SN/T 4876.2-2017
基本信息
标准号： SN/T 4876.2-2017
中文名称：DNA条形码方法第2部分:检疫性断眼天牛
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.zip .pdf
下载大小：4208409
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4876.2-2017.Method for DNA barcode-Part 2 :Quarantine Tetropium spp.
1范围
SN/T 4876.2规定了我国检疫性断眼天牛的DNA条形码检测鉴定方法。
SN/T 4876.2适用于我国进境植物检疫性断眼天牛DNA条形码的测定、结果的比对分析与判定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 2013暗 褐断眼天牛检疫鉴定方法
3术语 和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1DNA条形码 DNA barcode
一段短的、标准化的基因片段,用于区分不同的物种。该片段在种间存在明显的遗传变异和分化并容易进行PCR扩增。DNA条形码技术主要用于物种识别和新种发现。
3.2凭证标本voucher specimen
DNA条形码的实物参考凭证,凭证标本信息包括馆藏信息、采集信息、鉴定信息,用于复核。模式标本是用于分类学研究的凭证标本。
3.3 COI基因
COIgene线粒体基因组的蛋白质编码基因,全称为细胞色素c氧化酶亚基I(cytochromecoxi-dase subunit I ),由于该基因进化速率较快,常用于分析亲缘关系密切的种、亚种及地理种群之间的系统关系。
1范围
SN/T 4876.2规定了我国检疫性断眼天牛的DNA条形码检测鉴定方法。
SN/T 4876.2适用于我国进境植物检疫性断眼天牛DNA条形码的测定、结果的比对分析与判定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 2013暗 褐断眼天牛检疫鉴定方法
3术语 和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1DNA条形码 DNA barcode
一段短的、标准化的基因片段,用于区分不同的物种。该片段在种间存在明显的遗传变异和分化并容易进行PCR扩增。DNA条形码技术主要用于物种识别和新种发现。
3.2凭证标本voucher specimen
DNA条形码的实物参考凭证,凭证标本信息包括馆藏信息、采集信息、鉴定信息,用于复核。模式标本是用于分类学研究的凭证标本。
3.3 COI基因
COIgene线粒体基因组的蛋白质编码基因,全称为细胞色素c氧化酶亚基I(cytochromecoxi-dase subunit I ),由于该基因进化速率较快,常用于分析亲缘关系密切的种、亚种及地理种群之间的系统关系。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4876.2—2017
DNA条形码方法
第2部分：检疫性断眼天牛
MethodforDNAbarcode-Part2:QuarantineTetropium spp2017-11-07发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-06-01实施
SN/T4876《DNA条形码方法》共分为5个部分：第1部分：检疫性乳白蚁；
第2部分：检疫性断眼天牛；
第3部分：检疫性卷蛾；
第4部分：检疫性高梁属；
第5部分：曼陀罗属；
本部分为SN/T4876的第2部分。
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草SN/T4876.2—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局本部分主要起草人：徐梅、钱路、吴晶、禹海鑫、叶兼菱、季琴琴、朱林娟、杨晓军、郑斯竹、安榆林。1
1范围
DNA条形码方法
第2部分：检疫性断眼天牛
SN/T4876.2—2017
SN/T4876的本部分规定了我国检疫性断眼天牛的DNA条形码检测鉴定方法。本部分适用于我国进境植物检疫性断眼天牛DNA条形码的测定、结果的比对分析与判定。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2013暗褐断眼天牛检疫鉴定方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
乌DNAbarcode
DNA条形码
段短的、标准化的基因片段，用于区分不同的物种。该片段在种间存在明显的遗传变异和分化并容易进行PCR扩增。DNA条形码技术主要用于物种识别和新种发现。3.2
voucherspecimen
凭证标本
DNA条形码的实物参考凭证，凭证标本信息包括馆藏信息、采集信息、鉴定信息，用于复核。模式标本是用于分类学研究的凭证标本。3.3
COI基因
COIgene线粒体基因组的蛋白质编码基因，全称为细胞色素c氧化酶亚基I（cytochromecoxidase subunitI），由于该基因进化速率较快，常用于分析亲缘关系密切的种、亚种及地理种群之间的系统关系。
检疫性断眼天牛基本信息
中文名：断眼天牛
学名：Tetropiumspp.
