SN/T 4067-2014
基本信息
标准号： SN/T 4067-2014
中文名称：进出境猴麻疹病毒病检疫技术规范
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4067-2014.Quarantine protocol for measles to entry-exit monkey.
1范围
SN/T 4067规定了猴麻疹病毒的病原分离、病毒中和试验、实时荧光定量PCR试验、阻断ELISA抗体试验的技术要求。
SN/T 4067适用于进出境猴麻疹病毒的检疫。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489实验室生 物安全通用要求
SN/T 2025动物 检疫实验室生物安全操作规范
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
B95a细胞:狨猴淋巴母细胞
CPE:致细胞病变作用(cytopathiceffect)
Ct值:荧光信号到达设定的阈值所经历的循环数(cyclethreshold)
ELISA:酶联免疫吸附试验( enzyme-linked immunosorbnent assay)
MV:麻疹病毒(measlesvirus
4初步诊断
该病的介绍参见A.1,可根据临床诊断和病理变化进行初步诊断,参见A.2.A.3,确诊还需实验室诊断。
5病毒分离
5.1设备和器材
倒置光学显微镜、二氧化碳培养箱、冰箱(-20℃,-70℃)、50μL、100μL微量可调移液器、无菌96孔细胞培养板、无菌塑料滴头、无菌塑料离心管(1.5mL)或5mL~10mL无菌玻璃试管、无菌棉拭子。
1范围
SN/T 4067规定了猴麻疹病毒的病原分离、病毒中和试验、实时荧光定量PCR试验、阻断ELISA抗体试验的技术要求。
SN/T 4067适用于进出境猴麻疹病毒的检疫。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489实验室生 物安全通用要求
SN/T 2025动物 检疫实验室生物安全操作规范
3缩略语
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B95a细胞:狨猴淋巴母细胞
CPE:致细胞病变作用(cytopathiceffect)
Ct值:荧光信号到达设定的阈值所经历的循环数(cyclethreshold)
ELISA:酶联免疫吸附试验( enzyme-linked immunosorbnent assay)
MV:麻疹病毒(measlesvirus
4初步诊断
该病的介绍参见A.1,可根据临床诊断和病理变化进行初步诊断,参见A.2.A.3,确诊还需实验室诊断。
5病毒分离
5.1设备和器材
倒置光学显微镜、二氧化碳培养箱、冰箱(-20℃,-70℃)、50μL、100μL微量可调移液器、无菌96孔细胞培养板、无菌塑料滴头、无菌塑料离心管(1.5mL)或5mL~10mL无菌玻璃试管、无菌棉拭子。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4067—2014
进出境猴麻疹病毒病检疫技术规范Quarantine protocol for measles to entry-exit monkey2014-11-19发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-05-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4067—2014
本标准起草单位：中华人民共和国海南出人境检验检疫局、中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局、中华人民共和国云南出人境检验检疫局、中华人民共和国新疆出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：李丹丹、徐义刚、艾军、季新成、徐维加、林志雄、吴山楠、黄纪徽。1范围
进出境猴麻疹病毒病检疫技术规范SN/T4067—2014
