SN/T 3687-2013
基本信息
标准号： SN/T 3687-2013
中文名称：桃X病植原体检疫鉴定方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3687-2013.Detection and identification of peach X phytoplasma.
1范围
SN/T 3687规定了植物检疫中桃X病(Peach X disease)的现场检疫和分子生物学鉴定方法。
SN/T 3687适用于进出境桃、油桃、樱桃、李树等种苗中桃X病植原体的检疫鉴定。
2桃X病植原体基本信息
英文名:Peach X phytoplasma
分类地位:细菌界(Bacteria),软壁菌门(Tenericutes)，柔膜菌纲(Mollicutes)(又称软球菌纲),非固醇菌原体目(Acholeplasmatales),非固醇菌原体科( Acholeplasmataceae),植原体属( phytoplasma), 16SrIII植原体组。该植原体的地理分布、寄主范围和症状、传播途径及基因组特征等参见附录A。
3方法原理
DAPI染色后的形态学观察为初步筛查方法;以植原体核糖体16SrDNA通用引物进行PCR扩增、测序及限制性内切酶指纹图谱为主要的判定依据。
4主要仪器设备和用具
4.1 仪器设备
PCR仪、荧光显微镜、超净工作台、切片机、电泳仪、凝胶成像分析仪、冷冻离心机、电子天平(1/10 000g)、超低温冰箱、常规冰箱、灭菌锅、pH计、水浴锅、振荡器等
4.2 用具
可调移液器(0μL~20μL、20μL~200μL、200μL~1 000μL)、吸头、研钵、离心管(1.5mL、10mL)、PCR管(0.2 mL).量筒、烧杯、镊子等。
1范围
SN/T 3687规定了植物检疫中桃X病(Peach X disease)的现场检疫和分子生物学鉴定方法。
SN/T 3687适用于进出境桃、油桃、樱桃、李树等种苗中桃X病植原体的检疫鉴定。
2桃X病植原体基本信息
英文名:Peach X phytoplasma
分类地位:细菌界(Bacteria),软壁菌门(Tenericutes)，柔膜菌纲(Mollicutes)(又称软球菌纲),非固醇菌原体目(Acholeplasmatales),非固醇菌原体科( Acholeplasmataceae),植原体属( phytoplasma), 16SrIII植原体组。该植原体的地理分布、寄主范围和症状、传播途径及基因组特征等参见附录A。
3方法原理
DAPI染色后的形态学观察为初步筛查方法;以植原体核糖体16SrDNA通用引物进行PCR扩增、测序及限制性内切酶指纹图谱为主要的判定依据。
4主要仪器设备和用具
4.1 仪器设备
PCR仪、荧光显微镜、超净工作台、切片机、电泳仪、凝胶成像分析仪、冷冻离心机、电子天平(1/10 000g)、超低温冰箱、常规冰箱、灭菌锅、pH计、水浴锅、振荡器等
4.2 用具
可调移液器(0μL~20μL、20μL~200μL、200μL~1 000μL)、吸头、研钵、离心管(1.5mL、10mL)、PCR管(0.2 mL).量筒、烧杯、镊子等。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3687—2013
桃X病植原体检疫鉴定方法
Detection and identification of peach X phytoplasma2013-08-30发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-03-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3687-—2013
本标准起草单位：中华人民共和国湖北出人境检验检疫局、华中农业大学、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：冯汉利、王利平、王振华、洪霓、李金甫、赵晖、曾宪东、王有福I
