SN/T3753—2013 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 葡萄角斑叶焦病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Pseudopezicula tracheiphila (Miller-Thurgau) Korf et Zhuang 2013-11-06 发布 2014-06-01 实施 国家质量监督检验检疫总局 前言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草，由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：段维军、郭立新、陈先锋、杜洪忠、张慧丽、顾建锋。 1 范围 本标准规定了葡萄等寄主植物上的葡萄角斑叶焦病菌的形态学检疫鉴定方法。本标准适用于葡萄角斑叶焦病菌的检疫鉴定。 2 葡萄角斑叶焦病菌基本信息 学名：Pseudopezicula tracheiphila (Muller-Thurgau) Korf et Zhuang (1986) 曾用名：Pseudopezicula tracheiphila Mull.-Thurg (1903) 无性型：Phialopora tracheiphila (Sacc. & D. Sacc.) Korf 1986 分类地位：真菌界 (Fungi)、子囊菌门 (Ascomycota)、锤舌菌纲 (Leotiomycetes)、柔膜菌目 (Helotiales)、柔膜菌科 (Helotiaceae)、无柄盘菌属 (Pseudopezicula)。 传播途径：病菌可随风、雨、昆虫和田间操作传播，随感病叶片和果穗远距离传播。该病菌的其他相关资料参见附录A。 3 方法原理 以葡萄角斑叶焦病菌的培养性状和病原菌形态特征作为鉴定依据。 4 仪器设备和主要试剂 4.1 仪器设备 生物显微镜、超净工作台、高压灭菌器、生物培养箱、滤纸、手持放大镜、培养皿、烧杯、镊子、剪刀、载玻片、盖玻片、量筒、吸管、酒精灯。 4.2 试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。包括：麦芽汁、琼脂、次氯酸钠、无菌水、氢氧化钾、三氯乙酸、碘化钾、碘、蒸馏水。 5 病菌的鉴定 5.1 症状检查 挑取病株，进行观察。病害症状描述参见附录A。 5.2 染色观察 5.2.1 染剂 梅瑞氏染剂 (Melzer's reagent)：称取三氯乙酸 100g、碘化钾 5g、碘 5g，加蒸馏水定容至 100mL 后使用。梅瑞氏染剂可直接滴加于玻片作为负载剂使用。 5.2.2 染色方法 挑取病叶，将坏死和健康交界处表现红色或黄色叶片用 2% 氢氧化钾液体煮沸 2min～3min，将剪碎叶片放置在玻片上，盖上盖玻片，滴加梅瑞氏染剂后，在显微镜下镜检观察子囊和子囊孢子的有无。 5.3 病菌的分离培养 5.3.1 培养基 麦芽汁培养基 (MEA)：称取麦芽汁 25g、琼脂 20g，加热煮至琼脂完全溶化后，加蒸馏水补足 1000mL，121℃ 高压灭菌 20min。或选用市售麦芽汁培养基，高压灭菌后使用。 5.3.2 分离培养 将病健交界处剪成 1 mm $\times$ 2 mm 的小块，将这些小块用 0.5% 次氯酸钠溶液消毒 30s 后，吸干水分，放置在 2.5% 麦芽汁培养基平皿上，将培养皿放置在 20℃ 培养箱中，每天 16h 荧光照射，以诱发子囊孢子的产生。培养 10d～15d 后，观察并记录菌落特征、子囊、子囊孢子等形态特征。 6 鉴定特征 6.1 培养性状 葡萄角斑叶焦病菌的菌落正面白褐色，气生菌丝少，背面浅褐色，参见附录B。在显微镜下观察有性繁殖器官，如子囊盘。 6.2 病原菌形态特征 子囊盘垫状，无柄，新鲜时直径可达 0.6mm，裂出于叶部组织，大多生长在叶背面；子实层新鲜时白色，干燥时浅褐色。子实层平均厚度为 10 $\mu$m～30 $\mu$m。 子囊无囊盖，内有 8 个子囊孢子，子囊一端膨大成棍棒状，另一端渐细。用氢氧化钾进行前处理后再用梅瑞氏染剂对子囊顶端进行染色实验，可在顶端产生蓝色有顶环，如果不用氢氧化钾进行前处理则无法看到蓝色有顶环。子囊大小为 (115 $\mu$m～145 $\mu$m) $\times$ (18 $\mu$m～28 $\mu$m)。 子囊孢子椭圆形或一端扁平形，单核，透明无色，有油滴，(19.8 $\mu$m～25.7 $\mu$m) $\times$ (9.3 $\mu$m～14.0 $\mu$m)。 侧丝丝状，有隔膜，透明，分枝且弯曲，或者在尖端略微变形，宽 2.2 $\mu$m～2.7 $\mu$m。 无性型 Phialopora tracheiphila 分生孢子椭圆形，透明，单细胞，其上有油滴，平均直径为 (2.0 $\mu$m～3.7 $\mu$m) $\times$ (1.4 $\mu$m～1.9 $\mu$m)。 分生孢子梗在形态上与营养菌丝有所不同，为烧瓶状单瓶梗，有时轻微弯曲。 葡萄角斑叶焦病菌与近似种病原形态图及其区别，参见附录。