SN/T 4859-2017
基本信息
标准号： SN/T 4859-2017
中文名称：国境口岸结核分枝杆菌复合群鉴定方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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下载大小：3794972
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4859-2017.Identification of M ycobacterium tuberculosis complex at frontier port.
1范围
SN/T 4859规定了国境口岸结核分枝杆菌复合群鉴定的生物安全要求、鉴定程序、鉴定方法、结果报告等内容。
SN/T 4859适用于国境口岸人出境人员感染结核分枝杆菌复合群的检测鉴定。
2规范性引 用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安 全通用要求
结核病实验室生物安全手册世界卫生组织
人间传染的病原微生物名录卫生部
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1结核分枝杆菌复合群Mycobacterium tuberculosis complex ;MTC
传染性结核病的病原菌复合群，包括结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌。MTC的细菌呈杆状，菌体大小0.6 μm×(1 μm~4 μm),抗酸染色阳性,革兰氏染色阳性。生长缓慢,约10 h繁殖一代,据接种量的多少,10d~30d肉眼可见菌落生长。罗氏(Lowenstein-Jensen)培养基上的菌落粗糙、致密,呈颗粒、结节、或菜花样,乳白或米色,不透明。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
PAGE( polyacrylamide gel electrophoresis) :聚丙烯酰胺凝胶电泳
TBE (Tris-Boric acid) :Tris硼酸核酸电泳缓冲液
bp( base pair): 碱基对
1范围
SN/T 4859规定了国境口岸结核分枝杆菌复合群鉴定的生物安全要求、鉴定程序、鉴定方法、结果报告等内容。
SN/T 4859适用于国境口岸人出境人员感染结核分枝杆菌复合群的检测鉴定。
2规范性引 用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安 全通用要求
结核病实验室生物安全手册世界卫生组织
人间传染的病原微生物名录卫生部
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1结核分枝杆菌复合群Mycobacterium tuberculosis complex ;MTC
传染性结核病的病原菌复合群，包括结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌。MTC的细菌呈杆状，菌体大小0.6 μm×(1 μm~4 μm),抗酸染色阳性,革兰氏染色阳性。生长缓慢,约10 h繁殖一代,据接种量的多少,10d~30d肉眼可见菌落生长。罗氏(Lowenstein-Jensen)培养基上的菌落粗糙、致密,呈颗粒、结节、或菜花样,乳白或米色,不透明。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
PAGE( polyacrylamide gel electrophoresis) :聚丙烯酰胺凝胶电泳
TBE (Tris-Boric acid) :Tris硼酸核酸电泳缓冲液
bp( base pair): 碱基对
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4859—2017
国境口岸结核分枝杆菌复合群鉴定方法IdentificationofMycobacterium tuberculosis complex atfrontierport2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草，本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局。SN/T4859—2017