1范围
桃X病植原体检疫鉴定方法
SN/T3687—2013
本标准规定了植物检疫中桃X病(PeachXdisease)的现场检疫和分子生物学鉴定方法。本标准适用于进出境桃、油桃、樱桃、李树等种苗中桃X病植原体的检疫鉴定。2桃X病植原体基本信息
英文名：PeachXphytoplasma
分类地位：细菌界（Bacteria），软壁菌门（Tenericutes），柔膜菌纲（Mollicutes)（又称软球菌纲），非固醇菌原体目（Acholeplasmatales），非固醇菌原体科（Acholeplasmataceae），植原体属（phytoplasma），16SrIII植原体组。该植原体的地理分布、寄主范围和症状、传播途径及基因组特征等参见附录A。3方法原理
DAPI染色后的形态学观察为初步筛查方法；以植原体核糖体16SrDNA通用引物进行PCR扩增、测序及限制性内切酶指纹图谱为主要的判定依据4主要仪器设备和用具
仪器设备
PCR仪、荧光显微镜、超净工作台、切片机、电泳仪、凝胶成像分析仪、冷冻离心机、电子天平（1/10000g）、超低温冰箱、常规冰箱、灭菌锅、pH计、水浴锅、振荡器等4.2用具
可调移液器（0μL～20μL、20μL~200μL、200μL~/000μL）、吸头、研钵、离心管（1.5mL、10mL）、PCR管（0.2mL）、量筒、烧杯、镊子等。5主要试剂
5.1CTAB缓冲液
Tris-HCl
氯化钠(NaCI)
100mmol/L(pH8.0）
20mmol/L(pH8.0)
SN/T3687—2013
5.2其他试剂
DAPI染色液、液氮、MgCl2、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物等。6检疫鉴定方法
6.1症状检查
观察桃、樱桃、油桃等种苗、果实、叶片等，症状描述参见附录A。6.2样品的采集及制备
取有疑似症状的植物的不同部位叶、枝等植物部分进行实验室检测鉴定6.3DAPI染色
选取幼嫩组织（叶脉、侧芽），将叶柄和叶脉固定于5%戊二醛缓冲液中，4℃保存备用。制作切片，切片经0.1mol/L，磷酸缓冲液（pH7.0）冲洗3次；用1μg/mLDAPI溶液染色10min~15min，在460nm激发条件，荧光显微镜观察，在韧皮部筛管部位有明显的蓝色荧光信号表明有植原体存在。6.4植原体形态观察
对采集的植物样品制备超薄切片，通过透射电镜观察植原体形态方法（见附录B）。6.5植原体通用引物的Nested-PCR扩增、凝胶电泳及序列测定16SrDNA的扩增使用巢式PCR，第一次PCR扩增使用通用引物为P1/P7，第二次PCR扩增采用通用引物R16F2n/R2；基于引物R16F2n/R2扩增的16SrDNA基因的PCR产物凝胶电泳并经测序。具体操作见附录C。
6.6通用引物扩增产物的RFLP指纹图谱检测在6.5检测中，若经通用引物R16F2n/R16R2扩增所得到的序列通过软件进行RFLP图谱分析，具体操作见附录D。
7结果判定
7.1症状表现与A.3描述一致且DAPI染色观察结果显示蓝色荧光，可初步判定为植原体，但需通过6.5、6.6的方案进一步检测。
7.2在6.4检测中，电镜超薄切片在韧皮部筛管细胞中存在大量植原体，可初步判定该植物样品携带植原体，需要通过6.5、6.6的方案进一步检测。7.3在6.5检测中，若通过通用P1/P7及R16F2n/R2两对引物进行巢式PCR扩增，第二次扩增产物经凝胶电泳检测结果为阳性，且R16F2n/R2扩增产物测序结果经比对，与C.4序列一致，则可判定该样品携带桃X病植原体。
7.4在6.6检测中，通用引物R16F2n/R2扩增产物的RFLP分析片段大小与桃X植原体标准图谱（见图D.1)相符，可判定该样品携带桃X病植原体。2
8样品保存
8.1样品保存与处理
SN/T3687—2013
