SN/T 3750-2013
基本信息
标准号:
SN/T 3750-2013
中文名称:苹果壳色单隔孢溃疡病菌检疫鉴定方法
标准类别:商检行业标准(SN)
标准状态:现行
出版语种:简体中文
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相关标签:
苹果
溃疡
病菌
检疫
鉴定
方法
标准分类号
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出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3750-2013.Detection and identification of Botr yos phaeria stevensii Shoemaker.
1范围
SN/T 3750规定了植物检疫中苹果壳色单隔孢溃疡病菌的检疫鉴定方法。
SN/T 3750适用于苹果壳色单隔孢溃疡病菌所有寄主植物的原木、枝条、苗木和果实的检疫鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3原理
依据苹果壳色单隔孢溃疡病菌的为害症状、菌落特征、病菌的无性型和有性型形态进行该病菌的检疫鉴定。
3原理
依据苹果壳色单隔孢溃疡病菌的为害症状、菌落特征、病菌的无性型和有性型形态进行该病菌的检疫鉴定。
4试剂及仪器设备
4.1培养基 及试剂
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA:每1000ml PDA由200 g去皮马铃薯,20g葡萄糖,18g琼脂配制而成)、燕麦琼脂培养基(OA:每1000mL OA由30 g燕麦片,20 g琼脂配制而成),100%乳酸.1%的次氯酸钠(NaOCl)、70%乙醇、无菌水。
4.2 仪器与设备
立体显微镜、生物显微镜(具油镜和测微尺)、普通天平(感量0.1 g)、超净工作台、生物培养箱、高压灭菌器、载玻片、盖玻片、打孔器(直径4 mm)。
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3750—2013
苹果壳色单隔孢溃疡病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Botryosphaeria stevensii Shoemaker2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3750-2013
本标准起草单位:中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人:王卫芳、张秋娥、黄英、严进、华丽。1范围
苹果壳色单隔孢溃疡病菌检疫鉴定方法本标准规定了植物检疫中苹果壳色单隔孢溃疡病菌的检疫鉴定方法SN/T3750-—2013
本标准适用于苹果壳色单隔孢溃疡病菌所有寄主植物的原木、枝条、苗木和果实的检疫鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3原理
依据苹果壳色单隔孢溃疡病菌的为害症状、菌落特征、病菌的无性型和有性型形态进行该病菌的检疫鉴定。
4试剂及仪器设备
培养基及试剂
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA:每1000mlPDA由200g去皮马铃薯,20g葡萄糖,18g琼脂配制而成)、燕麦琼脂培养基(OA:每1000mLOA由30g燕麦片,20g琼脂配制而成),100%乳酸、1%的次氯酸钠(NaOCI)、70%乙醇、无菌水。4.2仪器与设备
立体显微镜、生物显微镜(具油镜和测微尺)、普通天平(感量0.1g)、超净工作台、生物培养箱、高压灭菌器、载玻片、盖玻片、打孔器(直径4mm)。5检疫与鉴定
症状检查
检查抽取的原木、木制品、枝条和苗木树皮的表面是否有溃疡,枝条是否有枯死症状,检查果实是否有腐烂症状(症状描述和图片参见A.3、图B.1)。按SN/T2122抽样,将有可疑症状的样品带回实验室作进一步检验。5.2实验室鉴定
5.2.1样品中的病菌形态学观察
从树皮上采集子实体,横切片后,将切片组织转移到滴有无菌水的载玻片上,在常温下晾干后加1
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1滴100%乳酸并盖上盖玻片,制成非永久性玻片。观察子实体(尤其是子座)的形态特征,记录分生孢子、产孢细胞或者子囊、子囊孢子的形态。分别测量50个子囊孢子、子囊、分生孢子和产孢细胞、10个无性型子座和10个有性型子座的大小,拍摄并保存数码照片,同时将子实体转人培养基中纯化保存。5.2.2分离培养
