SN/T 4675.29-2016.Determinetion of Brettanomyces bruxellensis in wine for export-Real-time PCR method.
1范围
SN/T 4675.29规定了葡萄酒中酒香酵母( Brettanomyces bruxellensis) 的定性检测方法。
SN/T 4675.29适用于各种葡萄酒中酒香酵母菌的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489实验室生物安 全通用要求
GB/T 27403实验室质量控制规范 食 品分子生物学检测
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
3.1酒香酵母Brettanom yces bruxellensis
酒香酵母是一种可以存活于葡萄酒中的酵母菌,可以产生4-乙基苯酚和4-乙基-2-甲氧基苯酚等酚类化合物,导致葡萄酒发出类似马汗的味道，如果浓度过高，会严重影响葡萄酒的品质。
4生物安全措施和防污染措施
4.1生物安全措施
为了保护实验室人员的安全,应由具备资格的工作人员进行检测，所有培养物和废弃物应参照GB19489中的有关规定执行。
4.2防污染措施
防止污染措施应符合GB/T 27403的规定。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4675.29—2016
出口葡萄酒中酒香酵母检验
实时荧光PCR法
Determinetion of Brettanomyces bruxellensis in wine for export-Real-timePCRmethod
2016-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-07-01实施
SN/T4675《出口葡萄酒质量安全分析方法》共分为30个部分：SN/T4675.1：出门葡萄酒中甘油的测定酶法；气相色谱法；
SN/T4675.2：出口葡萄酒中2，3-丁二醇的测定-SN/T4675.3：出口葡萄酒中乙醇稳定碳同位素比值的测定；SN/T4675.4：出口葡萄酒中乳酸的测定酶法；SN/T4675.5：出口葡萄酒中有机酸的测定离子色谱法；SN/T4675.6：出口葡萄酒中葡萄糖、果糖和蔗糖的测定；SN/T4675.7：出口葡萄酒中乙醛的测定气相色谱-质谱法；SN/T4675.8：出口葡萄酒中5-羟甲基糠醛的测定液相色谱法；SN/T4675.9：出口葡萄酒中二甘醇的测定气相色谱-质谱法；SN/T4675.29—2016
SN/T4675.10：出口葡萄酒中赭曲霉毒素A的测定液相色谱-质谱/质谱法；SN/T4675.11：出口葡萄酒中7种花色苷的测定超高效液相色谱法；SN/T4675.12：出口葡萄酒中溶菌酶的测定液相色谱法；SN/T4675.13：出口葡萄酒中2，4，6-三氯苯甲醚残留量的测定气相色谱-质谱法；SN/T4675.14：出口葡萄酒中纳他霉素的测定液相色谱-质谱/质谱法；SN/T4675.15：出口葡萄酒中水杨酸、脱氢乙酸和对氯苯甲酸的测定液相色谱法；SN/T4675.16：出口葡萄酒中富马酸的测定液相色谱-质谱/质谱法；气相色谱-质谱/质谱法；
SN/T4675.17：出口葡萄酒中丁基锡含量的测定残留量的测定顶空气相色谱法；SN/T4675.18：出口葡萄酒中二硫代氨基甲酸酯SN/T4675.19：出口葡萄酒中钠、镁、钾、钙、铬、锰、铁、铜、锌、砷、硒、银、镉、铅的测定；SN/T4675.20：出口葡萄酒中稀土元素的测定电感耦合等离子体质谱法；SN/T4675.21：出口葡萄酒中可溶性无机盐的测定离子色谱法；SN/T4675.22：出口葡萄酒中总二氧化硫的测定比色法；SN/T4675.23：出口葡萄酒及葡萄汁中氨氮的测定连续流动分析仪法；SN/T4675.24：出口葡萄酒福林-肖卡指数的测定分光光度计法；SN/T4675.25：出口葡萄酒颜色的测定CIE1976（Lab）色空间法；
SN/T4675.26：出口葡萄酒浊度的测定散射光法；SN/T4675.27：出口葡萄酒碱性灰分的测定；SN/T4675.28：出口葡萄酒细菌、霉菌及酵母的计数；SN/T4675.29：出口葡萄酒中酒香酵母检验实时荧光PCR法；SN/T4675.30：出口葡萄酒中拜氏接合酵母检验实时荧光PCR法。本部分为SN/T4675的第29部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局。本部分主要起草人：刘夏、李晓虹、王传现、钱云开、李志勇、宋青、刘青、凌莉、张旺。I
