SN/T 4876.3-2017.Method for DNA barcodeg-Part 3:Quarantine species of Tortricidae.
1范围
SN/T 4876.3规定了我国检疫性卷蛾的DNA条形码检测鉴定方法。
SN/T 4876.3适用于我国进境植物检疫性卷蛾DNA条形码的测定、结果的比对分析与判定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注8期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1DNA条形码DNA barcodes
一段短的、标准化的基因片段,用于区分不同的物种。该片段在种间存在明显的遗传变异和分化并容易进行PCR扩增。DNA条形码技术主要用于物种识别和新种发现。
3.2凭证标本Voucher specimens
DNA条形码的实物参考凭证,凭证标本信息包括馆藏信息、采集信息、鉴定信息,用于复核。模式标本是用于分类学研究的凭证标本。
3.3COI基因 CO I gene
线粒体基因组的蛋白质编码基因,全称为细胞色素c氧化酶亚基I (cytochrome c oxidase subunit I),由于该基因进化速率较快,常用于分析亲缘关系密切的种、亚种及地理种群之间的系统关系。
4检疫性卷蛾基本信息
中文名:卷蛾
学名:Tortricidae
英文名:Leafroller Moths, Tortricid Moths

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4876.3—2017
DNA条形码方法
第3部分：检疫性卷蛾
MethodforDNAbarcodeg
Part 3:Quarantine species of Tortricidae2017-11-07发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
涂尿查真
2018-06-01实施
SN/T4876《DNA条形码方法》共分为5个部分第1部分：检疫性乳白蚁；
第2部分：检疫性断眼天牛；
第3部分：检疫性卷蛾；
第4部分：检疫性高粱属；
一第5部分：曼陀罗属，
本部分为SN/T4876的第3部分。
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草SN/T4876.3—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局。
本部分主要起草人：钱路、安榆林、徐森锋、李艳华、叶兼菱、廖力、张卫东、徐梅、梁照文、李健、汤晓军、伏建国。
1范围
DNA条形码方法
第3部分：检疫性卷蛾
SN/T4876的本部分规定了我国检疫性卷蛾的DNA条形码检测鉴定方法。SN/T4876.3—2017
本部分适用于我国进境植物检疫性卷蛾DNA条形码的测定、结果的比对分析与判定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
DNAbarcodes
DNA条形码
一段短的、标准化的基因片段，用于区分不同的物种。该片段在种间存在明显的遗传变异和分化并容易进行PCR扩增。DNA条形码技术主要用于物种识别和新种发现。3.2
Voucherspecimens
凭证标本
DNA条形码的实物参考凭证，凭证标本信息包括馆藏信息、采集信息、鉴定信息，用于复核。模式标本是用于分类学研究的凭证标本。3.3
COI基因COI gene
线粒体基因组的蛋白质编码基因，全称为细胞色素c氧化酶亚基I（cytochromecoxidasesubunit工），由于该基因进化速率较快，常用于分析亲缘关系密切的种、亚种及地理种群之间的系统关系4检疫性卷蛾基本信息
中文名：卷蛾
学名：Tortricidae
英文名：LeafrollerMoths，TortricidMoths中国进境植物检疫性卷蛾包括11种：黑头长翅卷蛾Aclerisvariana（Fernald，1886）、荷兰石竹卷蛾Cacoecimorphapronubana（Hubner，1800）、云杉色卷蛾Choristoneurafumiferana（Clemens，1865）、苹果异形小卷蛾Thaumatotibia（Cryptophlebia）leucotreta（Meyrick，1913）、斜纹卷蛾Ctenopseustisobliquana（Walker，1863）、山楂小卷蛾Cydiajanthinana（Duponchel，1835）、樱小卷蛾GrapholitaSN/T4876.3—2017