分类地位：鞘翅目Coleoptera，叶甲总科Chrysomeloidea，天牛科Cerambycidae，断眼天牛属Tetropium
断眼天牛是一类重要的蛙干害虫，该属中的绝大多数种类均严重危害针叶木，偶尔也可危害周叶木。其主要分布于欧亚大陆及美洲，在古北区分布有7种，北美有6种。我国检疫性断眼天牛种类主要有暗褐断眼天牛（T.fuscum）、棕翅断眼天牛（T.cinnamopterum）、落叶松断眼天牛（T.gabrieli）、施氏1
SN/T4876.2—2017
断眼天牛（T.schwarzianum）、铁杉断眼天牛（T.velutinum）、小红棕断眼天牛（T.paruulum）等。5方法原理
根据断眼天牛的COI序列特征，应用DNA条形码技术对检疫性断眼天牛进行鉴定。6仪器用具和试剂
6.1仪器
常规PCR仪、微量分光光度仪、电泳仪、凝胶成像系统、测序仪、高速冷冻离心机、生物安全柜、烘箱、高压灭菌锅、显微镜、解镜、天平（感量1/10000）、研钵、摇床、水浴锅、制冰机、纯水仪、旋涡震荡器、冰箱、微量移液器（2μL，10μL,20μL，100μL，200μL，1000μL)、PCR管（0.2mL0.5mL）。6.2主要试剂
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。提取液A（含1%SDS50mmol/L提取液B3mmol/LKAc，Tris·Cl25mmol/LNaCl,25mmol/LEDTA）、5mol/L醋酸钾（KAc)、Tris 饱和酚、蛋白酶K、氯仿、异戊醇、异丙醇、75%乙醇、95%乙醇、液氮、10XPCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、ExTaq聚合酶、引物（见表1)、DL2000Marker、琼脂糖、溴化乙锭（EB)。
7DNA条形码鉴定
7.1核酸的制备
采用磁珠法提取基因组DNA。提取步骤为：将酒精浸泡的虫体，选择适当大小的肌肉组织，用双蒸水进行冲洗，去除残余的酒精，冲洗干净后，将组织进行研磨，加入180μL裂解液及20μL蛋白酶K，55℃温浴，使得组织完全裂解
人200uL缓冲液、200μL无水乙醇及20μL磁珠，使DNA吸附到磁珠上，使用500μLWashBuffer进行除杂，之后加人20uL的ElutionBuffer将DNA溶解，得到基因组DNA溶液，于一20℃保存
7.2DNA纯度与浓度的测定
用核酸蛋白分析仪测定DNA的纯度与浓度，分别取得260nm和280nm处的吸收值，计算核酸的纯度和浓度，计算公式如下：
DNA纯度=OD260/OD280
DNA浓度=50XOD260μg/mL
PCR级DNA溶液的OD260/OD280比值应为1.71.9。7.3PCR检测
7.3.1PCR扩增引物
PCR扩增推荐使用巢式引物：J173/N1331为第1轮引物，J1718/N2191为第2轮引物。见表1。2
目标基因
表1扩增引物
引物序列
J173(5-TAACAGCACATGCTTTTGTA-3'）N1331(5-GGATAGTCTGAGTATCGTCG-3）J1718(5-GGAGGATTTGGAAATTGATTAGTTCC-3')N2191(5'-CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3'）7.3.2PCR扩增体系和反应条件
SN/T4876.2—2017
扩增片段
1000bp
PCR扩增采用25μL标准反应体系：1oX反应缓冲液2.5μL，25mmo1/L的MgClz2μL10mmol/L的dNTPs2μL，TagDNA聚合酶1U，上游引物为0.5μL，下游引物为0.5uL，DNA模板1μL后加ddHO
至终体积25μL。反应条件为：94℃预变性2min；进人循环，94℃变性30s，第1轮引物退火温度为55℃/第2轮引物退火温度为47℃30s，72℃延个循环；72℃延伸10min。
伸1min.35
7.3.3琼脂凝胶电泳
反应结束后取扩增产物5μL，采用1.5%的琼脂糖凝胶，1X电泳缓冲液TAE，在稳压150V下电泳约30min，EB染色，凝胶成像系统观察、拍照7.3.4测序