样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出桃X病植原体的样品应保存于一20℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后须经高压灭菌后方可处理。2结果记录与资料保存
完整的实验记录包括样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片。3
SN/T3687—2013
A.1地理分布
附录A
（资料性附录）
桃X病植原体其他相关信息
北美洲：加拿大（格雷特湖地区）、美国（1931年在加利福尼亚首次发现，现除了南卡罗来纳州、乔治亚州、阿肯色州和德克萨斯州外，几乎传遍整个美国），中国尚无报道。A.2寄主范围
桃树X病植原体可侵染大多数核果类果树，主要寄主植物包括李属植物如桃树（peach）、油桃（nectarine）、甜樱桃（sweetcherry）、李子（plum）、扁桃（almondtree）、杏（apricottree），及荷兰鸭儿芹（CryptotaeniajaponicaHassk）。最近研究还表明许多果园中的杂草也可能是其寄主。经人工接种能感染芹菜。
A.3表现症状
发病桃树最初的症状是形成黄色的病斑和卷叶，叶片黄化或红化，不规则水浸状斑点，通常沿着中脉向上卷曲。褪绿部分变干，变脆，坏死组织脱落，叶片破碎，穿孔，然后脱落，仅留一簇叶片在枝条的顶端（见图A.1和图A.2）。不久以后，整个植株出现褪绿，叶片脱落，只在枝条的顶部留下一些簇状叶片，幼树在发病后1～3年死亡，较成年的植株表现为慢性病症状。樱桃发病，果实上产生了小斑点而且不能成熟。X病植原体在美洲稠李上的典型症状在整个灌木上出现。叶片提前成熟，从亮黄到变红，在5月下旬或6月上旬脱落，植株节间大部分变短，稠李病株在表现症状后一般1～3年内死亡。图A.1油桃表现桃X病害症状
图A.2桃上表现桃X病害症状
传播途径
SN/T 36872013
在自然条件下，桃X病主要是由叶蝉介体传播和扩散，尤其是桃叶蝉Colladonusgeminatus，Scphytoliusacutus，深山叶蝉Colladonusmontanus和Paraphlepsiusirroratus。在一定程度上，
Fieberiellaflorii和Graphocephalaconfluens叶蝉也能传播。远距离以无症带菌苗木传播为主。A.5
基因组特征
西方X-病植原体染色质DNA的246046bp序列，这段序列包括20个基因，其中19个基因已获得全长序列（LieftingandKirkpatrick，2003）。5
SN/T3687—2013
试剂试材
钱酸固定液
巴比妥-乙酸钠缓冲液
巴比妥钠
乙酸钠
加双蒸水至100mL。
2%钱酸水溶液
c）1%钱酸固定液：
巴比妥-乙酸钠缓冲液
2%钱酸水溶液
0.1mol/L盐酸
附录B
（规范性附录）
电子显微镜观察
加双蒸水至25.0mL。
混合后用0.1mol/L盐酸调至pH为7.2，即为1%钱酸固定液，4℃保存备用。
B.1.2戊二醛固定液
一般为25%戊二醛水溶液。可配制在除巴比妥以外任何缓冲液中使用，终浓度为25%。B.1.3环氧树脂
Epon812
顺丁烯二酸酐（DDSA）
邻苯二甲酸二丁酯（D.B.P)
二乙基苯胺（D.M.P-30)
将Epon812倒人烧杯中，置80℃温箱融化备用。按上述比例，顺序加人DDSA，充分搅拌，待融化呈透明，至室温，再加入邻苯二甲酸二丁酯，仔细搅拌，然后慢慢逐滴加人二乙基苯胺，边加边搅拌，至包埋剂呈红棕色。
B.1.4Formvar膜
将聚乙烯醇缩甲醛溶于三氯甲烷，配成0.2%3%溶液，存于冰箱备用。制膜时取一块干净玻璃片插人溶液中，取出倾斜待三氯甲烷挥发，用镊子沿玻璃边划痕，将玻璃倾斜人蒸馏水中，薄膜即从玻璃片上脱落下来漂浮于水面，取干净的铜网摆上，压紧，再用一块滤纸覆盖其上，捞起后置于培养皿干燥备用。
2实验步骤