（Cydia）packardiCydiapackardi（Zeller，1875）、苹果蛾Cydiapomonella（Linnaeus，1758）、杏小卷蛾Grapholita（Cydia）prunivora（Walsh，1868）、梨小卷蛾Cydiapyrivora（Danilevsky，1947）、葡萄花翅小卷蛾Lobesiabotrana（DenisetSchiffermuller，1775）。目前全世界已定名的卷蛾科种类有9800余种。卷蛾科种类寄主范围广泛，大部分为重要害虫，其幼虫常对农林生产造成严重的经济损失。5方法原理
根据卷蛾的COI序列特征，应用DNA条形码技术对检疫性卷蛾进行鉴定。6仪器设备、用具及试剂
仪器设备与用具
常规PCR仪、微量分光光度仪、电泳仪、凝胶成像系统、酸度计、测序仪、高速冷冻离心机、生物安全柜、烘箱、高压灭菌锅、解剖镜、天平（感量1/10000）、勺浆研磨器、摇床、水浴锅、制冰机、纯水仪、旋涡震荡器、70℃冰箱、冰箱、微量移液器(0.5μL,2μL,10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL）、PCR管(0.2mL,0.5mL)。
6.2主要试剂
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T6682要求。提取液A（1%SDS，50mmol/LTris·Cl，25mmol/LNaCl，25mmol/LEDTA）、提取液B（3mmol/LKAc)、Tris饱和酚、1）TE缓冲液、蛋白酶K、氯仿、异戊醇、异丙醇、75%乙醇、95%乙醇、RNaseA、10×PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、ErTag聚合酶、引物（见表1）、DL2000Marker、琼脂糖、溴化乙锭（EB）、PCR产物纯化试剂盒表1
目标基因
7DNA条形码测定
7.1核酸制备
引物名称
LCO1490
HCO2198
扩增引物
引物序列（543）
GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG
TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA
扩增片段
取蛾类头部、胸部肌肉和足（大约10mg）用于DNA提取，乙醇浸泡标本可先用蒸馏水漂洗干净；将样品置于1.5mL离心管中，加入600μL1XTE缓冲液，于56℃温浴2h，期间间歇振荡；弃掉TE缓冲液，加人200μL提取液A（含1%SDS，50mmol/LTris·Cl,25mmol/LNaCl,25mmol/LEDTA），放入匀浆研磨器研磨充分，振荡混匀后于65℃孵化45min取出后加人等体积提取液B[3mmol/LKAc（pH7.2)]，上下颠倒混匀后（动作要轻）于冰上放置1h；12000r/min离心15min，取上清液至新的1.5mL离心管中，加入2倍体积冰冻无水乙醇混匀放置一20℃冰箱1h沉淀DNA；12000r/min离心15min，弃上清，加人1mL75%酒精洗涤沉淀，12000r/min离心10min，晾干酒精后用100μL双蒸水溶解沉淀，一20℃保存备用。2
该核酸制备也可采用DNA提取试剂盒法。7.2DNA纯度与浓度的测定
SN/T4876.3-2017
用核酸蛋白分析仪测定DNA的纯度与浓度，分别取得260nm和280nm处的吸收值，计算核酸的纯度和浓度，计算公式如下：
DNA纯度=OD260/OD280
DNA浓度=50×OD260μg/mL
PCR级DNA溶液的OD260/OD280比值应为1.7~1.9。7.3PCR扩增与序列测定分析
7.3.1PCR扩增
PCR扩增反应为50μL每管，每体系μL10×PCR缓冲液（含Mg2+）、4μL的dNTP混合物（各10mmol/mL）、上下游引物各2μL（10μmol/mL）rTaqDNA聚合酶1μL（5U/μL），最后加ddHzO补充至总体积为48μL，再加2μLDNA模板，体系配好后进行PCR扩增。PCR反应条件为：94℃5min预变性；5个循环（94℃6045℃90s.