本标准规定了猴麻疹病毒的病原分离、病毒中和试验、实时荧光定量PCR试验、阻断ELISA抗体试验的技术要求。
本标准适用于进出境猴麻疹病毒的检疫2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求SN/T2025动物检疫实验室生物安全操作规范3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
B95a细胞：绒猴淋巴母细胞
CPE：致细胞病变作用（cytopathiceffect）Ct值：荧光信号到达设定的阈值所经历的循环数（cyclethreshold）ELISA：酶联免疫吸附试验（enzyme-linkediimmunosorbnentassay）MV：麻疹病毒（measlesvirus）TCIDso：半数组织培养感染量（tissuecultureinfectivedos4初步诊断
该病的介绍参见A.1，可根据临床诊断和病理变化进行初步诊断，参见A.2、A.3，确诊还需实验室诊断。
5病毒分离
设备和器材
倒置光学显微镜、二氧化碳培养箱、冰箱（一20℃，一70℃）、50μL、100μL微量可调移液器、无菌96孔细胞培养板、无菌塑料滴头、无菌塑料离心管（1.5mL）或5mL~10mL无菌玻璃试管、无菌棉拭子。
5.2试剂和材料
5.2.1病毒：MV病毒标准毒株。实验环境和防护要求见GB19489。1
SN/T4067—2014
5.2.2血清：MV标准阳性血清、阴性血清。5.2.3被检样品：病猴呼吸道或血液采集标本。若需要长途运输，应将病料置于含有高浓度抗生素运输液中（每毫升5000IU青霉素，5000μg链霉素和10μg两性霉素B）。5.2.4细胞：原代人胚肾细胞或其他原代细胞如人羊膜、人胚肺、猴肾等或人二倍体细胞或传代细胞如B95a细胞，一般不超过四代，按常规胰酶消化方法制备。5.2.5培养液：199培养液、生长液中加10%胎牛血清，维持液中加3%（或无）胎牛血清，含青霉素200IU/mL、链霉素200μg/mL。
5.2.6细胞分散液：0.25%胰蛋白酶。5.3样品采集
宜在皮疹出现前，柯氏斑出现时采集样品。将灭菌棉棒稍蘸液体（2%牛血清Eagle液），反复涂抹病猴咽部数次，然后将棉棒浸于放入2mL含有高浓度青霉素和链霉素的无钙镁PBS液中（1mL~～1.5mL)反复挤压。加肝素抗凝的血液白细胞中也可分离病毒5.4病毒培养
取0.1mL～0.2mL样品液接种于生长在试管中的单层原代人胚肾细胞（或其他原代细胞如人羊膜、人胚肺、猴肾等或人二倍体细胞或传代细胞如B95a细胞）上，37℃1h后弃液，再加入含双倍常规抗生素量的细胞维持液1mL，37℃培养。开设未接种样品的空白对照培养。逐日观察，待80%～90%细胞出现病变时收获病毒悬液冻融或超声波处理后，3000r/min10min，取上清液，分装小瓶，置一70℃保存备用。若未见病变需连续盲传三代，每次培养观察2周，如仍不出现病变则为阴性。6病毒中和试验
6.1病毒繁殖
收获B95a细胞上出现CPE的病毒悬液，复传一代，待CPE达85%以上，收获病毒培养物冻融1次，3000r/min10min，取上清，分装置一70℃保存备用。6.2病毒毒力测定
制备的病毒抗原或购进的标准病毒抗原，用维持液将其作10倍递增稀释至10-\，每一梯度病毒稀释液接种细胞培养板八孔，每孔50μL。随后每孔加人细胞悬液（3×105个细胞/mL)100μL和细胞培养液50μL。同时，每板设8孔细胞对照。置37℃二氧化碳培养箱培养，从24h～168h逐日观察细胞病变，按Karber方法计算培养细胞半数感染量（TCIDso/50μL）。6.3中和测定
6.3.1细胞对照：设4孔正常细胞对照，每孔加细胞悬液100μL（3×105个细胞/mL）、细胞维持液100μL。
6.3.2阴性对照：设4孔阴性对照，每孔加阴性血清和100TCIDso/50μL病毒悬液各50μL，再加入细胞悬液100μL（3×105个细胞/mL）。6.3.3病毒回归对照：将被鉴定病毒稀释成1000、100、10、1、0.1TCID5o/50μL，每个稀释度作4孔，每孔加人病毒悬液50μL，再加人细胞悬液100μL（3×105个细胞/mL），补充细胞维持液50μL。6.3.4中和：用100TCID50/50L猴麻疹病毒分离毒株与猴麻疹病毒标准阳性血清（效价不低于1：32)作微量中和试验。试验在96孔组织培养板上进行，阳性血清、阴性血清经56℃30min灭能。2