B.2.1取材
选取呈现早期症状的桃X病植原体叶子，用刀片切成整齐的细条，大小为3mm。取健康桃叶做6
对照。
B.2.2固定bzxZ.net
SN/T3687-2013
采用戊二醛-钱酸双固定法。样品在25%戊二醛进行前固定2h后，PBS(0.2mol/LpH7.4）清洗三次，然后用1%钱酸后固定2h，PBS清洁三次。B.2.3脱水
采用乙醇和系列梯度脱水。30%乙醇/15min-+50%乙醇/15min→70%乙醇/15min→80%丙醇/15min-→90%丙酮/15min→100%丙酮/15min。样品可在70%乙醇中停留过夜。B.2.4渗透
脱水后的组织块在丙酮/树脂中渗透3d，再在全树脂中渗透1d。B.2.5包埋
用环氧树脂做包埋剂。将组织块放在胶囊中央，滴人包埋剂。于37℃下24h，60℃下24h。B.2.6切片
在超薄切片机上将固定的组织块作切片。选择好的切片，将切片用二甲苯蒸发展开，用载有Formvar膜的铜网捞起，置培养皿内干燥、保存。B.2.7切片染色
采用乙酸双氧铀和柠檬酸铅双染色。取染色蜡盘数个，将乙酸铀染液滴人蜡盘上。取带切片的铜网，插人染色滴中，染20min30min，然后取出铜网，蒸馏水洗去多余染色液滤纸吸干。将铜网再放人另一蜡盘，滴人柠檬酸铅染液，使铜网翻扣在染色液上，染20min～30min，再用0.1mol/L氢氧化钠漂洗干净，滤纸吸干。
B.2.8显微镜观察
透射电子显微镜观察植原体形态，如图B.1，引自（Guo.Y.H.Walla.J.A等1996）。
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桃X病植原体检疫鉴定方法
Detection and identification of peach X phytoplasma2013-08-30发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-03-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3687-—2013
本标准起草单位：中华人民共和国湖北出人境检验检疫局、华中农业大学、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：冯汉利、王利平、王振华、洪霓、李金甫、赵晖、曾宪东、王有福I
1范围
桃X病植原体检疫鉴定方法
SN/T3687—2013
本标准规定了植物检疫中桃X病(PeachXdisease)的现场检疫和分子生物学鉴定方法。本标准适用于进出境桃、油桃、樱桃、李树等种苗中桃X病植原体的检疫鉴定。2桃X病植原体基本信息
英文名：PeachXphytoplasma
分类地位：细菌界（Bacteria），软壁菌门（Tenericutes），柔膜菌纲（Mollicutes)（又称软球菌纲），非固醇菌原体目（Acholeplasmatales），非固醇菌原体科（Acholeplasmataceae），植原体属（phytoplasma），16SrIII植原体组。该植原体的地理分布、寄主范围和症状、传播途径及基因组特征等参见附录A。3方法原理
DAPI染色后的形态学观察为初步筛查方法；以植原体核糖体16SrDNA通用引物进行PCR扩增、测序及限制性内切酶指纹图谱为主要的判定依据4主要仪器设备和用具
仪器设备
PCR仪、荧光显微镜、超净工作台、切片机、电泳仪、凝胶成像分析仪、冷冻离心机、电子天平（1/10000g）、超低温冰箱、常规冰箱、灭菌锅、pH计、水浴锅、振荡器等4.2用具
可调移液器（0μL～20μL、20μL~200μL、200μL~/000μL）、吸头、研钵、离心管（1.5mL、10mL）、PCR管（0.2mL）、量筒、烧杯、镊子等。5主要试剂
5.1CTAB缓冲液
Tris-HCl
氯化钠(NaCI)
100mmol/L(pH8.0）
20mmol/L(pH8.0)