90s30个循环（94℃60s,50℃60s，72℃60s）；最后72℃5min延伸，结束后产物于4℃冰箱保存7.3.2琼脂凝胶电泳
取5μLPCR产物，在1.5%琼脂糖
拍照。
7.3.3PCR产物回收和克隆测序
行电泳，EB染色，凝胶成像系统观察、取剩余PCR扩增产物45μL，使用DNAA产物纯化回收试剂盒纯化回收产物，进行克隆测序。7.3.4DNA序列数据的处理
使用DNA测序仪对目的条带进行双向测序，PCR扩增引物作为测序引物，测序原理同Sanger测序法。为确保测序结果的可靠性，需对测序质量进行评估，去除测序结果两端的低质量序列，质量评估以碱基的Q值为依据。应用软件进行序列拼接，去除引物区，获得相应的DNA序列，序列方向应与PCR扩增正向引物方向一致。
8结果判定
8.1中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统判定登录中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统http：//qbol.org.cn，点击“物种识别”导航条，进人物种识别页面。在鉴定框内输人FASTA格式（或纯文本格式）序列后，点击“提交鉴定”，系统进行BLAST后，自动生成鉴定结果。相似度最高的10条序列为相同物种，且最大相似度在98%以上，可明确判定为该物种（参见附录A）；否则请辅以其他鉴定方法。8.2国际通用数据库判定
登录GenBank数据库BLAST鉴定系统（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），在BLAST结果中查看序列相似性最高的物种，COI基因序列结果与已知卷蛾种类基因序列相似性最高，相似度最高的10条序列为相同物种，且最大相似度在98%以上，可明确判定检出相应的卷蛾种类。常见的检疫3
SN/T4876.3—2017
性卷蛾种类COI基因序列表信息参见附录B。8.3
植物有害生物检疫鉴定系统判定登陆植物有害生物检疫鉴定系统（http：//www，exoticorganism.com/)，使用基因条码分析软件对查询序列进行分析比对，通过比对数据库中的鉴定特征，将符合该类群鉴定特征的且相似度为100%的物种判定为该未知种。“植物有害生物检疫鉴定系统”操作方法参见附录C。9标本与原始数据保存
9.1标本保存
采集到的标本应无水乙醇浸渍低温保存，并注明货物来源，寄主，采集时间、地点及采集者，保存期为1年，以备复验，如涉及贸易纠纷则须保存到纠纷解决完毕。保存期满后，按后期用途长久保存或处理。
原始数据保存
样品检测结束后，其原始记录单和检验报告或证书须归档，妥善保管，以备复验、谈判和仲裁。附录A
（资料性附录）
中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统操作方法中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统操作方法见图A.1、图A.2。中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统DNABARCODEAPPRAISALSYSTEMONCHINESEQUARANTINEPESTSSN/T4876.3—2017
收靠1进入管理系统
植物有害生物动物皮病医学媒介物中识别凭证标本首页
动物鉴定
[COI&TS]
高蓄鉴定
翁入fasta格式的厚列
TTTTAAT
植物鉴宝
rbct&matk&irs
AGAATTGTTGAAAU
美生物鉴定
关于我们
CGATCAAATTTATAATACTATTGTAACAGCTCATGCATIGAATAAATAATATAAGTTTTTGATTATTACCCCCCTCTATTATAATCTAATATTGCCCATAGCGGAAGTTCTGTTGATTTAGCTATTTTCTCTTTACATTTAGCTGGTATTTCATCAATTTAGGAGCAGTAAATTTTATTACCACAATTATTAATATACGACCTAATAATATATCTTTAGATCAAATACCCTTATTTGTGTGAGCTGTCGGAATTACTGCTTTATTGCTACTTTTATCTTTACCTGTATTAGCTGGTGCATTACTATATTATTAACTGATCGAAATTTAA提交鉴定
GATCCAATTTTATATCAACATTTATTT
图A.1物种识别页面
中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统DNAARCODEAPPRAISALSYSTEMONCHINESEQUARANTINEPESTS首页
序列离码
LBCH2599-10
LBCH2857-10
LBCH2593-10
CNELD157-14
CNKLD2203
NGAAB057-14
XAH442-05
XAG329-05
XAG626-05
植物有请生物
Arthropoda
Arthropoda
Arthropoda
Arthropoda
Arthropoda
Arthropoda
Arthropoda
Arthropoda
Arthropoda
Insecta
Insecta
Insecta
Insecta
Insecta
Insecta
Insecta
Insecta
Insecta
动物度病
Lepidoptera
Lepidoptera
Lepidoptera
Lepidoptera
Lepidoptera
Lepidoptera
Lepidoptera
Lepidoptera
Lepidoptera
医学媒介
相假样本整定结军
Tortnicidae
Tortricidae
Tortricidae
Tortricidae
Tortricidae
Tortricidae
Tortricidae
Tortricidae
Tortricidae
Acleris
Acleris
Acleris
Acleris
Acleris
Acleris
Acleris
Acleris
Acleris
物种识别
Aclens
variana
Aclenis
variana
Acleris
variana
Acleris
variana
Acieris
varian3
Aclenis
variana
Aclens
variana
Aclenis
variana
Aclenis
vaniana
鉴定结果页面
Aclens
凭证标车
相假康
遗传标记
COI-SP
cot-SP
COI-SP
Col-SP
col-sp
cot-sp
col-5P
cot-sp
col-SP
关于我们
E-Value
SN/T4876.3—2017
附录B
（资料性附录）
检疫性卷蛾种类COI序列
表B.1给出了检疫性卷蛾种类COI序列信息。表B.1检疫性卷蛾种类COI序列信息中文名
黑头长翅卷蛾
云杉色卷蛾
苹果异形小卷蛾
斜纹卷蛾
苹果蠹蛾
樱小卷蛾
杏小卷蛾
葡萄花翅小卷蛾
荷兰石竹卷蛾
Acleris variana
Choristoneura fumiferar
Thaumatotibia
(Cryptophlebia) leucotreta
Ctenopseustis obliquana
Cydia pomonella
Grapholita（Cydiapae
Grapholita（C
prunivora
Lobesia botrana
Cacoecimorpha pronubana
KM553720.KM5534
HQ106463.HQ10646
HQ106479
GenBank登录号
，KM552950,KM549898,KM545885，，HM864666,HM864372HM864349，GQ890282.KM555028，KM554419,KM551965，KM540817801,GU096711，GU096705，HQ106918，HQ106911GU4388
06903.GQ890279
KM352504,KM35250
KM352502
AF016481，FJ225475，FJ225480AF016470，FJ225580，FJ225576，FJ225573J225568.FJ225
KM572180.KF491664
JF8598
4，GU093187
KP072620,KJ789223
49966，KR44931
095866
728154
1U09586
KT619459.