本标准主要起草人：陆哗、王健、章琪、方筠、孟成艳、叶魏、查期、贾哲甫、张晓航、韩晓辉、周娴邱瑾。
SN/T4859—2017
近几年结核病实验室诊断新技术不断涌现，实现了快速而准确检测结核分枝杆菌及其耐药性的目标。目前我国依据《WS288一2008肺结核诊断标准》进行结核病诊断，其中结核病的实验室诊断仍主要依赖于痰标本涂片显微镜检查、传统的固体培养。显微镜检查敏感度较低，并且无法区分活性和非活性生物体，无法鉴别分枝杆菌类型。传统的固体培养基上，结核杆菌生长需要长达八周的时间，报告时间长。在无法及时确诊的情况下，适当的治疗被延迟。同时，实验室还需要快速而价廉的培养物鉴定方法用以区分结核分枝杆菌复合菌群和非结核分枝杆菌。WHO在结核病诊断方面的相关标准持续改进：将新的技术与方法恰当的纳人诊断方案，这也是有效采用新的诊断方法的先决条件之一。本标准在充分评估的基础上，规范了结核分枝杆菌实验室鉴定技术的应用路径，及综合判断方案。通过新技术的采用，提高了国境口岸肺结核病的防控效率。1范围
国境口岸结核分枝杆菌复合群鉴定方法SN/T4859—2017
本标准规定了国境口岸结核分枝杆菌复合群鉴定的生物安全要求、鉴定程序、鉴定方法、结果报告等内容。
本标准适用于国境口岸入出境人员感染结核分枝杆菌复合群的检测鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求结核病实验室生物安全手册世界卫生组织人间传染的病原微生物名录卫生部3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
结核分枝杆菌复合群Mycobacteriumtuberculosiscomplex；MTC传染性结核病的病原菌复合群，包括结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌。MTC的细菌呈杆状，菌体大小0.6μm×（1μm～4μm），抗酸染色阳性，革兰氏染色阳性。生长缓慢，约10h繁殖一代，据接种量的多少，10d～30d肉眼可见菌落生长。罗氏（Lowenstein-Jensen）培养基上的菌落粗糙、致密，呈颗粒、结节、或菜花样，乳白或米色，不透明。缩略语
下列缩略语适用于本文件。
PAGE（polyacrylamidegelelectrophoresis）：聚丙烯酰胺凝胶电泳TBE（Tris-Boricacid）：Tris-硼酸核酸电泳缓冲液bp(basepair)：碱基对
生物安全措施
根据WHO《结核病实验室生物安全手册》与GB19489和《人间传染的病原微生物名录》的要求，结核分枝杆菌复合群相关检测鉴定材料的生物安全要求如下：样本处理与检测应于生物安全二级（BSL-2)实验室，在IIA级或以上级别生物安全柜内进行；一大量活菌操作，如培养物鉴定，药敏检测等，应在生物安全三级（BSL-3)实验室或结核病防护实验室内的生物安全柜中进行。结核病防护实验室，是指在生物安全二级实验室基础上，实验1
SN/T4859—2017
区域与实验室外部由缓冲区域物理隔离，实验区域控制为单向气流；MTC的细菌培养物运输包装分类为A类，UN编号为UN2814；操作人员佩戴医用N95口罩，穿着一次性防护服，戴一次性医用橡胶手套，更换防水工作鞋；操作人员需要每年进行胸部X光检查、血清HIV检查。6仪器和设备
ⅡI级生物安全柜。
6.2电子天平。
水平冷冻离心机（离心力3500g以上）。37℃恒温培养箱。
荧光PCR仪。
水平电泳仪。
紫外成像仪。
100℃热浴仪。
正置光学显微镜。
微量加样器（2μL、20μL、200L、1000μ试剂和耗材
PCR反应体系（商品化试剂）。
0.067mmol/LpH6.8磷酸缓冲液（PBS)。N-乙酰-L-半胱氨酸（NALC)
无菌4%NaOH溶液。
无菌2.9%枸橡酸钠溶液
苯酚。免费标准bzxz.net
无水乙醇。
罗氏培养基。
革兰氏染色液。
抗酸染色液。
TBE电泳缓冲液。
DNA分子量标准（DNALadderMarker）。50mL无菌离心管。
实验室检查
生长周期检查
罗氏培养基上MTC的生长周期
痰标本中的MTC在罗氏培养基上生长，通常第3周以后开始出现肉眼可见的菌落8.1.2
7H9液体培养基中MTC的生长周期8.1.2.1
痰标本中的MTC在7H9液体培养基中生长，通常第14天左右出现显微镜下可见的菌落。SN/T4859—2017