SN/T4067—2014
标准阳性血清作1：10稀释，平行作4孔，每孔加1：10稀释的阳性血清和100TCID5o/50μL病毒各50μL，振荡3min～5min，置37℃中和1h，加入细胞悬液100uL（3×105个细胞/mL)，置37℃二氧化碳培养箱培养。
6.4结果判定
当病毒对照在100TCIDso/50μL～300TCIDso/50μL出现CPE，阴性、正常细胞对照成立时，才能进行判定。判定时间为24h～168h。经1：10稀释的猴麻疹病某型标准阳性血清能与病毒中和，使50%以上的细胞不出现CPE者判为阳性，即为鉴定病毒的血清型7实时荧光PCR实验
7.1设备和器材
荧光定量PCR仪；高速冷冻离心机；旋涡混勾器；恒温循环水浴槽；低温冰箱；可调单头微量移液器(0.1μL~2.5μL0.5μL~10.0μL,10μL~100μL,20μL~200μL)。7.2试剂和材料
7.2.1病毒基因组RNA提取试剂盒7.2.2引物和探针：
上游引物：5'-TCCGATACAACCTACCACCTACA-3下游引物：5'-ATCGCTGTCCTCAACAACCC-3”荧光探针：5'-FAM-TGGTGCCCCAGGTCAGAGTCATAGAT-TAMRA-3”7.2.3对照设立：
阳性对照：用已知MV病毒阳性组织制备的模板。阴性对照：用已知MV病毒阴性组织制备的模板。空白对照：用等体积的水代替模板7.3操作方法
7.3.1RNA的提取
7.3.1.1在样品处理区进行。所有RNA提取器血用DEPC水浸泡24h，灭菌后方可使用，7.3.1.2取n个1.5mL灭菌离心管，其中n为待检样品数、一管阳性对照、一管阴性对照和一管空白对照之和，对每管进行编号标记。7.3.1.3每管加入750μLTrizol，然后分别加人待检样品、阳性对照和阴性对照、去离子水各250μL，混匀，静置5min；再加人200μL三氯甲烷，混匀，静置5min，于4℃条件下，12000r/min离心15min。
7.3.1.4取相同数量的1.5mL灭菌离心管，加入500μL异丙醇（-20℃预冷），对各个管进行对应编号。吸取离心后各管中的上清液转移至相应的新管中，上清液约吸取500L（注意不要吸出中间白色絮状层），轻轻颠倒均匀。
7.3.1.5于4℃条件下，12000r/min离心15min。取出离心管，轻轻倒去上清液，加人1mL75%乙醇，颠倒洗涤。
7.3.1.6于4℃条件下，12000r/min离心15min。取出离心管，轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。7.3.1.7每管加入20μL灭菌DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保3
SN/T4067—2014
存备用。提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增或放置于一70℃冰箱备用。7.3.2实时荧光定量RT-PCR反应体系使用OneStepPrimeScriptTMRT-PCRKit(ABI7500)试剂盒进行实时荧光RT-PCR，也可使用其他等效的荧光PCR检测试剂盒。25μL反应体系中含有2×OneStepRT-PCRBufferⅢ12.5μL,ExTaqHS0.25-μL，PrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.25μL，上游引物（浓度为20umol/L）、下游引物（浓度为20μmol/L)和探针（浓度为10μmol/L）各0.5μL，ddHO5.5μL，RNA模板5μL。7.3.3荧光PCR反应的循环程序
将PCR管放人荧光PCR热循环仪中，按下列程序进行猴麻疹病毒核酸扩增：50℃30min，94℃2min，94℃30s，59.1℃30s，72℃30s45个循环，收集荧光信号7.4结果判定
7.4.1结果分析条件设定
直接读取检测结果。阅值设定原则根据仪器噪音情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准。