KF405693，JQ027368，JQ027363，GU091041，GU095782，KP072623,KR455483，KF491773，GU095867，FJ412592，AY728156，AY728155,8153，AY728152，AY728151，AY728150,AY728149,AY728148
KP677508,NC_029193
LC031966,LC031967,LC031968,LC031969LC031970,LC031971,LC031972,LC031973LC031974,LC031975,JF703047
附录C
（资料性附录）
植物有害生物检疫鉴定系统操作方法SN/T4876.3—2017
登录植物有害生物检疫鉴定系统（http：//exoticorganism.com/），首页选择“基因条码”模块，在“输人比对的序列”窗口中粘贴查询序列。点击“比对”，软件会在数据库范围内比对，输出物种鉴定结果。结果中相似性最高的条码序列对应分类阶元为查询序列所属分类阶元。在“更多比对结果”里，点击“开始对比”，将符合该类群鉴定特征的且相似度为100%的物种判定为该未知种，以黑头长翅卷蛾Aclerisvarian
为例，在“输人比对的序列”窗口中粘贴COI基因片段，点击“比对”，结果见图C.1，相似性最高的条码序列对应分类阶元为长翅卷蛾属Acleris，相似性为100%。在这
一栏点击“开始对比”，结果见图C.2，相似度为100%的序列对应物种为黑头长翅卷蛾A.ariana，即可判定查询序列为该物种。
植物有害生物检疫鉴定系统
教字标木辅助蒸定平全
最新公告：
陆“我的平台”，在“数字标本”下方说为有”
基风医仁本有生物身
“我更上信急重上传样本乱片和相关携息翰入比对的序列：CCAGGTATAGTTGGAACTTCTTTAAGATTAATTATAATTTTTTTTATAGTAATACCTATTATTTTGATTACTACCCCCCTCTATTATACTTTTAATCTCAAGAAGAATTGTCGAAGTTCTGTTGATTTAGCTATTTTCTCTTTACATTGGTATTTCAT
TTAGATCAAATACCCTTATTTGTGTGAGCTGT序比对结果
分类附元
长组登续黑Acleris
树蜂科Sirieidae
小条买黑Ceratits
钉螺科Aretiidae
时图sirex
小e级属cyd
色e纸属Cherist
异形小卷绿属
ryptophlebs
花现小老爆黑
标准条码名
长继誉综属
附科Ssrieid
CerstitisCom
美国白螺及近伴
树sire
小蒙蝶属cyd
色卷炕属chon
异街小便绿黑
Cryptepklebi
花通小卷绿围Lobe
IGCTTTATTO
1(5-AT
PF1(5-A
GATATTGC-Le
TATTPCL
TAAAGATATT
TATTGTAACAGCTCATCCATT
AATRTAAG
TTTCATCTAATATTGCCCATAG
TATTACCACAATTATTAATATACGACCTAATAATATATCT下幕引物
AAATCA
TTCTGGATGTCCAAAAAATCA-
CTTCTGGATGTCCAAAAATCA
女靠菱
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黑头长翅卷蛾Aclerisvariana在条码数据库分类阶元中的比对结果开始批
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开数比
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