1范围
出口葡萄酒中酒香酵母检验
实时荧光PCR法
SN/T4675.29—2016
SN/T4675的本部分规定了葡萄酒中酒香酵母（Brettanomycesbrurellensis）的定性检测方法。本部分适用于各种葡萄酒中酒香酵母菌的检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范
食品分子生物学检测
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
酒香酵母Brettanomycesbruxellensis酒香酵母是一种可以存活于葡萄酒中的酵母菌，可以产生4-乙基苯酚和4-乙基-2-甲氧基苯酚等酚类化合物，导致葡萄酒发出类似马汗的味道，如果浓度过高，会严重影响葡萄酒的品质。生物安全措施和防污染措施
生物安全措施
为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行检测，所有培养物和废弃物应参照GB19489中的有关规定执行。
防污染措施
防止污染措施应符合GB/T27403的规定。仪器和设备
5.1水浴锅或加热模板：95℃±5℃。5.2高速冷冻离心机：最高离心力不低于12000g。5.3离心管：50mL、2mL。
5.4移液器：量程0.5μL~10μL；量程10μL~100μL；量程100μL~1000μL及无菌吸头。1
SN/T4675.29—2016
无菌吸管，10.0mL（具0.1mL刻度）或移液器及吸头5.6
计时器
细胞破碎玻璃珠：直径500μm。涡旋振荡器。
恒温干燥箱：48℃士1℃。
5.10冰箱：-20℃±1℃。
荧光PCR仪，
无DnasePCR反应板或反应管。
试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。6.1
实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。Tris-HCI缓冲液：10mmol/L，pH8.0,见A.1。交联聚乙烯吡咯烷酮：Crosslinkingpolyvingypyrrolidone，缩略语为PVPP，360kDa。TE溶液：见A.2。
溶液I:见A.3。
抽提液：见A.4，4℃保存。
醋酸铵溶液：4mol/L。
RnaseA溶液：lμg/μL，4℃保存。引物和探针：见表1。
引物和探针序列
目标基因
酒香酵母RAD4
蛋白编码基因
引物序列
F5'-GTTCACACAATCCCCTCGATCAAC-3R5'-TGCCAACTGCCGAATGTTCTC-3
6.10酒香酵母质控菌株：NBRC0628，或等效菌株。6.11
YM培养基：见A.5。
6.12TaqDNA聚合酶。
dNTP:dATP,dTTP,dCTP,dGTP。
6.1410XPCR缓冲液。
MgCl2溶液：25mmol/L。
操作步骤
样品处理
探针序列
5'-FAM-ATGGCGAGGATGAAAG
TTTGGGATACA-BHQ1-3\
取45mL待分析葡萄酒样品，置于具有无菌螺旋塞的50mL试管中，在4℃离心5min，离心力为9300g，弃去上清液。然后加人45mL10mmol/LTris-HClpH8.0洗涤残渣，涡旋振荡上述溶液，在4℃离心5min，离心力为9300g，弃去上清液。轻微涡旋，使沉淀悬浮于残留液体中。2
7.2DNA提取
7.2.1细胞裂解
SN/T4675.29—2016
向收集的沉淀悬浮液中加人0.3g玻璃珠，然后加人PVPP，使其最终的质量/体积比为1%。加人200μL溶液I和200μL抽提液。涡旋振荡上述溶液80s，然后置于一20℃冷却80s；重复上述涡旋冷却步骤3次。
7.2.2纯化DNA
7.2.2.1加人200μLTE溶液，12000g，离心5min。小心收集400μL的上层水相至新的离心管中。如果水相和有机相分离不充分，重复上述离心步骤。7.2.2.2向离心管中加人1mL无水乙醇，颠倒混匀4次~5次。15700g，离心5min，弃上清。加人400μLTE溶液和30μL浓度为1μg/μL的RNaseA溶液，重悬沉淀。37℃温育5min。7.2.2.3
吸干。
加人10uL浓度为4mol/L的醋酸铵溶液和1mL无水乙醇，颠倒混匀。12000g，离心5min，弃上清。倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同位置沉淀干燥：打开离心管盖，48℃恒温干燥1h。7.2.2.6