7.4.2质控标准
空白对照：无Ct值并且无扩增曲线。阴性对照：无Ct值并且无扩增曲线。阳性对照：Ct值应小于或等于35.0，并出现特定的扩增曲线有效原则：如空白对照、阴性对照和阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。7.4.3结果描述及判定
同时进行的阴性、阳性和空白对照实验结果正常，待检样品无荧光增幅现象，则判断样品中未7.4.3.1
检出猴麻疹病毒病原。
7.4.3.2同时进行的阴性、阳性和空白对照实验结果正常，待检样品有明显的荧光增幅曲线，且Ct值小于或等于35时，则判断样品中检出猴麻疹病毒病原阳性。7.4.3.3同时进行的阴性、阳性和空白对照实验结果正常，待检样品荧光增幅曲线的Ct值介于35和40之间时，应重新进行实时荧光PCR检测。若重新检测的Ct值大于或等于40时，则判断样品中未检出猴麻疹病毒病原。若重新检测的Ct值仍介于35和40之间，则判断样品中检出猴麻疹病毒病原阳性。
8ELISA抗体检测试验
设备和器材
可检测450nm波长的酶标仪、培养箱、4℃冰箱、微量移液器、96孔酶标板、吸管、量筒等。8.2试剂和材料
包被液、抗原和单抗稀释液、血清稀释液、PBST、底物液和终止液的配置方法见B.6。4
8.3操作步骤
8.3.1包被
SN/T4067—2014
用碳酸盐缓冲液（pH9.6）稀释抗原（猴麻疹病毒或表达蛋白）至工作浓度，包被96孔ELISA反应板，每孔100μL，4℃包被过夜。8.3.2洗板
甩去板中液体，每孔加200μLPBST缓冲液，洗板3次，每次5min，拍干。8.3.3封闭
每孔加人200μL含5%脱脂乳的PBST封闭液，37℃封闭2h8.3.4洗板
按8.3.2操作进行。
8.3.5加样
加入已经稀释的待检血清，在微量孔内分别加人100p阴性对照、阳性对照和1：25倍稀释的待检血清。留一个孔为底物空白使用。37℃孵育1h。8.3.6洗板
按8.3.2操作进行。
8.3.7加单抗
加人工作浓度酶标猴麻疹单克隆抗体（空白孔除外），每孔100μL，37℃孵育1h。8.3.8洗板
按8.3.2操作进行。
8.3.9加底物
每孔加人100μL底物显色液TMB包括空白孔），37℃避光作用10min。8.3.10
每孔加入2mol/L硫酸50μL，终止反应。在10min内测各孔OD值。8.3.11读数
用酶标仪在450nm波长下，测定其吸光值。8.4结果判定
强阳性血清抑制率PI大于或等于85%，弱阳性血清抑制率PI在45%～65%之间，阴性血清OD值在0.8～1.4之间。试验成立，可进行结果判定。被检血清PI大于或等于45%的，判为阳性；被检血清PI小于35%的，判为阴性：被检血清35%≤PI<45%的，判为可疑，需重新检验。如重新检验结果仍为35%≤PI<45%的，则判为阳性。5
SN/T4067—2014
PI按式(1)计算：
式中：
PI——血清抑制率，%。
被检或阳性血清OD值
阴性血清平均OD值
×100%
...........Www.bzxZ.net
....(1)
A.1猴麻疹病毒介绍
附录A
（资料性附录）
SN/T4067—2014
麻疹是麻疹病毒引起的急性呼吸道传染病，主要症状有发热、上呼吸道感染、眼结膜炎等，而出现红色斑丘疹和颊粘膜上有麻疹粘膜斑为其特征，该病主要通过呼吸道传播，患猴咳嗽、喷嚏时，病毒随飞沫排出，直接到达易感猴的呼吸道或眼结膜而致感染，患猴为唯一传染源。一般认为出疹前后5d均有传染性，该病传染性强，易感猴直接接触后90%以上可发病。实验猴麻疹是造成断奶仔猴死亡的重要传染病之一。据统计，在断奶仔猴中麻疹发病率为5%，死亡率为90%。2006年底至2007年在中国南方部分实验猴养殖场曾出现实验猴麻疹，致死率高达90%，给实验猴养殖业造成了极大的经济损失，也直接影响到科学研究的开展。
A.2临床诊断
主要症状有发热，流涕、喷嚏、咳嗽、流泪、畏光，眼结膜充血等，而以皮肤出现红色斑丘疹和口腔颊粘膜上有麻疹粘膜斑为其特征。A.3病理变化
