SN/T 4097-2015
基本信息
标准号： SN/T 4097-2015
中文名称：贝类派琴虫实时荧光PCR检测方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4097-2015.Real-time fluorescent PCR quarantine protocol for Perkinsus sp.in shellfish.
1范围
SN/T 4097规定了贝类中派琴虫的实时荧光PCR检测方法。
SN/T 4097适用于贝类组织中派琴虫的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1实时荧光PCR real-time fluorescent PCR
在普通聚合酶链反应的基础上加人一条特 异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和-一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成，实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步,达到实时定量的目的。
3.2Ct值cycle threshold
每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，也可称为Cp值。
1范围
SN/T 4097规定了贝类中派琴虫的实时荧光PCR检测方法。
SN/T 4097适用于贝类组织中派琴虫的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1实时荧光PCR real-time fluorescent PCR
在普通聚合酶链反应的基础上加人一条特 异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和-一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成，实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步,达到实时定量的目的。
3.2Ct值cycle threshold
每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，也可称为Cp值。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4097—2015
贝类派琴虫实时荧光PCR检测方法Real-timefluorescentPCR quarantineprotocolforPerkinsus sp.inshellfish2015-02-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-09-01实施
本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：张雪、肇慧君、李叶、李振荣、贾。SN/T4097-2015
1范围
贝类派琴虫实时荧光PCR检测方法本标准规定了贝类中派琴虫的实时荧光PCR检测方法。本标准适用于贝类组织中派琴虫的检测。规范性引用文件
SN/T4097—2015
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
实时荧光PCR
Rreal-timefluorescentPCR
在普通聚合酶链反应的基础上加人一条特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记个报告荧光基团和一个灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有-个荧光分子形成，实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，达到实时定量的目的。3.2
直cyclethreshold
每个反应管内的荧光信号达到设定的阔值时所经历的循环数，也可称为Cp值。4
试剂和材料
1mol/LTris·Cl(pH8.0)、0.5mol/LEDTA溶液（pH8.0)、SDS(10%)。溶液配制见附录A。蛋白醇K溶液(20mg/mL)。
Tris-饱和酚。
三氯甲烷。
异戊醇。
无水乙醇。
生理盐水。
10×PCRbuffer、25mmol/LMgCl2、2.5mmol/LdNTP、5U/μLTag酶。10μmol/L上游引物、10μmol/L下游引物、10μmol/L探针。TE缓冲液（pH8.0）。
SN/T4097—2015
仪器和设备
组织研磨器。
电子天平。
5.3冷冻离心机。
涡旋振荡器。
水浴锅。
超纯水机。
冰箱(2℃～8℃、-20℃、-80℃)。高压灭菌锅。