8.1.2.2痰标本中的MTC数量多、繁殖旺盛时，接种后第4天左右出现显微镜下可见的菌落。通常液体培养样本接种后立即报告阳性的为其他污染细菌。8.2形态学检查
肉眼观察罗氏培养基上的菌落。MTC在罗氏培养基上是乳白或米色、不透明、粗糙、致密，呈颗粒、结节、或菜花样的菌落，单个菌落散在或聚集，参见图A.1和图A.2，也可见细小的菌落连成一片菌苔。
8.3抗酸染色检查
8.3.1痰涂片的抗酸染色及检查
痰涂片抗酸染色后在1000倍放大的正置光学显微镜下MTC呈红色的细长杆菌。部分红色菌体中可见浓染颗粒。可以一条散在，也可多条聚集，也可成团或成簇。参见图A.3和图A.4。
8.3.2罗氏培养基上MTC的抗酸染色及检查罗氏培养基上的MTC菌落涂片抗酸染色后，在1000倍放大的正置光学显微镜下呈成片的红色杆菌，密集成团。参见图A.5。
8.3.3液体培养基7H9中MTC的抗酸染色及检查液体培养基中的MTC涂片抗酸染色后，在1OO0倍放大的正置光学显微镜下呈致密、条索状的红色菌团。参见图A.6。
8.4免疫学鉴定方法
分泌蛋白的检测，能够确定培养基中是否含有结核分枝杆菌复合群。通过对液体培养基中MPB64
选用国家食品药品监督管理总局（CFDA）注册认证的商品试剂盒，按照说明书进行检测。8.5分子生物学鉴定方法
8.5.1MTC的实时荧光PCR检查
通过对痰液样本或培养物中结核分枝杆菌特异性核酸片段的检测，鉴定样本中是否含有结核分枝杆菌复合群。选用国家食品药品监督管理总局（CFDA）注册认证的商品试剂盒，按照说明书进行检测。8.5.2MTC的线性探针杂交固相膜显色检测通过扩增结核分枝杆菌16SrRNA特异性片断，扩增产物经过化学变性后，与带有探针固化的试纸条杂交，通过显色反应检测确定是否含有目的片段。选用国家食品药品监督管理总局（CFDA）注册认证的商品试剂盒，如：HainLifescience公司的GenoType（r）MTBDRplusl，按照说明书进行检测。8.5.3MTC的DNA序列测定及比对
参见附录B。
8.5.4MTC核酸及rpoB基因突变检测检测结核菌阳（涂片阳性或者细菌培养阳性）痰沉淀物样本中的结核分枝杆菌复合群特异性核酸片段和利福平耐药相关的rpoB基因突变，完成分枝杆菌鉴定及利福平耐药分析。选用国家食品药品监督管理总局（CFDA）注册认证的商品试剂盒，如：Cepheid公司的XpertMTB/RIF\），按照说明书进行3
SN/T4859—2017
检测。
9MTC的鉴定及报告
痰液标本中MTC的鉴定和报告
显微镜下痰涂片中找到抗酸杆菌，痰液样本经8.5.1、8.5.2或8.5.4检测，获得阳性结果时，报告“检出结核分枝杆菌复合群”
9.2液体培养基中MTC的鉴定和报告9.2.1
符合8.1.2液体培养分枝杆菌生长规律，菌落形态符合8.3.3，可选择8.4或8.5中的方法进行鉴定。
9.2.2满足9.2.1应用8.4的方法鉴定时，如为阳性结果时，报告“检出结核分枝杆菌复合群”；为阴性结果时，进一步应用8.5的方法鉴定。9.2.3满足9.2.1应用8.5.1或8.5.2鉴定结果阳性时，报告“检出结核分枝杆菌复合群”。固体培养基上MTC的鉴定和报告
形态学检查符合8.2，涂片检查符合8.3.2，经8.5中任一种鉴定方法，结果阳性，报告“检出结核分枝杆菌复合群”。
9.4阴性报告
任何样本经罗氏培养基或液体培养基7H9培养8周后，无菌落生长，或培养物涂片检查未发现抗酸杆菌，或发现抗酸杆菌但采用8.5中任一种方法检测，结果为阴性时，报告“未检出结核分枝杆菌复合群”。
1）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。4
附录A
（资料性附录）
MTC的形态学特征
图A,1罗氏培养基上的MTC单个菌落图A.3>10条抗酸杆菌/视野
（抗酸染色，1000倍放大）
图A.5罗氏培养基上的MTC菌落涂片（抗酸染色，1000倍放大）
SN/T4859—2017
图A.2罗氏培养基上的MTC菌落形态图A.41条2条抗酸杆菌/视野
（抗酸染色，1000倍放大）
图A.6液体培养基中MTC菌落索状形态（抗酸染色，1000倍放大）
SN/T4859—2017
B.1细菌核酸提取
B.1.1热裂解法
附录B
（资料性附录）
MTC的DNA测序检测法
将放有细菌标本的1.5mL无菌离心管于80℃灭活30min，100℃沸水浴10min，冰上放置2min
后，12000r/min离心15min，取上清至另一1.5mL无菌离心管中，为DNA模板，用于核酸测序。可保存在一70℃备用。