SN/T3687—2013
5.2其他试剂
DAPI染色液、液氮、MgCl2、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物等。6检疫鉴定方法
6.1症状检查
观察桃、樱桃、油桃等种苗、果实、叶片等，症状描述参见附录A。6.2样品的采集及制备
取有疑似症状的植物的不同部位叶、枝等植物部分进行实验室检测鉴定6.3DAPI染色
选取幼嫩组织（叶脉、侧芽），将叶柄和叶脉固定于5%戊二醛缓冲液中，4℃保存备用。制作切片，切片经0.1mol/L，磷酸缓冲液（pH7.0）冲洗3次；用1μg/mLDAPI溶液染色10min~15min，在460nm激发条件，荧光显微镜观察，在韧皮部筛管部位有明显的蓝色荧光信号表明有植原体存在。6.4植原体形态观察
对采集的植物样品制备超薄切片，通过透射电镜观察植原体形态方法（见附录B）。6.5植原体通用引物的Nested-PCR扩增、凝胶电泳及序列测定16SrDNA的扩增使用巢式PCR，第一次PCR扩增使用通用引物为P1/P7，第二次PCR扩增采用通用引物R16F2n/R2；基于引物R16F2n/R2扩增的16SrDNA基因的PCR产物凝胶电泳并经测序。具体操作见附录C。
6.6通用引物扩增产物的RFLP指纹图谱检测在6.5检测中，若经通用引物R16F2n/R16R2扩增所得到的序列通过软件进行RFLP图谱分析，具体操作见附录D。
7结果判定
7.1症状表现与A.3描述一致且DAPI染色观察结果显示蓝色荧光，可初步判定为植原体，但需通过6.5、6.6的方案进一步检测。
7.2在6.4检测中，电镜超薄切片在韧皮部筛管细胞中存在大量植原体，可初步判定该植物样品携带植原体，需要通过6.5、6.6的方案进一步检测。7.3在6.5检测中，若通过通用P1/P7及R16F2n/R2两对引物进行巢式PCR扩增，第二次扩增产物经凝胶电泳检测结果为阳性，且R16F2n/R2扩增产物测序结果经比对，与C.4序列一致，则可判定该样品携带桃X病植原体。
7.4在6.6检测中，通用引物R16F2n/R2扩增产物的RFLP分析片段大小与桃X植原体标准图谱（见图D.1)相符，可判定该样品携带桃X病植原体。2
8样品保存
8.1样品保存与处理
SN/T3687—2013
样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出桃X病植原体的样品应保存于一20℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后须经高压灭菌后方可处理。2结果记录与资料保存
完整的实验记录包括样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片。3
SN/T3687—2013
A.1地理分布
附录A
（资料性附录）
桃X病植原体其他相关信息
北美洲：加拿大（格雷特湖地区）、美国（1931年在加利福尼亚首次发现，现除了南卡罗来纳州、乔治亚州、阿肯色州和德克萨斯州外，几乎传遍整个美国），中国尚无报道。A.2寄主范围
桃树X病植原体可侵染大多数核果类果树，主要寄主植物包括李属植物如桃树（peach）、油桃（nectarine）、甜樱桃（sweetcherry）、李子（plum）、扁桃（almondtree）、杏（apricottree），及荷兰鸭儿芹（CryptotaeniajaponicaHassk）。最近研究还表明许多果园中的杂草也可能是其寄主。经人工接种能感染芹菜。
A.3表现症状
发病桃树最初的症状是形成黄色的病斑和卷叶，叶片黄化或红化，不规则水浸状斑点，通常沿着中脉向上卷曲。褪绿部分变干，变脆，坏死组织脱落，叶片破碎，穿孔，然后脱落，仅留一簇叶片在枝条的顶端（见图A.1和图A.2）。不久以后，整个植株出现褪绿，叶片脱落，只在枝条的顶部留下一些簇状叶片，幼树在发病后1～3年死亡，较成年的植株表现为慢性病症状。樱桃发病，果实上产生了小斑点而且不能成熟。X病植原体在美洲稠李上的典型症状在整个灌木上出现。叶片提前成熟，从亮黄到变红，在5月下旬或6月上旬脱落，植株节间大部分变短，稠李病株在表现症状后一般1～3年内死亡。图A.1油桃表现桃X病害症状