使用DNA测序仪对目的条带进行又向测序，PCR扩增引物作为测序引物，测序原理同Sanger测序法。为确保测序结果的可靠性，需质量进行评估，去除测序结果两端的低质量序列，质量评估对测序
以碱基的Q值为依据。应用软件进行序列拼接，去除引物区，获得相应的DNA序列，序列方向应与PCR扩增正向引物方向一致。
8结果判定
中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统判定8.1
登录中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统http：/qbol.org.cn，点击“物种识别”导航条，进入物种识别页面。在鉴定框内输入PASTA格式（或纯文本格式）序列后，点击“提交鉴定”，系统进行BLAST后，自动生成鉴定结果。相似度最高的10条序列为相同物种，且最大相似度在98%以上，可明确判定为该物种（参见附录A)；否则辅以SN/T2013等其他鉴定方法8.2国际通用数据库判定
登录GenBank数据库BLAST鉴定系统（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），在BLAST结果中查看序列相似性最高的物种，COI基因序列结果与已知卷蛾种类基因序列相似性最高，相似度最高的10条序列为相同物种，且最大相似度在98%以上，可明确判定检出相应的断眼天牛种类。常见的检疫性卷蛾种类COI基因序列表信息参见附录B。8.3植物有害生物检疫鉴定系统判定登陆植物有害生物检疫鉴定系统（http：//exoticorganism.com/），使用基因条码分析软件对查询序列进行分析比对，通过比对数据库中的鉴定特征，将符合该类群鉴定特征的且相似度为100%的3
SN/T 4876.2—2017
物种判定为该未知种。“植物有害生物检疫鉴定系统”操作方法参见附录C。标本与原始数据保存
9.1标本保存
采集到的标本应无水乙醇浸渍低温保存，并注明货物来源，寄主，采集时间、地点及采集者，保存期为1年，以备复验，如涉及贸易纠纷则须保存到纠纷解决完毕。保存期满后，按后期用途长久保存或处理。
原始数据保存
样品检测结束后，其原始记录单和检验报告或证书须归档，妥善保管，以备复验、谈判和仲裁。4
附录A
（资料性附录）
中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统操作方法中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统操作方法见图A.1和图A.2。中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统SN/T4876.2—2017
收茶|进入驾理系境
DNABARCODEAPPRAISALSYSTEMONCHINESEQUARANTINEPESTS医学媒介物中识别凭证标车关于我们百员
[COI&(TS)
植物有害生物
动物变病
真菌家定
输入fasta格式的席列
植物管室
[rbct&matK&iTs
诞生物堂定
GGATCAAAAAATGATGTATTAATATTACGATCAGTTAATAGTATAGTAATAGCACCAGCTAGTACAGGTAAAGAGATAAGTAATAAAATTGTGGTAATTATTACTGCTCATACAAATAGCGGTATTTGATCTAAGGTTATATTTAGGTCGTATATTTATAA
CAATATTT
TGTTCAACCAGTTCCTGCTCCTTTTTCAACAATTATTCCTATAATTAAAGAATTAATGACGGAGGTAGAACCAAATCTTAAATTGTTTAGTCGAGAATGATATATCGGGTGCTCCCAACATTAAAGGAACTAATCA提交整定
O2012-2015
中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统A
物种识别页面
收！进入管理系编
DNABARCODEAPPRAISALSYSTEMONCHINESEQUARANTINEPESTS首币植物有害生物
动物疫病
序列离码
PSFOR166-13
Arthropoda
PSFOR432-13下载标准就来标准下载网
Arthropoda