B.1.2试剂盒提取纯化核酸法
按适用于革兰氏阳性细菌核酸提取的试剂盒说明书操作。B.2DNA序列测定
B.2.1用于扩增PCR的引物
扩增结核分枝杆菌16SrRNA，其片段大小460bp，设计引物.引物应用液浓度配制成100μmol/L进行储存，序列分别如下：
引物P1：5-TGGAGAGTTTGATCCT
GGCTCAG-3；
引物P2：5'-TACCGCGGCTGCTGGCAC-3B.2.2阳性对照和空白对照设置
检测过程中分别设阳性对照和空白对照。阳性对照为MTC菌株：空白对照用无菌水作为PCR反应的模板。
B.2.3扩增PCR反应体系组成
将引物储存液，配制成10μmol/L的工作液。扩增PCR反应体系采用以下参数：2×Mastermix10μL；引物P1和P2各2μL；ddHzO4μL，最后加DNA模板，约0.5ng，使反应总体积为20μL。B.2.4扩增PCR反应条件
扩增PCR反应条件：95℃预变性5min；（95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸45s）×25循环；72℃延伸7min；4℃保温。因不同PCR仪器的性能差异，可根据条件优化适当调整PCR退火温度和时间。
B.2.5无水乙醇沉淀纯化PCR产物PCR产物加入无菌纯水至50μL，再加人50μL酚：氯仿（1：1)，混匀。12000r/min离心8min，取上清转移到另一干净的0.6mL离心管中。无菌纯水补充体积到100μL，加人10μL（1/10体积）3mol/LpH5.2醋酸钠（NaAc)和200μL的无水乙醇（2倍体积），混匀。一20℃放置4h及以上。12000r/min离心15min，弃上清。加入500μL75%乙醇，混匀，12000r/min离心5min，弃上清，室6
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国境口岸结核分枝杆菌复合群鉴定方法IdentificationofMycobacterium tuberculosis complex atfrontierport2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草，本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局。SN/T4859—2017
本标准主要起草人：陆哗、王健、章琪、方筠、孟成艳、叶魏、查期、贾哲甫、张晓航、韩晓辉、周娴邱瑾。
SN/T4859—2017
近几年结核病实验室诊断新技术不断涌现，实现了快速而准确检测结核分枝杆菌及其耐药性的目标。目前我国依据《WS288一2008肺结核诊断标准》进行结核病诊断，其中结核病的实验室诊断仍主要依赖于痰标本涂片显微镜检查、传统的固体培养。显微镜检查敏感度较低，并且无法区分活性和非活性生物体，无法鉴别分枝杆菌类型。传统的固体培养基上，结核杆菌生长需要长达八周的时间，报告时间长。在无法及时确诊的情况下，适当的治疗被延迟。同时，实验室还需要快速而价廉的培养物鉴定方法用以区分结核分枝杆菌复合菌群和非结核分枝杆菌。WHO在结核病诊断方面的相关标准持续改进：将新的技术与方法恰当的纳人诊断方案，这也是有效采用新的诊断方法的先决条件之一。本标准在充分评估的基础上，规范了结核分枝杆菌实验室鉴定技术的应用路径，及综合判断方案。通过新技术的采用，提高了国境口岸肺结核病的防控效率。1范围
国境口岸结核分枝杆菌复合群鉴定方法SN/T4859—2017
本标准规定了国境口岸结核分枝杆菌复合群鉴定的生物安全要求、鉴定程序、鉴定方法、结果报告等内容。
本标准适用于国境口岸入出境人员感染结核分枝杆菌复合群的检测鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求结核病实验室生物安全手册世界卫生组织人间传染的病原微生物名录卫生部3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
结核分枝杆菌复合群Mycobacteriumtuberculosiscomplex；MTC传染性结核病的病原菌复合群，包括结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌。MTC的细菌呈杆状，菌体大小0.6μm×（1μm～4μm），抗酸染色阳性，革兰氏染色阳性。生长缓慢，约10h繁殖一代，据接种量的多少，10d～30d肉眼可见菌落生长。罗氏（Lowenstein-Jensen）培养基上的菌落粗糙、致密，呈颗粒、结节、或菜花样，乳白或米色，不透明。缩略语