在样品中如果没有发现病原菌的子实体,则采用组织分离培养法,分离病部的病原菌。取发病部位的病健交界组织,切成4mm×4mm的小块,用1%的NaOCl表面消毒10min,无菌水冲洗3遍,置于直径9cm的PDA平板上,每皿放4~6块,于25℃条件下12h黑暗/光照培养,将长出的菌落边缘的菌丝转至新的PDA平板上纯化
5.2.3分离物培养性状和形态学观察将纯化后的菌株在PDA平板上培养6d,采用火焰消毒的打孔器从菌落上打取直径4mm的菌丝体块,转移到新的PDA平板上,在全黑暗条件下,分别于20℃、25℃进行培养,每处理重复3次,观察菌落形态、计算菌落的生长速度、分生孢子器形成的速度。待分生孢子器形成后,观察分生孢子器及分生抱子的形态,测量其大小,拍摄并保存数码照片。6鉴定特征
6.1菌落特征
在PDA平板上,菌落圆形,初期白色,培养5d~6d后呈深橄榄色,且有大量的气生菌丝生成,在20℃、25℃黑暗条件下菌落生长速率分别为6mm/d、11mm/d。培养至6d菌落中央即现纠结成粒状的大量黑褐色分生孢子器。培养至9d少量的分生孢子器顶部即现白色黏稠状分生孢子团,培养至15d整个培养血布满黑褐色分生孢子器,并且喷出大量白色孢子团(菌落特征图参见图B.2)。6.2无性繁殖器官的形态
分生孢子器,单生或聚生,埋生于黑色的子座上,成熟时部分开裂,深褐色至黑色,近球形,直径可达600μm,壁由三层组成,外层黑褐色,由厚壁细胞组成,中间层由深褐色的薄壁细胞组成,内层由透明的薄壁细胞组成。孔口居中,圆形,具乳突。分生抱子梗圆柱形,透明,无隔膜,极少数分支具隔膜。产孢细胞[(11~)12~15]um×(4~5)μm,外生芽殖型产孢,离散,圆柱形,透明,光滑,无限生长。分生孢子器成熟后喷射出白色分生孢子团。分生孢子透明,光滑,厚壁,长椭圆形至卵形,大小[(23.5~)25.1~25.7(~27.4)μm×[(12.4~)13.2~13.5(~14.3)Jμm,平均大小为(25.4±1.0)μm×(13.4±0.5)μm,长/宽比率为1.9土0.1。分生孢子初无色透明,无隔膜,随着培养时间的延长,分生孢子转为褐色,多具1隔膜,少数2~3隔膜。
6.3有性繁殖器官形态
在自然条件下,如树皮的坏死部位,无性型和有性型可同时产生于同一子座内或不同的子座内。子囊座单腔室,单生或聚生,埋生,成熟时部分开裂,球形,直径可达300μm,深褐色至黑色,壁厚,外层由深棕色的厚壁细胞组成,内层由透明的薄壁细胞组成。孔口中生,圆形,具乳突。拟侧丝透明,具分支,具隔膜,宽2μm~3μm。子囊棍棒状,具柄,双囊壁,大小为(100~160)μm×(14~22)μm(包括柄),内含8个子囊抱子,双侧排列。子囊抱子天小为L(24.8~)30.8~32.1(~36.2)m×L(9.5~)11.2~11.7(~13.4)μm,长宽比为2.8士0.3,梭形,中间宽,两端钝圆,透明,壁薄,光滑,初期无隔膜,后期变为淡褐色具1隔膜,极少数有2个隔膜(病菌的有性型形态图参见图B.4)。2
结果判定
SN/T3750—2013
如病原菌的培养性状与形态特征与6.1、6.2、6.3描述的鉴定特征相吻合,即可确定为苹果壳色单隔孢溃疡病菌。
菌种保存
分离获得的苹果壳色单隔孢溃疡病菌,应转人燕麦琼脂培养基试管斜面上,置于4℃黑暗条件下保存至少12个月,以备复验、谈判和仲裁,3
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A.1学名及分类地位
附录A
(资料性附录)
苹果壳色单隔孢溃疡病菌背景资料学名:BotryosphaeriastevensiiShoemaker异名:Botryodiplodiamalorum
erkEPot
无性态:Diplodiamutila(Fr.)Mont.分类地位:子囊菌门(Ascomycota);座囊菌目(Dothideales),葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae),葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)。A.2分布
亚洲:印度。
非洲:摩洛哥。
北美洲:加拿大、美国。
南美洲:委内瑞拉、秘鲁。
大洋洲:澳大利亚、新西兰。
欧洲:阿尔巴尼亚、保加利亚、德国、意大利、匈牙利、波兰、葡萄牙、西班牙、瑞典、乌克兰、英国。A.3症状
nsi)主要为害寄主植物的叶和枝干,在不同寄主上的为害症状苹果壳色单隔孢溃疡病菌(B
Lstewer
较相似。