COLFF288-13 Arthropoda
COLFE640-13
GBCQU2933
COLFE066-12
UAMIC1091:
Arthropoda
Arthropoda
Arthropoda
Arthropoda
Insecta
Insecta
Insecta
Insecta
Insecta
Insecta
Insecta
Coleoptera
Coleoptera
Coleoptera
Coleoptera
Coleoptera
Coleoptera
Coleoptera
医学媒介
相取样本鉴定结果
Cerambycidae
Cerambycidae
Cerambycida4
Cerambycidae
Cerambvcidad
Cerambycadae
Tetropium
Tetropium
Tetropium
Tetropium
Tetropium
Tetropium
Tetropium
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Tetropium
castaneum
Tetroprum
castaneum
Tetropium
auonun
Tetropium
castaneum
Tetroprum
castaneum
Tetropium
castaneum
Tetropium
parvulun
鉴定结果页面
造传标记
cOI-5P
cot-5P
COl-5P
cOI-5P
COI-5P
CO1-5P
E-value
3.32477e-
SN/T4876.2—2017
附录B
（资料性附录）
检疫性断眼天牛种类COI序列
表B.1给出常见断眼天牛种类COI序列信息。表B.1
常见断眼天牛种类COI序列信息
中文名
光胸断眼天牛
棕翅断眼天牛
暗褐断眼天牛
落叶松断眼天牛
凹胸断眼天牛
施氏断眼天牛
铁杉断眼天牛
小红棕断眼天牛
云杉断眼天牛
Tetropium castaneum
Tetropium cinnamopterum
Tetropiumfu
Tetropium gabrieli
Tetropium staudingeri
Tetropium schwarg
Tetropium
Lutinum
Tetropium
parvulum
Tetropium
gracilic
GenBank登录号
，KM442637，KJ966635
KM286215.KM286148
KJ964513JQ015116
KJ966041.KJ964598,1
KJ159167.GU003935
AY389470,AY389469
KR123277.KM84673
34KF247308,AY389471，
AY389472AY389473,AY389474
KJ9651
，KJ964282,KJ962552,KF247309，003936,AY389481,AY389480,AY389479，AY389477-AY389476,AY389475
KM451264.KF247310
EU883935.AY389483
AY389489.AY389488
EU883937,EU883936
AY389482
EU883940.AY389487.AY389486
KF247311.AY389491
，AY389490,KF247248
AY389485,AY389484
EU883938
附录C
（资料性附录）
植物有害生物检疫鉴定系统操作方法SN/T4876.2—2017
登录植物有害生物检疫鉴定系统（http：//exoticorganism.com/），首页选择“基因条码”模块，在“输入比对的序列”窗口中粘贴查询序列。点击“比对”，软件会在数据库范围内比对，输出物种鉴定结果。结果中相似性最高的条码序列对应分类阶元为查询序列所属分类阶元。在“更多比对结果”里，点击“开始对比”，将符合该类群鉴定特征的且相似度为100%的物种判定为该未知种。以光胸断眼天牛Tetropiumcastaneum为例.在“输入比对的序列”窗口中粘贴COI基因片段，点击“比对”，结果见图C.1，相似性最高的条码序列对应分类阶元为断眼天牛属Tetropium，相似性为100%。在这一栏点击“开始对比”，结果见图C.2，相似度为100%的序列对应物种为光胸断眼天牛T.castaneum，即可判定查询序列为该物种植物有害生物检疫鉴定系统
