SN/T4799—2017 动物结核病病原菌检测方法 变性高效液相色谱法 Detection of tuberculosis pathogenic organisms of animals - DHPLC method 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：刘志玲、陈茹、王莹、吴晓薇、朱道中、段燕喻、林志雄。 1 范围 本标准规定了结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌多重PCR联合变性高效液相色谱(mPCR-DHPLC)检测方法的技术要求和操作规范。本标准适用于快速检测细菌培养物、动物组织、血样、痰液等临床样品中结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DHPLC：变性高效液相色谱（denaturing high-performance liquid chromatography）。 dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosides triphosphate）。 PBS：磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution）。 mPCR：多重聚合酶链式反应（multiplex polymerase chain reaction）。 TEAA：三乙基铵醋酸盐。 4 概述 人与动物结核病涉及多种病原菌或病原菌复合群。结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex, MTC）是感染人与哺乳动物的结核病原菌，包括结核分枝杆菌和牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌。其中，主要感染人与家畜并致病的是结核分枝杆菌和牛分枝杆菌。与MTC相对应的是种类繁多的各种非结核分枝杆菌（NTM）。NTM感染患者的临床症状及病理变化与MTC引起的结核病极为相似，但多数NTM对抗结核药物有天然耐药性。此外，NTM感染可造成结核菌素皮内变态反应或血清学检测假阳性。 采用多重PCR联合变性高效液相色谱检测的方法可同步区分结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌复合群，并鉴别结核分枝杆菌与牛分枝杆菌。mPCR反应的原理、操作过程与普通PCR相同。在同一PCR反应体系里加入多对特异性引物，对多个DNA模板或同一模板不同区域扩增出多个目的DNA片段。DHPLC分析技术是利用液相色谱技术，在高压闭合液相流路中，将DNA样品自动注入并在缓冲液携带下流过DNA分离柱。DNA片段分子中带负电荷的磷酸根基团与TEAA分子中带正电荷的氨基发生静电作用相互吸引，同时TEAA分子中的三个乙基与固定相C18表面的烷基发生疏水作用力而相互吸引，通过流动相中的乙腈的梯度洗脱将不同大小的DNA片段分离，由紫外或荧光检测被分离的DNA样品。根据DNA扩增片段长度大小，不同分子量的特异扩增产物在特定位置呈现吸收峰，从而对结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌和牛分枝杆菌进行快速检测。 5 材料与试剂 5.1 仪器与耗材 5.1.1 变性高效液相色谱分析仪 5.1.2 核酸扩增仪 5.1.3 ⅡI级生物安全柜 5.1.4 接种棒 5.1.5 恒温水浴锅（室温至100℃） 5.1.6 离心机 5.1.7 微量可调移液器和灭菌吸头：10μL、100μL、200μL、1000μL 5.1.8 天平 5.1.9 PCR光学反应管 5.2 试剂 5.2.1 试剂级别：除另有规定，所用化学试剂应为分析纯。