在苹果和梨上,主要引起枝干溃疡及干枯症状。疡症状,接种7d~14d的苹果果实表现出腐烂病斑在致病性测定时,接种苹果树6周后,枝条出现溃橡树被B.steuensii侵染后,主要引起树皮坏死或在枝条上尤其是枝条的顶端形成直径2cm6cm的溃疡,并伴有流胶症状。当病斑包围了枝干以后,其顶端很快為随后枯死,叶片变黄并最后萎焉,萎的叶片通常依旧粘附在死亡的枝干上。在病部有可能观察到分生孢子器,看起来像黑色的脓包。坏死的树皮很容易被剥掉,露出黑色的韧皮部。在其他阔叶树上,B.stevensii可引起类似的症状,例如,在欧洲白蜡的嫩枝上,树皮上形成黑褐色坏死斑,有时会引起叶子变色及菱為。在意大利西西里岛上,5年~7年树龄的花枝条坏死并开裂,溃疡下面的嫩条和顶端坏死在柏树上,被B.stevensii感染后,会引起新枝基部溃疡,顶端变为黄色或褐色。A.4传播途径
该菌可以菌丝、子座和分生孢子器在发病枝干的树皮内越冬,或以菌丝在枝条和芽内越冬,当环境条件适宜时开始侵染。B.stevensii的分生孢子在整个生长季节均可通过风雨传播:雨滴可溶解包有分生孢子的流胶,并使它们溅起,在风的作用下转移到新的寄主上。同时,在风的作用下,子囊孢子的传播更加容易。在意大利中部,B.stevensii可通过一些长蠹科昆虫(Sinorylonperforans,S.serdentatum),4
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以及一些吉丁科昆虫(Coroebusflorentinus)在橡树间传播。当分生孢子器裂开时,它们会用分生孢子将自已覆盖起来,并作为新侵染的媒介。该菌可随寄主植物的茎、枝条、叶、苗木及果实的调运进行远距离传播。
寄主范围
苹果壳色单隔孢溃疡病菌寄主广,包括11科、18属(参见表A.1)。表A.1苹果壳色单隔孢溃疡病菌的寄主种类科
苹果属Malus(M.domestica,M.pumila,M.sylvesiris),李属Prunus(李P.salicina,桃蔷薇科Rosaceae
葡萄科Vitaceae
棕榈科Palmae
壳斗科Fagaceae
木犀科Oleaceae
柏科Cupressaceae
榆科Ulmaceae
樟科Lauraceae
胡桃科Juglandaceae
含羞草科Mimosaceae
豆科Leguminosae
P.persica,稠李P.padus,杏P.armeniaca),梨属Pyrtus(梨P.communis),枇杷属Erio-botrya(枇杷E.japonica)
葡萄属Vitis(葡萄V.ini
棕榈属Trachycarpas(棕榈T.foru属Archontopheenia(假槟榔A
),刺葵属Phoenix(海枣P.dactylifera),假槟榔aterandrae)
栎属Quercus(欧洲栓皮栎Q.suber,橡树Q.aliena)白蜡树属Frazinus(欧洲白蜡木F.ercelsior)圆柏属Sabinaspp.,刺柏属Juniperus(沙皮刺柏J.Sabina,刺柏J.scopulorum),扁柏属Chamaecyparis(美国扁柏C.lawsonie榆属Ulmus(榆树
鳄梨属Perse
山核桃属
金合欢属
(鳄梨
pumila)
.ameridana)
arya(美国薄壳山核桃C.Illi
长角豆属
Ceraton
经合欢Afarnesia
a(长角豆C.siliqua)
inensis)
SN/T3750—2013
说明:
附录B
(资料性附录)
苹果壳色单隔孢溃疡病症状、病菌菌落及形态特征图4wwW.bzxz.Net
病菌在树枝和树于上形成的症状:病菌在树皮表面形成分生孢子器。注:图片来自PaulBachi:http://forestryimages.org/support/contactus.cfm。图B.1B.stevensii侵染Caryaillinoinensis的病状及病征说明:
在PDA上培养3d;
在PDA上培养14d(可见颗粒状分生孢子器)。注:菌株来源:美国菌种保藏中心,菌株编号:ATCCMYA-3696TM,图片拍摄:张秋娥。图B.2B.stevensii的菌落特征
说明:
载孢体;
载孢体纵切面;
产生分生孢子的子座腔室纵切面;产生大型分生孢子的产孢细胞;产生小型分生孢子的产孢细胞;产生大、小型分生孢子的分生孢子器腔纵切面的一部分;SN/T3750—2013
大型分生孢子(0~3隔膜)。
注:标尺:图片4~5、7~8:10μm,图片6:20μm。图片1~2、4~5来自Alves,A.,图片3来自Vajna,L.,图片6~8王卫芳拍摄。68菌株来源:美国菌种保藏中心,菌株编号:ATCCMYA-3696TM图B.3B.stevensii无性繁殖器官形态图
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