数字标本
最新公告，
输入比对的序列：CGATCM
ATGTATTAATATT
ACGTTA
AATFATT
TTAAAT
床比对结果
分类附元
维明天牛黑 Tetropiu
量天牛尾
小靠属
eelytus
esirieid
大小寿
树蜂国sire
天牛Akrhepdur
天小黑u
弗天牛鼠herse
墨天牛国n
Pissedes
标准杂码名称
Tetrepiu
需天牛鼠
jseolyt
中安科Sirte
黑天牛鼠
特用siren
衡天牛厘
干小香黑
弗天牛国rh
墨天牛国es
水亮象黑Piss
TOCTGAT
TOM152
光胸断眼天牛Tetropiun
为首员
请先注册球“我的平台”，在“献字标本AGTAATAAAATTGTGGTAATTATTACTGCTCATACAATGGATGAAATTCCTGCTAAATGTAAACTAAAATATTTTCAACAATTATTCCTATAATTAAAAGAATTAATTCA
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下猫引物
CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC
TAGTGATTGCTCC-3)
EOOTOO
GTGATTGCTGE-3
GGTAAAATTATANAAA
点击童看
点击查看
点市声看
点违重器
点击查看
点击查看
点违意看
点击童看
点击置看
点击查看
点击置香
staneum在条码数据库分类阶元中的比对结果开始对比
开始对比
开始对比
开始对比
开数对比
开数对比
开检对比
并始对比
开教对比
开始对批
开始对比
开数对比
开趋对比
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DNA条形码方法
第2部分：检疫性断眼天牛
MethodforDNAbarcode-Part2:QuarantineTetropium spp2017-11-07发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-06-01实施
SN/T4876《DNA条形码方法》共分为5个部分：第1部分：检疫性乳白蚁；
第2部分：检疫性断眼天牛；
第3部分：检疫性卷蛾；
第4部分：检疫性高梁属；
第5部分：曼陀罗属；
本部分为SN/T4876的第2部分。
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草SN/T4876.2—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局本部分主要起草人：徐梅、钱路、吴晶、禹海鑫、叶兼菱、季琴琴、朱林娟、杨晓军、郑斯竹、安榆林。1
1范围
DNA条形码方法
第2部分：检疫性断眼天牛
SN/T4876.2—2017
SN/T4876的本部分规定了我国检疫性断眼天牛的DNA条形码检测鉴定方法。本部分适用于我国进境植物检疫性断眼天牛DNA条形码的测定、结果的比对分析与判定。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2013暗褐断眼天牛检疫鉴定方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
乌DNAbarcode
DNA条形码
段短的、标准化的基因片段，用于区分不同的物种。该片段在种间存在明显的遗传变异和分化并容易进行PCR扩增。DNA条形码技术主要用于物种识别和新种发现。3.2
voucherspecimen
凭证标本
DNA条形码的实物参考凭证，凭证标本信息包括馆藏信息、采集信息、鉴定信息，用于复核。模式标本是用于分类学研究的凭证标本。3.3
COI基因
COIgene线粒体基因组的蛋白质编码基因，全称为细胞色素c氧化酶亚基I（cytochromecoxidase subunitI），由于该基因进化速率较快，常用于分析亲缘关系密切的种、亚种及地理种群之间的系统关系。
检疫性断眼天牛基本信息
中文名：断眼天牛
学名：Tetropiumspp.