实时荧光PCR仪。
检测步骤
6.1取样
选取濒死的新鲜贝类样品，或者有感染派琴虫临床症状的样品（消化腺发白，贝壳不能闭合，套膜收缩，性腺发育受到抑制，生长迟缓等）。采集贝类的腮、套膜和消化腺等组织25mg，置于冰冷的生理盐水中反复冲洗，用滤纸吸干表面水分，在液氮中冻5min，放至室温，再置于匀浆研磨器中并加入冷的生理盐水50L，进行手工匀浆研磨。6.2
DNA提取和纯化
6.2.1将匀浆液倒入1.5mL离心管中，加人生理盐水补充体积至200μL,加20μL蛋白酶K(20mg/mL)，再加SDS至终浓度为1%，上下颠倒混匀。6.2.2
混合液置于55℃水浴锅内水浴2.5h。3向匀浆液中按1：1比例加人苯酚：三氯甲烷：异戊醇混合液（A.5），上下颠倒混勾，12000r/min6.2.3
离心5min。
转移上层水相，加人等体积三氯甲烷：异戊醇混合液（A.6），上下颠倒混匀，12000r/min离心5min。
晾干。
转移上层水相，加人两倍体积的无水乙醇，一20℃放置30min或过夜。12000r/min离心5min，沉淀DNA，倾去上清液。于沉淀中加入75%乙醇溶液500μL，轻轻混匀后12000r/min离心5min，倾去上清液，室温3用20μLTE缓冲液溶解DNA沉淀，一20℃保存备用。6.2.8
组织DNA提取也可采用等效的商品化DNA提取试剂盒，按照说明书进行操作。实时荧光PCR检测
实时荧光PCR引物
该引物扩增派琴虫核糖体DNA序列中的ITS区域基因序列，扩增片度长度为69bp，参见附录B.上游引物：5'-TCAAAACGAAATTCCAAACTCTCA-3下游引物：5'-CTTCGCTGCGTCCTTCATC-3Taqman探针：5'-FAM-CGATGGATGCCTCGGCTCGAG-ECLIPSE-32
SN/T4097—2015
引物与探针合成后配制成100μmol/L储备液，一20℃保存备用。使用前均采用灭菌蒸馏水稀释
为10μmol/L加人体系。
实时荧光PCR反应体系
见表1。
10×PCR缓冲液（不含MgCls）
MgCl:溶液（25mmol/L）
dNTP溶液(2.5mmol/L)
上游引物(10μmol/L)
下游引物(10μmol/L）
探针(10μmol/L）
Taq酶(5U/μL)
DNA模板
灭菌蒸馏水
实时荧光PCR反应参数
反应体系
体积/μL
至总体积25
PCR反应程序为：94℃预变性3min;94℃变性10s，57℃退火30s，共40个循环，每个循环结束后采集FAM通道数据。
结果判定
试验成立判定
试验结束后读取Ct值。反应结果应同时符合以下条件，否则试验结果无效：a)
阴性对照无Ct值并且无扩增曲线；空白对照无Ct值并且无扩增曲线；阳性对照Ct值小于或等于35并且有明显扩增曲线。试验结果报告
试验结果报告如下：
检测样品的Ct值大于或等于40时，判定为派琴虫阴性。检测样品的Ct值小于或等于35时，判定为派琴虫阳性。检测样品的Ct值大于35而小于40时，判定为可疑。此时可对样品重复进行荧光PCR检测，如果样品重复检测的Ct值大于或等于40，则判定为派琴虫阴性；如果样品重复检测的Ct值小于40，并且有明显扩增曲线，则判定为派琴虫阳性。SN/T 40972015
A.11mol/LTris·HCI溶液（pH8.0）附录
（规范性附录）
相关溶液配制
称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800mL水中，用浓盐酸调pH至8.0，加水定容至1L。在103.4kPa(121℃）条件下灭菌20min。10%SDS
在900mL水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加人几滴浓盐酸调节溶液的pH至7.2，加水定容至1L，分装备用。
0.5mol/LEDTA溶液
称取186.1g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Naz·2HzO)加人700mL水中，在磁力搅拌器上剧烈揽拌，用10mol/L的氢氧化钠溶液调pH至8.0，用水定容到1L,分装后高压灭菌。TE缓冲液（pH8.0）
在800mL水中依次加人10mL的1mol/LTris·HCl(pH8.0)和2mL的500mmol/LEDTA(pH8.0）)，加水定容至1000mL，在103.4kPa(121℃）条件下灭菌20min。苯酚：三氯甲烷：异戊醇溶液
将苯酚、三氯甲烷和异戊醇按照25：24：1的体积比混合。A.6
三氯甲烷：异戊醇溶液
将三氯甲烷和异戊醇按照24：1的体积比混合。蛋白酶K溶液
蛋白酶K冻干品，用高压灭菌的去离子水或双蒸水溶解为20mg/mL的溶液，分装后于一20℃保存，避免反复冻融。
10×PCR缓冲液
将KCl和MgClz分别按500mmol/L和15mmol/L加人100mmol/LTris·HCl中，调节溶液的pH至8.3，分装备用。