图A.2桃上表现桃X病害症状
传播途径
SN/T 36872013
在自然条件下，桃X病主要是由叶蝉介体传播和扩散，尤其是桃叶蝉Colladonusgeminatus，Scphytoliusacutus，深山叶蝉Colladonusmontanus和Paraphlepsiusirroratus。在一定程度上，
Fieberiellaflorii和Graphocephalaconfluens叶蝉也能传播。远距离以无症带菌苗木传播为主。A.5
基因组特征
西方X-病植原体染色质DNA的246046bp序列，这段序列包括20个基因，其中19个基因已获得全长序列（LieftingandKirkpatrick，2003）。5
SN/T3687—2013
试剂试材
钱酸固定液
巴比妥-乙酸钠缓冲液
巴比妥钠
乙酸钠
加双蒸水至100mL。
2%钱酸水溶液
c）1%钱酸固定液：
巴比妥-乙酸钠缓冲液
2%钱酸水溶液
0.1mol/L盐酸
附录B
（规范性附录）
电子显微镜观察
加双蒸水至25.0mL。
混合后用0.1mol/L盐酸调至pH为7.2，即为1%钱酸固定液，4℃保存备用。
B.1.2戊二醛固定液
一般为25%戊二醛水溶液。可配制在除巴比妥以外任何缓冲液中使用，终浓度为25%。B.1.3环氧树脂
Epon812
顺丁烯二酸酐（DDSA）
邻苯二甲酸二丁酯（D.B.P)
二乙基苯胺（D.M.P-30)
将Epon812倒人烧杯中，置80℃温箱融化备用。按上述比例，顺序加人DDSA，充分搅拌，待融化呈透明，至室温，再加入邻苯二甲酸二丁酯，仔细搅拌，然后慢慢逐滴加人二乙基苯胺，边加边搅拌，至包埋剂呈红棕色。
B.1.4Formvar膜
将聚乙烯醇缩甲醛溶于三氯甲烷，配成0.2%3%溶液，存于冰箱备用。制膜时取一块干净玻璃片插人溶液中，取出倾斜待三氯甲烷挥发，用镊子沿玻璃边划痕，将玻璃倾斜人蒸馏水中，薄膜即从玻璃片上脱落下来漂浮于水面，取干净的铜网摆上，压紧，再用一块滤纸覆盖其上，捞起后置于培养皿干燥备用。
2实验步骤
B.2.1取材
选取呈现早期症状的桃X病植原体叶子，用刀片切成整齐的细条，大小为3mm。取健康桃叶做6
对照。
B.2.2固定bzxZ.net
SN/T3687-2013
采用戊二醛-钱酸双固定法。样品在25%戊二醛进行前固定2h后，PBS(0.2mol/LpH7.4）清洗三次，然后用1%钱酸后固定2h，PBS清洁三次。B.2.3脱水
采用乙醇和系列梯度脱水。30%乙醇/15min-+50%乙醇/15min→70%乙醇/15min→80%丙醇/15min-→90%丙酮/15min→100%丙酮/15min。样品可在70%乙醇中停留过夜。B.2.4渗透
脱水后的组织块在丙酮/树脂中渗透3d，再在全树脂中渗透1d。B.2.5包埋
用环氧树脂做包埋剂。将组织块放在胶囊中央，滴人包埋剂。于37℃下24h，60℃下24h。B.2.6切片
在超薄切片机上将固定的组织块作切片。选择好的切片，将切片用二甲苯蒸发展开，用载有Formvar膜的铜网捞起，置培养皿内干燥、保存。B.2.7切片染色
采用乙酸双氧铀和柠檬酸铅双染色。取染色蜡盘数个，将乙酸铀染液滴人蜡盘上。取带切片的铜网，插人染色滴中，染20min30min，然后取出铜网，蒸馏水洗去多余染色液滤纸吸干。将铜网再放人另一蜡盘，滴人柠檬酸铅染液，使铜网翻扣在染色液上，染20min～30min，再用0.1mol/L氢氧化钠漂洗干净，滤纸吸干。
B.2.8显微镜观察
透射电子显微镜观察植原体形态，如图B.1，引自（Guo.Y.H.Walla.J.A等1996）。
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