当麻疹病毒侵犯各类组织和细胞时，主要引起炎症，有广泛单核细胞浸润和细胞坏死、融合形成多核巨细胞，此种巨细胞大小不等，形状不一，可含100个以上的细胞核，胞质内及胞核内均可见到嗜酸性包涵体，也可见到聚合的病毒衣壳体，尤以胞质内为多。在单核巨噬细胞系统中见到的多核巨细胞称为华-佛巨细胞（Warthin-Finkeldeycell)，广泛存在于咽部淋巴组织、扁桃体、支气管旁及肠系膜淋巴结、阑尾及肠壁淋巴组织中；在呼吸道和肠道黏膜、皮肤上皮表层等组织找到的融合多核巨细胞称之为上皮巨细胞。呼吸道卡他症状明显时，呼吸道上皮巨细胞常从表面脱落，可在呼吸道分泌物中找到，有一定诊断意义。麻疹皮疹病理活检中可找到典型的上皮巨细胞，皮肤上皮细胞肿胀，空泡变性，出现坏死，继而角化脱屑。皮疹真皮层毛细血管内皮细胞肿胀、增生，伴淋巴细胞和组织细胞浸润，血管扩张，也曾在皮疹处找到病毒抗原。科氏斑病变与皮疹相仿，可坏死成小溃疡，大多为病毒血症结果，而非原发病灶。
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进出境猴麻疹病毒病检疫技术规范Quarantine protocol for measles to entry-exit monkey2014-11-19发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-05-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4067—2014
本标准起草单位：中华人民共和国海南出人境检验检疫局、中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局、中华人民共和国云南出人境检验检疫局、中华人民共和国新疆出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：李丹丹、徐义刚、艾军、季新成、徐维加、林志雄、吴山楠、黄纪徽。1范围
进出境猴麻疹病毒病检疫技术规范SN/T4067—2014
本标准规定了猴麻疹病毒的病原分离、病毒中和试验、实时荧光定量PCR试验、阻断ELISA抗体试验的技术要求。
本标准适用于进出境猴麻疹病毒的检疫2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求SN/T2025动物检疫实验室生物安全操作规范3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
B95a细胞：绒猴淋巴母细胞
CPE：致细胞病变作用（cytopathiceffect）Ct值：荧光信号到达设定的阈值所经历的循环数（cyclethreshold）ELISA：酶联免疫吸附试验（enzyme-linkediimmunosorbnentassay）MV：麻疹病毒（measlesvirus）TCIDso：半数组织培养感染量（tissuecultureinfectivedos4初步诊断
该病的介绍参见A.1，可根据临床诊断和病理变化进行初步诊断，参见A.2、A.3，确诊还需实验室诊断。
5病毒分离
设备和器材
倒置光学显微镜、二氧化碳培养箱、冰箱（一20℃，一70℃）、50μL、100μL微量可调移液器、无菌96孔细胞培养板、无菌塑料滴头、无菌塑料离心管（1.5mL）或5mL~10mL无菌玻璃试管、无菌棉拭子。
5.2试剂和材料
5.2.1病毒：MV病毒标准毒株。实验环境和防护要求见GB19489。1
SN/T4067—2014
5.2.2血清：MV标准阳性血清、阴性血清。5.2.3被检样品：病猴呼吸道或血液采集标本。若需要长途运输，应将病料置于含有高浓度抗生素运输液中（每毫升5000IU青霉素，5000μg链霉素和10μg两性霉素B）。5.2.4细胞：原代人胚肾细胞或其他原代细胞如人羊膜、人胚肺、猴肾等或人二倍体细胞或传代细胞如B95a细胞，一般不超过四代，按常规胰酶消化方法制备。5.2.5培养液：199培养液、生长液中加10%胎牛血清，维持液中加3%（或无）胎牛血清，含青霉素200IU/mL、链霉素200μg/mL。
5.2.6细胞分散液：0.25%胰蛋白酶。5.3样品采集
宜在皮疹出现前，柯氏斑出现时采集样品。将灭菌棉棒稍蘸液体（2%牛血清Eagle液），反复涂抹病猴咽部数次，然后将棉棒浸于放入2mL含有高浓度青霉素和链霉素的无钙镁PBS液中（1mL~～1.5mL)反复挤压。加肝素抗凝的血液白细胞中也可分离病毒5.4病毒培养