75%乙醇
将无水乙醇和灭菌去离子水按照3：4的体积比混合。4
附录B
（资料性附录）
派琴虫PCR目标扩增序列
tcaaaacgaaattccaaactctca acgatgcctcggctcgagaatcgatgaaggacgcagcgaag阴影部分为引物序列。
SN/T4097—2015
SN/T4097-2015
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
贝类派琴虫实时荧光PCR检测方法SN/T 40972015
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区三里河北街16号(100045)总编室：(010)68533533
网址www.spc.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印剧厂印刷*
开本880×1230
2016年3月第一版
印张0.75免费标准下载网bzxz
字数11千字
2016年3月第一次印刷
印数1—1100
书号：155066·2-29647
定价16.00元
11260/
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贝类派琴虫实时荧光PCR检测方法Real-timefluorescentPCR quarantineprotocolforPerkinsus sp.inshellfish2015-02-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-09-01实施
本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：张雪、肇慧君、李叶、李振荣、贾。SN/T4097-2015
1范围
贝类派琴虫实时荧光PCR检测方法本标准规定了贝类中派琴虫的实时荧光PCR检测方法。本标准适用于贝类组织中派琴虫的检测。规范性引用文件
SN/T4097—2015
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
实时荧光PCR
Rreal-timefluorescentPCR
在普通聚合酶链反应的基础上加人一条特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记个报告荧光基团和一个灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有-个荧光分子形成，实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，达到实时定量的目的。3.2
直cyclethreshold
每个反应管内的荧光信号达到设定的阔值时所经历的循环数，也可称为Cp值。4
试剂和材料
1mol/LTris·Cl(pH8.0)、0.5mol/LEDTA溶液（pH8.0)、SDS(10%)。溶液配制见附录A。蛋白醇K溶液(20mg/mL)。
Tris-饱和酚。
三氯甲烷。
异戊醇。
无水乙醇。
生理盐水。
10×PCRbuffer、25mmol/LMgCl2、2.5mmol/LdNTP、5U/μLTag酶。10μmol/L上游引物、10μmol/L下游引物、10μmol/L探针。TE缓冲液（pH8.0）。
SN/T4097—2015
仪器和设备
组织研磨器。
电子天平。
5.3冷冻离心机。
涡旋振荡器。
水浴锅。
超纯水机。
冰箱(2℃～8℃、-20℃、-80℃)。高压灭菌锅。
实时荧光PCR仪。
检测步骤
6.1取样
选取濒死的新鲜贝类样品，或者有感染派琴虫临床症状的样品（消化腺发白，贝壳不能闭合，套膜收缩，性腺发育受到抑制，生长迟缓等）。采集贝类的腮、套膜和消化腺等组织25mg，置于冰冷的生理盐水中反复冲洗，用滤纸吸干表面水分，在液氮中冻5min，放至室温，再置于匀浆研磨器中并加入冷的生理盐水50L，进行手工匀浆研磨。6.2
DNA提取和纯化
6.2.1将匀浆液倒入1.5mL离心管中，加人生理盐水补充体积至200μL,加20μL蛋白酶K(20mg/mL)，再加SDS至终浓度为1%，上下颠倒混匀。6.2.2
混合液置于55℃水浴锅内水浴2.5h。3向匀浆液中按1：1比例加人苯酚：三氯甲烷：异戊醇混合液（A.5），上下颠倒混勾，12000r/min6.2.3
离心5min。
转移上层水相，加人等体积三氯甲烷：异戊醇混合液（A.6），上下颠倒混匀，12000r/min离心5min。
晾干。
转移上层水相，加人两倍体积的无水乙醇，一20℃放置30min或过夜。12000r/min离心5min，沉淀DNA，倾去上清液。于沉淀中加入75%乙醇溶液500μL，轻轻混匀后12000r/min离心5min，倾去上清液，室温3用20μLTE缓冲液溶解DNA沉淀，一20℃保存备用。6.2.8