下列缩略语适用于本文件。
PAGE（polyacrylamidegelelectrophoresis）：聚丙烯酰胺凝胶电泳TBE（Tris-Boricacid）：Tris-硼酸核酸电泳缓冲液bp(basepair)：碱基对
生物安全措施
根据WHO《结核病实验室生物安全手册》与GB19489和《人间传染的病原微生物名录》的要求，结核分枝杆菌复合群相关检测鉴定材料的生物安全要求如下：样本处理与检测应于生物安全二级（BSL-2)实验室，在IIA级或以上级别生物安全柜内进行；一大量活菌操作，如培养物鉴定，药敏检测等，应在生物安全三级（BSL-3)实验室或结核病防护实验室内的生物安全柜中进行。结核病防护实验室，是指在生物安全二级实验室基础上，实验1
SN/T4859—2017
区域与实验室外部由缓冲区域物理隔离，实验区域控制为单向气流；MTC的细菌培养物运输包装分类为A类，UN编号为UN2814；操作人员佩戴医用N95口罩，穿着一次性防护服，戴一次性医用橡胶手套，更换防水工作鞋；操作人员需要每年进行胸部X光检查、血清HIV检查。6仪器和设备
ⅡI级生物安全柜。
6.2电子天平。
水平冷冻离心机（离心力3500g以上）。37℃恒温培养箱。
荧光PCR仪。
水平电泳仪。
紫外成像仪。
100℃热浴仪。
正置光学显微镜。
微量加样器（2μL、20μL、200L、1000μ试剂和耗材
PCR反应体系（商品化试剂）。
0.067mmol/LpH6.8磷酸缓冲液（PBS)。N-乙酰-L-半胱氨酸（NALC)
无菌4%NaOH溶液。
无菌2.9%枸橡酸钠溶液
苯酚。免费标准bzxz.net
无水乙醇。
罗氏培养基。
革兰氏染色液。
抗酸染色液。
TBE电泳缓冲液。
DNA分子量标准（DNALadderMarker）。50mL无菌离心管。
实验室检查
生长周期检查
罗氏培养基上MTC的生长周期
痰标本中的MTC在罗氏培养基上生长，通常第3周以后开始出现肉眼可见的菌落8.1.2
7H9液体培养基中MTC的生长周期8.1.2.1
痰标本中的MTC在7H9液体培养基中生长，通常第14天左右出现显微镜下可见的菌落。SN/T4859—2017
8.1.2.2痰标本中的MTC数量多、繁殖旺盛时，接种后第4天左右出现显微镜下可见的菌落。通常液体培养样本接种后立即报告阳性的为其他污染细菌。8.2形态学检查
肉眼观察罗氏培养基上的菌落。MTC在罗氏培养基上是乳白或米色、不透明、粗糙、致密，呈颗粒、结节、或菜花样的菌落，单个菌落散在或聚集，参见图A.1和图A.2，也可见细小的菌落连成一片菌苔。
8.3抗酸染色检查
8.3.1痰涂片的抗酸染色及检查
痰涂片抗酸染色后在1000倍放大的正置光学显微镜下MTC呈红色的细长杆菌。部分红色菌体中可见浓染颗粒。可以一条散在，也可多条聚集，也可成团或成簇。参见图A.3和图A.4。
8.3.2罗氏培养基上MTC的抗酸染色及检查罗氏培养基上的MTC菌落涂片抗酸染色后，在1000倍放大的正置光学显微镜下呈成片的红色杆菌，密集成团。参见图A.5。
8.3.3液体培养基7H9中MTC的抗酸染色及检查液体培养基中的MTC涂片抗酸染色后，在1OO0倍放大的正置光学显微镜下呈致密、条索状的红色菌团。参见图A.6。
8.4免疫学鉴定方法
分泌蛋白的检测，能够确定培养基中是否含有结核分枝杆菌复合群。通过对液体培养基中MPB64
选用国家食品药品监督管理总局（CFDA）注册认证的商品试剂盒，按照说明书进行检测。8.5分子生物学鉴定方法
8.5.1MTC的实时荧光PCR检查
通过对痰液样本或培养物中结核分枝杆菌特异性核酸片段的检测，鉴定样本中是否含有结核分枝杆菌复合群。选用国家食品药品监督管理总局（CFDA）注册认证的商品试剂盒，按照说明书进行检测。8.5.2MTC的线性探针杂交固相膜显色检测通过扩增结核分枝杆菌16SrRNA特异性片断，扩增产物经过化学变性后，与带有探针固化的试纸条杂交，通过显色反应检测确定是否含有目的片段。选用国家食品药品监督管理总局（CFDA）注册认证的商品试剂盒，如：HainLifescience公司的GenoType（r）MTBDRplusl，按照说明书进行检测。8.5.3MTC的DNA序列测定及比对
参见附录B。