分类地位：鞘翅目Coleoptera，叶甲总科Chrysomeloidea，天牛科Cerambycidae，断眼天牛属Tetropium
断眼天牛是一类重要的蛙干害虫，该属中的绝大多数种类均严重危害针叶木，偶尔也可危害周叶木。其主要分布于欧亚大陆及美洲，在古北区分布有7种，北美有6种。我国检疫性断眼天牛种类主要有暗褐断眼天牛（T.fuscum）、棕翅断眼天牛（T.cinnamopterum）、落叶松断眼天牛（T.gabrieli）、施氏1
SN/T4876.2—2017
断眼天牛（T.schwarzianum）、铁杉断眼天牛（T.velutinum）、小红棕断眼天牛（T.paruulum）等。5方法原理
根据断眼天牛的COI序列特征，应用DNA条形码技术对检疫性断眼天牛进行鉴定。6仪器用具和试剂
6.1仪器
常规PCR仪、微量分光光度仪、电泳仪、凝胶成像系统、测序仪、高速冷冻离心机、生物安全柜、烘箱、高压灭菌锅、显微镜、解镜、天平（感量1/10000）、研钵、摇床、水浴锅、制冰机、纯水仪、旋涡震荡器、冰箱、微量移液器（2μL，10μL,20μL，100μL，200μL，1000μL)、PCR管（0.2mL0.5mL）。6.2主要试剂
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。提取液A（含1%SDS50mmol/L提取液B3mmol/LKAc，Tris·Cl25mmol/LNaCl,25mmol/LEDTA）、5mol/L醋酸钾（KAc)、Tris 饱和酚、蛋白酶K、氯仿、异戊醇、异丙醇、75%乙醇、95%乙醇、液氮、10XPCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、ExTaq聚合酶、引物（见表1)、DL2000Marker、琼脂糖、溴化乙锭（EB)。
7DNA条形码鉴定
7.1核酸的制备
采用磁珠法提取基因组DNA。提取步骤为：将酒精浸泡的虫体，选择适当大小的肌肉组织，用双蒸水进行冲洗，去除残余的酒精，冲洗干净后，将组织进行研磨，加入180μL裂解液及20μL蛋白酶K，55℃温浴，使得组织完全裂解
人200uL缓冲液、200μL无水乙醇及20μL磁珠，使DNA吸附到磁珠上，使用500μLWashBuffer进行除杂，之后加人20uL的ElutionBuffer将DNA溶解，得到基因组DNA溶液，于一20℃保存
7.2DNA纯度与浓度的测定
用核酸蛋白分析仪测定DNA的纯度与浓度，分别取得260nm和280nm处的吸收值，计算核酸的纯度和浓度，计算公式如下：
DNA纯度=OD260/OD280
DNA浓度=50XOD260μg/mL
PCR级DNA溶液的OD260/OD280比值应为1.71.9。7.3PCR检测
7.3.1PCR扩增引物
PCR扩增推荐使用巢式引物：J173/N1331为第1轮引物，J1718/N2191为第2轮引物。见表1。2
目标基因
表1扩增引物
引物序列
J173(5-TAACAGCACATGCTTTTGTA-3'）N1331(5-GGATAGTCTGAGTATCGTCG-3）J1718(5-GGAGGATTTGGAAATTGATTAGTTCC-3')N2191(5'-CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3'）7.3.2PCR扩增体系和反应条件
SN/T4876.2—2017
扩增片段
1000bp
PCR扩增采用25μL标准反应体系：1oX反应缓冲液2.5μL，25mmo1/L的MgClz2μL10mmol/L的dNTPs2μL，TagDNA聚合酶1U，上游引物为0.5μL，下游引物为0.5uL，DNA模板1μL后加ddHO
至终体积25μL。反应条件为：94℃预变性2min；进人循环，94℃变性30s，第1轮引物退火温度为55℃/第2轮引物退火温度为47℃30s，72℃延个循环；72℃延伸10min。
伸1min.35
7.3.3琼脂凝胶电泳
反应结束后取扩增产物5μL，采用1.5%的琼脂糖凝胶，1X电泳缓冲液TAE，在稳压150V下电泳约30min，EB染色，凝胶成像系统观察、拍照7.3.4测序
使用DNA测序仪对目的条带进行又向测序，PCR扩增引物作为测序引物，测序原理同Sanger测序法。为确保测序结果的可靠性，需质量进行评估，去除测序结果两端的低质量序列，质量评估对测序
以碱基的Q值为依据。应用软件进行序列拼接，去除引物区，获得相应的DNA序列，序列方向应与PCR扩增正向引物方向一致。
8结果判定
中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统判定8.1
登录中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统http：/qbol.org.cn，点击“物种识别”导航条，进入物种识别页面。在鉴定框内输入PASTA格式（或纯文本格式）序列后，点击“提交鉴定”，系统进行BLAST后，自动生成鉴定结果。相似度最高的10条序列为相同物种，且最大相似度在98%以上，可明确判定为该物种（参见附录A)；否则辅以SN/T2013等其他鉴定方法8.2国际通用数据库判定