组织DNA提取也可采用等效的商品化DNA提取试剂盒，按照说明书进行操作。实时荧光PCR检测
实时荧光PCR引物
该引物扩增派琴虫核糖体DNA序列中的ITS区域基因序列，扩增片度长度为69bp，参见附录B.上游引物：5'-TCAAAACGAAATTCCAAACTCTCA-3下游引物：5'-CTTCGCTGCGTCCTTCATC-3Taqman探针：5'-FAM-CGATGGATGCCTCGGCTCGAG-ECLIPSE-32
SN/T4097—2015
引物与探针合成后配制成100μmol/L储备液，一20℃保存备用。使用前均采用灭菌蒸馏水稀释
为10μmol/L加人体系。
实时荧光PCR反应体系
见表1。
10×PCR缓冲液（不含MgCls）
MgCl:溶液（25mmol/L）
dNTP溶液(2.5mmol/L)
上游引物(10μmol/L)
下游引物(10μmol/L）
探针(10μmol/L）
Taq酶(5U/μL)
DNA模板
灭菌蒸馏水
实时荧光PCR反应参数
反应体系
体积/μL
至总体积25
PCR反应程序为：94℃预变性3min;94℃变性10s，57℃退火30s，共40个循环，每个循环结束后采集FAM通道数据。
结果判定
试验成立判定
试验结束后读取Ct值。反应结果应同时符合以下条件，否则试验结果无效：a)
阴性对照无Ct值并且无扩增曲线；空白对照无Ct值并且无扩增曲线；阳性对照Ct值小于或等于35并且有明显扩增曲线。试验结果报告
试验结果报告如下：
检测样品的Ct值大于或等于40时，判定为派琴虫阴性。检测样品的Ct值小于或等于35时，判定为派琴虫阳性。检测样品的Ct值大于35而小于40时，判定为可疑。此时可对样品重复进行荧光PCR检测，如果样品重复检测的Ct值大于或等于40，则判定为派琴虫阴性；如果样品重复检测的Ct值小于40，并且有明显扩增曲线，则判定为派琴虫阳性。SN/T 40972015
A.11mol/LTris·HCI溶液（pH8.0）附录
（规范性附录）
相关溶液配制
称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800mL水中，用浓盐酸调pH至8.0，加水定容至1L。在103.4kPa(121℃）条件下灭菌20min。10%SDS
在900mL水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加人几滴浓盐酸调节溶液的pH至7.2，加水定容至1L，分装备用。
0.5mol/LEDTA溶液
称取186.1g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Naz·2HzO)加人700mL水中，在磁力搅拌器上剧烈揽拌，用10mol/L的氢氧化钠溶液调pH至8.0，用水定容到1L,分装后高压灭菌。TE缓冲液（pH8.0）
在800mL水中依次加人10mL的1mol/LTris·HCl(pH8.0)和2mL的500mmol/LEDTA(pH8.0）)，加水定容至1000mL，在103.4kPa(121℃）条件下灭菌20min。苯酚：三氯甲烷：异戊醇溶液
将苯酚、三氯甲烷和异戊醇按照25：24：1的体积比混合。A.6
三氯甲烷：异戊醇溶液
将三氯甲烷和异戊醇按照24：1的体积比混合。蛋白酶K溶液
蛋白酶K冻干品，用高压灭菌的去离子水或双蒸水溶解为20mg/mL的溶液，分装后于一20℃保存，避免反复冻融。
10×PCR缓冲液
将KCl和MgClz分别按500mmol/L和15mmol/L加人100mmol/LTris·HCl中，调节溶液的pH至8.3，分装备用。
75%乙醇
将无水乙醇和灭菌去离子水按照3：4的体积比混合。4
附录B
（资料性附录）
派琴虫PCR目标扩增序列
tcaaaacgaaattccaaactctca acgatgcctcggctcgagaatcgatgaaggacgcagcgaag阴影部分为引物序列。
SN/T4097—2015
SN/T4097-2015
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
贝类派琴虫实时荧光PCR检测方法SN/T 40972015
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区三里河北街16号(100045)总编室：(010)68533533
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中国标准出版社秦皇岛印剧厂印刷*
开本880×1230
2016年3月第一版
印张0.75免费标准下载网bzxz
字数11千字
2016年3月第一次印刷
印数1—1100
书号：155066·2-29647
定价16.00元
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