6.2.1。 7 检测方法 7.1 酶联免疫吸附测定 见附录B。 7.2 免疫电镜检测 按照 SN/T 1840 的规定执行。 7.3 RT-PCR检测 见附录C。 8 结果判定 酶联免疫吸附测定或免疫电镜检测为阳性，且RT-PCR检测亦为阳性，可判定待检样品带有小西葫芦黄花叶病毒。 9 样品保存 9.1 样品保存 经检验确定携带小西葫芦黄花叶病毒的种子保存在4℃，病株在－20℃或者－80℃冰箱中保存，做好标记和登记工作。 9.2 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间、实验时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。酶联测定需有酶联板反应的原始数据，RT-PCR检测需有电泳结果图片。