登录GenBank数据库BLAST鉴定系统（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），在BLAST结果中查看序列相似性最高的物种，COI基因序列结果与已知卷蛾种类基因序列相似性最高，相似度最高的10条序列为相同物种，且最大相似度在98%以上，可明确判定检出相应的断眼天牛种类。常见的检疫性卷蛾种类COI基因序列表信息参见附录B。8.3植物有害生物检疫鉴定系统判定登陆植物有害生物检疫鉴定系统（http：//exoticorganism.com/），使用基因条码分析软件对查询序列进行分析比对，通过比对数据库中的鉴定特征，将符合该类群鉴定特征的且相似度为100%的3
SN/T 4876.2—2017
物种判定为该未知种。“植物有害生物检疫鉴定系统”操作方法参见附录C。标本与原始数据保存
9.1标本保存
采集到的标本应无水乙醇浸渍低温保存，并注明货物来源，寄主，采集时间、地点及采集者，保存期为1年，以备复验，如涉及贸易纠纷则须保存到纠纷解决完毕。保存期满后，按后期用途长久保存或处理。
原始数据保存
样品检测结束后，其原始记录单和检验报告或证书须归档，妥善保管，以备复验、谈判和仲裁。4
附录A
（资料性附录）
中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统操作方法中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统操作方法见图A.1和图A.2。中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统SN/T4876.2—2017
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DNABARCODEAPPRAISALSYSTEMONCHINESEQUARANTINEPESTS医学媒介物中识别凭证标车关于我们百员
[COI&(TS)
植物有害生物
动物变病
真菌家定
输入fasta格式的席列
植物管室
[rbct&matK&iTs
诞生物堂定
GGATCAAAAAATGATGTATTAATATTACGATCAGTTAATAGTATAGTAATAGCACCAGCTAGTACAGGTAAAGAGATAAGTAATAAAATTGTGGTAATTATTACTGCTCATACAAATAGCGGTATTTGATCTAAGGTTATATTTAGGTCGTATATTTATAA
CAATATTT
TGTTCAACCAGTTCCTGCTCCTTTTTCAACAATTATTCCTATAATTAAAGAATTAATGACGGAGGTAGAACCAAATCTTAAATTGTTTAGTCGAGAATGATATATCGGGTGCTCCCAACATTAAAGGAACTAATCA提交整定
O2012-2015
中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统A
物种识别页面
收！进入管理系编
DNABARCODEAPPRAISALSYSTEMONCHINESEQUARANTINEPESTS首币植物有害生物
动物疫病
序列离码
PSFOR166-13
Arthropoda
PSFOR432-13下载标准就来标准下载网
Arthropoda
COLFF288-13 Arthropoda
COLFE640-13
GBCQU2933
COLFE066-12
UAMIC1091:
Arthropoda
Arthropoda
Arthropoda
Arthropoda
Insecta
Insecta
Insecta
Insecta
Insecta
Insecta
Insecta
Coleoptera
Coleoptera
Coleoptera
Coleoptera
Coleoptera
Coleoptera
Coleoptera
医学媒介
相取样本鉴定结果
Cerambycidae
Cerambycidae
Cerambycida4
Cerambycidae
Cerambvcidad
Cerambycadae
Tetropium
Tetropium
Tetropium
Tetropium
Tetropium
Tetropium
Tetropium
初中识别凭证标车关于我们
Tetropium
castaneum
Tetroprum
castaneum
Tetropium
auonun
Tetropium
castaneum
Tetroprum
castaneum
Tetropium
castaneum
Tetropium
parvulun
鉴定结果页面
造传标记
cOI-5P
cot-5P
