中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3687—2013 桃X病植原体检疫鉴定方法 Detection and identification of peach X phytoplasma 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国湖北出入境检验检疫局、华中农业大学、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：冯汉利、王利平、王振华、洪霓、李金甫、赵晖、曾宪东、王有福。 1 范围 本标准规定了植物检疫中桃X病(Peach X disease)的现场检疫和分子生物学鉴定方法。本标准适用于进出境桃、油桃、樱桃、李树等种苗中桃X病植原体的检疫鉴定。 2 桃X病植原体基本信息 英文名：Peach X phytoplasma 分类地位：细菌界（Bacteria），软壁菌门（Tenericutes），柔膜菌纲（Mollicutes）（又称软球菌纲），非固醇菌原体目（Acholeplasmatales），非固醇菌原体科（Acholeplasmataceae），植原体属（phytoplasma），16SrIII植原体组。该植原体的地理分布、寄主范围和症状、传播途径及基因组特征等参见附录A。 3 方法原理 DAPI染色后的形态学观察为初步筛查方法；以植原体核糖体16SrDNA通用引物进行PCR扩增、测序及限制性内切酶指纹图谱为主要的判定依据。 4 主要仪器设备和用具 4.1 仪器设备 PCR仪、荧光显微镜、超净工作台、切片机、电泳仪、凝胶成像分析仪、冷冻离心机、电子天平（1/10000g）、超低温冰箱、常规冰箱、灭菌锅、pH计、水浴锅、振荡器等。 4.2 用具 可调移液器（0μL～20μL、20μL~200μL、200μL~1000μL）、吸头、研钵、离心管（1.5mL、10mL）、PCR管（0.2mL）、量筒、烧杯、镊子等。 5 主要试剂 5.1 CTAB缓冲液成分： - CTAB: 2% - Tris-HCl: 100mmol/L (pH 8.0) - EDTA: 20mmol/L (pH 8.0) - 氯化钠(NaCl): 1.4mol/L - PVP40: 1% 5.2 其他试剂 DAPI染色液、液氮、MgCl2、dNTP、Taq DNA聚合酶、引物等。 6 检疫鉴定方法 6.1 症状检查 观察桃、樱桃、油桃等种苗、果实、叶片等，症状描述参见附录A。 6.2 样品的采集及制备 取有疑似症状的植物的不同部位叶、枝等植物部分进行实验室检测鉴定。 6.3 DAPI染色 选取幼嫩组织（叶脉、侧芽），将叶柄和叶脉固定于5%戊二醛缓冲液中，4℃保存备用。制作切片，切片经0.1mol/L磷酸缓冲液（pH 7.0）冲洗3次；用1μg/mL DAPI溶液染色10min~15min，在460nm激发条件下，通过荧光显微镜观察，在韧皮部筛管部位有明显的蓝色荧光信号表明有植原体存在。 6.4 植原体形态观察 对采集的植物样品制备超薄切片，通过透射电镜观察植原体形态方法（见附录B）。 6.5 植原体通用引物的Nested-PCR扩增、凝胶电泳及序列测定 16SrDNA的扩增使用巢式PCR，第一次PCR扩增使用通用引物为P1/P7，第二次PCR扩增采用通用引物R16F2n/R2；基于引物R16F2n/R2扩增的16SrDNA基因的PCR产物进行凝胶电泳并经测序。具体操作见附录C。 6.6 通用引物扩增产物的RFLP指纹图谱检测 在6.5检测中，若经通用引物R16F2n/R2扩增所得到的序列通过软件进行RFLP图谱分析，具体操作见附录D。 7 结果判定 7.1 症状表现与附录A.3描述一致且DAPI染色观察结果显示蓝色荧光，可初步判定为植原体，但需通过6.5、6.6的方案进一步检测。 7.2 在6.4检测中，电镜超薄切片在韧皮部筛管细胞中存在大量植原体，可初步判定该植物样品携带植原体，需要通过6.5、6.6的方案进一步检测。 7.3 在6.5检测中，若通过通用P1/P7及R16F2n/R2两对引物进行巢式PCR扩增，第二次扩增产物经凝胶电泳检测结果为阳性，且R16F2n/R2扩增产物测序结果经比对，与附录C.4序列一致，则可判定该样品携带桃X病植原体。 7.4 在6.6检测中，通用引物R16F2n/R2扩增产物的RFLP分析片段大小与桃X植原体标准图谱（见图D.1）相符，可判定该样品携带桃X病植原体。 8 样品保存 8.1 样品保存与处理 样品经登记和经手人...