中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4876.2—2017 DNA条形码方法 第2部分：检疫性断眼天牛 (Method for DNA barcode - Part 2: Quarantine Tetropium spp) 发布日期：2017-11-07 实施日期：2018-06-01 前言 SN/T4876《DNA条形码方法》共分为5个部分：第1部分：检疫性乳白蚁；第2部分：检疫性断眼天牛；第3部分：检疫性卷蛾；第4部分：检疫性高梁属；第5部分：曼陀罗属。本部分为SN/T4876的第2部分。 本部分按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本部分主要起草人：徐梅、钱路、吴晶、禹海鑫、叶兼菱、季琴琴、朱林娟、杨晓军、郑斯竹、安榆林。 1 范围 SN/T4876的本部分规定了我国检疫性断眼天牛的DNA条形码检测鉴定方法。本部分适用于我国进境植物检疫性断眼天牛DNA条形码的测定、结果的比对分析与判定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T 2013 暗褐断眼天牛检疫鉴定方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 DNA条形码 (DNA barcode)：短的、标准化的基因片段，用于区分不同的物种。该片段在种间存在明显的遗传变异和分化并容易进行PCR扩增。DNA条形码技术主要用于物种识别和新种发现。 3.2 凭证标本 (voucher specimen)：DNA条形码的实物参考凭证，凭证标本信息包括馆藏信息、采集信息、鉴定信息，用于复核。模式标本是用于分类学研究的凭证标本。 3.3 COI基因 (COI gene)：线粒体基因组的蛋白质编码基因，全称为细胞色素c氧化酶亚基I (cytochrome c oxidase subunit I)，由于该基因进化速率较快，常用于分析亲缘关系密切的种、亚种及地理种群之间的系统关系。 4 检疫性断眼天牛基本信息 中文名：断眼天牛 学名：Tetropium spp. 分类地位：鞘翅目 Coleoptera，叶甲总科 Chrysomeloidea，天牛科 Cerambycidae，断眼天牛属 Tetropium 断眼天牛是一类重要的蠹干害虫，该属中的绝大多数种类均严重危害针叶木，偶尔也可危害阔叶木。其主要分布于欧亚大陆及美洲，在古北区分布有7种，北美有6种。我国检疫性断眼天牛种类主要有：暗褐断眼天牛 (T. fuscum)、棕翅断眼天牛 (T. cinnamopterum)、落叶松断眼天牛 (T. gabrieli)、施氏断眼天牛 (T. schwarzianum)、铁杉断眼天牛 (T. velutinum)、小红棕断眼天牛 (T. parvulum)等。 5 方法原理 根据断眼天牛的COI序列特征，应用DNA条形码技术对检疫性断眼天牛进行鉴定。 6 仪器用具和试剂 6.1 仪器 常规PCR仪、微量分光光度仪、电泳仪、凝胶成像系统、测序仪、高速冷冻离心机、生物安全柜、烘箱、高压灭菌锅、显微镜、解镜、天平（感量1/10000）、研钵、摇床、水浴锅、制冰机、纯水仪、旋涡震荡器、冰箱、微量移液器（2μL, 10μL, 20μL, 100μL, 200μL, 1000μL）、PCR管（0.2mL, 0.5mL）。 6.2 主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。提取液A（含1% SDS, 50 mmol/L）、提取液B（3 mmol/L KAc, 25 mmol/L Tris·Cl, 25 mmol/L NaCl, 25 mmol/L EDTA）、5 mol/L 醋酸钾 (KAc)、Tris、饱和酚、蛋白酶K、氯仿、异戊醇、异丙醇、75% 乙醇、95% 乙醇、液氮、10X PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸 (dNTPs)、ExTaq 聚合酶、引物（见表1）、DL2000 Marker、琼脂糖、溴化乙锭 (EB)。 7 DNA条形码鉴定 7.1 核酸的制备 采用磁珠法提取基因组DNA。提取步骤为：将酒精浸泡的虫体，选择适当大小的肌肉组织，用双蒸水进行冲洗，去除残余的酒精，冲洗干净后，将组织进行研磨，加入180μL裂解液及20μL蛋白酶K，55℃温浴，使得组织完全裂解。再加入200μL缓冲液、200μL无水乙醇及20μL磁珠，使DNA吸附到磁珠上，使用500μL Wash...