向干燥后的离心管底部加人25μLTE，涡旋震荡后于4℃放置1h～18h（帮助DNA溶解）。室温下测定DNA含量。当DNA浓度为0.34μg/mL～340μg/mL，A260/A280比值在1.71.9之间时，适宜PCR扩增。
注：可使用等效商品化DNA提取试剂盒，按照操作说明书制备DNA模板，7.3阴性对照、阳性对照和空白对照的设置阴性对照：采用不含目标基因序列的菌株DNA为模板，每个反应板至少设置1个阴性对照。阳性对照：接种酒香酵母到10mLYM培养基中，30℃培养24h，取1mL菌液提取DNA模板，作为阳性对照，每个反应板至少设置2个阳性对照。设两个空白对照：
提取DNA时设置的提取空白对照（以水代替样品）：一RT-PCR反应的空白对照（以TE溶液代替DNA模板）。7.4RT-PCR反应体系
RT-PCR反应体系见表2。每个样品各做2个平行孔。加样时应使样品DNA溶液完全加入反应液中，不要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，密封反应板或联排管。密封后，可对反应板或联排管进行短时间离心以除掉其中的气泡。2实时荧光PCR反应体系
试剂名称bZxz.net
10×PCR反应缓冲液
MgClz溶液（25mmol/L）
dNTP(10 mmol/L)
上游引物（10μmol/L）
下游引物（10μmol/L）
试剂用量/μL
SN/T4675.29—2016
试剂名称
TaqDNA聚合酶（5U/μL)
探针Bret(10μmol/L)
DNA模板
超纯水
总体积
5RT-PCR反应参数
表2（续）
试剂用量/μL
95℃预变性10min；95℃变性30s，58℃退火延伸20s，同时收集荧光信号，72℃20s，50个循环；4℃保存反应产物。
反应体系与反应参数可以根据仪器型号或反应预混液类型的不同，进行适当的调整。8
质量控制
基本原则：在对结果进行最终判读前，应首先检查阴性和阳性对照结果。保证试验有效，阴性和
阳性对照的结果应符合表3要求。任一种对照出现非下述正常结果，应重做实验表3质量控制参考表
对照名称
阴性对照
阳性对照
空白对照
结果判断
无扩增曲线，Ct≥40
出现典型扩增曲
线，Ct≤30
无扩增曲线，Ct≥40
如果检测样品的Ct值≤35，并且出现典型扩增曲线，可判断该样品检测结果为阳性。如果检测样品的Ct值≥40，并且无典型扩增曲线，可判断该样品检测结果为阴性。9.3如果35结果表达
如果Ct值≥40，检测结果为阴性，表述为“该样品未检出酒香酵母”如果Ct值<35，检测结果为阳性，表述为“该样品中酒香酵母荧光PCR检测阳性”如果35称取1.21g三羟甲基氨
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂
SN/T4675.29—2016
mL超纯水溶解。用HCl调节pH值为8.0，加超纯水定容至1000mL。121
1℃高压灭菌15min
A.2TE溶液
称取1.21g三羟甲基氨基甲烷（Tris）用800mL超纯水溶解。用HCI调节pH值。然后添加0.372gEDTA，调节pH至8.0后，加超纯水定容至1000mL。121℃高压灭菌15min。A.3
溶液I
制备500mL2×TE溶液，并添加100ml浓度为1mol/L的NaCI溶液和100mL10%的SDS溶液（稍微加热以溶解SDS）和20gTriton×100，加超纯水定容至1000mL。A.4苯酚、氯仿、异戊醇抽提液
添加48mL氯仿和2mL异戊醇到50mL苯酚饱和的pH8.0的TE溶液中，4℃储存备用。5YM培养基
A.5.1成分
酵母浸粉
麦芽浸粉
蛋白陈
葡萄糖
蒸馏水
A.5.2制备
1000mL
将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH为pH6.8士0.2，121℃高压灭菌15min，备用。5
SN/T4675.29-2016
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
出口葡萄酒中酒香酵母检验
实时荧光PCR法
SN/T4675.29—2016
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010)68533533
网址spc.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16印张0.75字数14千字2017年12月第一版2017年12月第一次印刷印数1—500
书号：155066·2-32299
定价16.00元
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