COl-5P
cOI-5P
COI-5P
CO1-5P
E-value
3.32477e-
SN/T4876.2—2017
附录B
（资料性附录）
检疫性断眼天牛种类COI序列
表B.1给出常见断眼天牛种类COI序列信息。表B.1
常见断眼天牛种类COI序列信息
中文名
光胸断眼天牛
棕翅断眼天牛
暗褐断眼天牛
落叶松断眼天牛
凹胸断眼天牛
施氏断眼天牛
铁杉断眼天牛
小红棕断眼天牛
云杉断眼天牛
Tetropium castaneum
Tetropium cinnamopterum
Tetropiumfu
Tetropium gabrieli
Tetropium staudingeri
Tetropium schwarg
Tetropium
Lutinum
Tetropium
parvulum
Tetropium
gracilic
GenBank登录号
，KM442637，KJ966635
KM286215.KM286148
KJ964513JQ015116
KJ966041.KJ964598,1
KJ159167.GU003935
AY389470,AY389469
KR123277.KM84673
34KF247308,AY389471，
AY389472AY389473,AY389474
KJ9651
，KJ964282,KJ962552,KF247309，003936,AY389481,AY389480,AY389479，AY389477-AY389476,AY389475
KM451264.KF247310
EU883935.AY389483
AY389489.AY389488
EU883937,EU883936
AY389482
EU883940.AY389487.AY389486
KF247311.AY389491
，AY389490,KF247248
AY389485,AY389484
EU883938
附录C
（资料性附录）
植物有害生物检疫鉴定系统操作方法SN/T4876.2—2017
登录植物有害生物检疫鉴定系统（http：//exoticorganism.com/），首页选择“基因条码”模块，在“输入比对的序列”窗口中粘贴查询序列。点击“比对”，软件会在数据库范围内比对，输出物种鉴定结果。结果中相似性最高的条码序列对应分类阶元为查询序列所属分类阶元。在“更多比对结果”里，点击“开始对比”，将符合该类群鉴定特征的且相似度为100%的物种判定为该未知种。以光胸断眼天牛Tetropiumcastaneum为例.在“输入比对的序列”窗口中粘贴COI基因片段，点击“比对”，结果见图C.1，相似性最高的条码序列对应分类阶元为断眼天牛属Tetropium，相似性为100%。在这一栏点击“开始对比”，结果见图C.2，相似度为100%的序列对应物种为光胸断眼天牛T.castaneum，即可判定查询序列为该物种植物有害生物检疫鉴定系统
数字标本
最新公告，
输入比对的序列：CGATCM
ATGTATTAATATT
ACGTTA
AATFATT
TTAAAT
床比对结果
分类附元
维明天牛黑 Tetropiu
量天牛尾
小靠属
eelytus
esirieid
大小寿
树蜂国sire
天牛Akrhepdur
天小黑u
弗天牛鼠herse
墨天牛国n
Pissedes
标准杂码名称
Tetrepiu
需天牛鼠
jseolyt
中安科Sirte
黑天牛鼠
特用siren
衡天牛厘
干小香黑
弗天牛国rh
墨天牛国es
水亮象黑Piss
TOCTGAT
TOM152
光胸断眼天牛Tetropiun
为首员
请先注册球“我的平台”，在“献字标本AGTAATAAAATTGTGGTAATTATTACTGCTCATACAATGGATGAAATTCCTGCTAAATGTAAACTAAAATATTTTCAACAATTATTCCTATAATTAAAAGAATTAATTCA
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下猫引物
CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC
TAGTGATTGCTCC-3)
EOOTOO
GTGATTGCTGE-3
GGTAAAATTATANAAA
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点违重器
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点违意看
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staneum在条码数据库分类阶元中的比对结果开始对比
开始对比
开始对比
开始对比
开数对比
开数对比
开检对比
并始对比
开教对比
开始对批
开始对比
开数对比
开趋对比
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