8.5.4MTC核酸及rpoB基因突变检测检测结核菌阳（涂片阳性或者细菌培养阳性）痰沉淀物样本中的结核分枝杆菌复合群特异性核酸片段和利福平耐药相关的rpoB基因突变，完成分枝杆菌鉴定及利福平耐药分析。选用国家食品药品监督管理总局（CFDA）注册认证的商品试剂盒，如：Cepheid公司的XpertMTB/RIF\），按照说明书进行3
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检测。
9MTC的鉴定及报告
痰液标本中MTC的鉴定和报告
显微镜下痰涂片中找到抗酸杆菌，痰液样本经8.5.1、8.5.2或8.5.4检测，获得阳性结果时，报告“检出结核分枝杆菌复合群”
9.2液体培养基中MTC的鉴定和报告9.2.1
符合8.1.2液体培养分枝杆菌生长规律，菌落形态符合8.3.3，可选择8.4或8.5中的方法进行鉴定。
9.2.2满足9.2.1应用8.4的方法鉴定时，如为阳性结果时，报告“检出结核分枝杆菌复合群”；为阴性结果时，进一步应用8.5的方法鉴定。9.2.3满足9.2.1应用8.5.1或8.5.2鉴定结果阳性时，报告“检出结核分枝杆菌复合群”。固体培养基上MTC的鉴定和报告
形态学检查符合8.2，涂片检查符合8.3.2，经8.5中任一种鉴定方法，结果阳性，报告“检出结核分枝杆菌复合群”。
9.4阴性报告
任何样本经罗氏培养基或液体培养基7H9培养8周后，无菌落生长，或培养物涂片检查未发现抗酸杆菌，或发现抗酸杆菌但采用8.5中任一种方法检测，结果为阴性时，报告“未检出结核分枝杆菌复合群”。
1）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。4
附录A
（资料性附录）
MTC的形态学特征
图A,1罗氏培养基上的MTC单个菌落图A.3>10条抗酸杆菌/视野
（抗酸染色，1000倍放大）
图A.5罗氏培养基上的MTC菌落涂片（抗酸染色，1000倍放大）
SN/T4859—2017
图A.2罗氏培养基上的MTC菌落形态图A.41条2条抗酸杆菌/视野
（抗酸染色，1000倍放大）
图A.6液体培养基中MTC菌落索状形态（抗酸染色，1000倍放大）
SN/T4859—2017
B.1细菌核酸提取
B.1.1热裂解法
附录B
（资料性附录）
MTC的DNA测序检测法
将放有细菌标本的1.5mL无菌离心管于80℃灭活30min，100℃沸水浴10min，冰上放置2min
后，12000r/min离心15min，取上清至另一1.5mL无菌离心管中，为DNA模板，用于核酸测序。可保存在一70℃备用。
B.1.2试剂盒提取纯化核酸法
按适用于革兰氏阳性细菌核酸提取的试剂盒说明书操作。B.2DNA序列测定
B.2.1用于扩增PCR的引物
扩增结核分枝杆菌16SrRNA，其片段大小460bp，设计引物.引物应用液浓度配制成100μmol/L进行储存，序列分别如下：
引物P1：5-TGGAGAGTTTGATCCT
GGCTCAG-3；
引物P2：5'-TACCGCGGCTGCTGGCAC-3B.2.2阳性对照和空白对照设置
检测过程中分别设阳性对照和空白对照。阳性对照为MTC菌株：空白对照用无菌水作为PCR反应的模板。
B.2.3扩增PCR反应体系组成
将引物储存液，配制成10μmol/L的工作液。扩增PCR反应体系采用以下参数：2×Mastermix10μL；引物P1和P2各2μL；ddHzO4μL，最后加DNA模板，约0.5ng，使反应总体积为20μL。B.2.4扩增PCR反应条件
扩增PCR反应条件：95℃预变性5min；（95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸45s）×25循环；72℃延伸7min；4℃保温。因不同PCR仪器的性能差异，可根据条件优化适当调整PCR退火温度和时间。
B.2.5无水乙醇沉淀纯化PCR产物PCR产物加入无菌纯水至50μL，再加人50μL酚：氯仿（1：1)，混匀。12000r/min离心8min，取上清转移到另一干净的0.6mL离心管中。无菌纯水补充体积到100μL，加人10μL（1/10体积）3mol/LpH5.2醋酸钠（NaAc)和200μL的无水乙醇（2倍体积），混匀。一20℃放置4h及以上。12000r/min离心15min，弃上清。加入500μL75%乙醇，混匀，12000r/min离心5min，弃上清，室6
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