取0.1mL～0.2mL样品液接种于生长在试管中的单层原代人胚肾细胞（或其他原代细胞如人羊膜、人胚肺、猴肾等或人二倍体细胞或传代细胞如B95a细胞）上，37℃1h后弃液，再加入含双倍常规抗生素量的细胞维持液1mL，37℃培养。开设未接种样品的空白对照培养。逐日观察，待80%～90%细胞出现病变时收获病毒悬液冻融或超声波处理后，3000r/min10min，取上清液，分装小瓶，置一70℃保存备用。若未见病变需连续盲传三代，每次培养观察2周，如仍不出现病变则为阴性。6病毒中和试验
6.1病毒繁殖
收获B95a细胞上出现CPE的病毒悬液，复传一代，待CPE达85%以上，收获病毒培养物冻融1次，3000r/min10min，取上清，分装置一70℃保存备用。6.2病毒毒力测定
制备的病毒抗原或购进的标准病毒抗原，用维持液将其作10倍递增稀释至10-\，每一梯度病毒稀释液接种细胞培养板八孔，每孔50μL。随后每孔加人细胞悬液（3×105个细胞/mL)100μL和细胞培养液50μL。同时，每板设8孔细胞对照。置37℃二氧化碳培养箱培养，从24h～168h逐日观察细胞病变，按Karber方法计算培养细胞半数感染量（TCIDso/50μL）。6.3中和测定
6.3.1细胞对照：设4孔正常细胞对照，每孔加细胞悬液100μL（3×105个细胞/mL）、细胞维持液100μL。
6.3.2阴性对照：设4孔阴性对照，每孔加阴性血清和100TCIDso/50μL病毒悬液各50μL，再加入细胞悬液100μL（3×105个细胞/mL）。6.3.3病毒回归对照：将被鉴定病毒稀释成1000、100、10、1、0.1TCID5o/50μL，每个稀释度作4孔，每孔加人病毒悬液50μL，再加人细胞悬液100μL（3×105个细胞/mL），补充细胞维持液50μL。6.3.4中和：用100TCID50/50L猴麻疹病毒分离毒株与猴麻疹病毒标准阳性血清（效价不低于1：32)作微量中和试验。试验在96孔组织培养板上进行，阳性血清、阴性血清经56℃30min灭能。2
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标准阳性血清作1：10稀释，平行作4孔，每孔加1：10稀释的阳性血清和100TCID5o/50μL病毒各50μL，振荡3min～5min，置37℃中和1h，加入细胞悬液100uL（3×105个细胞/mL)，置37℃二氧化碳培养箱培养。
6.4结果判定
当病毒对照在100TCIDso/50μL～300TCIDso/50μL出现CPE，阴性、正常细胞对照成立时，才能进行判定。判定时间为24h～168h。经1：10稀释的猴麻疹病某型标准阳性血清能与病毒中和，使50%以上的细胞不出现CPE者判为阳性，即为鉴定病毒的血清型7实时荧光PCR实验
7.1设备和器材
荧光定量PCR仪；高速冷冻离心机；旋涡混勾器；恒温循环水浴槽；低温冰箱；可调单头微量移液器(0.1μL~2.5μL0.5μL~10.0μL,10μL~100μL,20μL~200μL)。7.2试剂和材料
7.2.1病毒基因组RNA提取试剂盒7.2.2引物和探针：
上游引物：5'-TCCGATACAACCTACCACCTACA-3下游引物：5'-ATCGCTGTCCTCAACAACCC-3”荧光探针：5'-FAM-TGGTGCCCCAGGTCAGAGTCATAGAT-TAMRA-3”7.2.3对照设立：
阳性对照：用已知MV病毒阳性组织制备的模板。阴性对照：用已知MV病毒阴性组织制备的模板。空白对照：用等体积的水代替模板7.3操作方法
7.3.1RNA的提取
7.3.1.1在样品处理区进行。所有RNA提取器血用DEPC水浸泡24h，灭菌后方可使用，7.3.1.2取n个1.5mL灭菌离心管，其中n为待检样品数、一管阳性对照、一管阴性对照和一管空白对照之和，对每管进行编号标记。7.3.1.3每管加入750μLTrizol，然后分别加人待检样品、阳性对照和阴性对照、去离子水各250μL，混匀，静置5min；再加人200μL三氯甲烷，混匀，静置5min，于4℃条件下，12000r/min离心15min。
7.3.1.4取相同数量的1.5mL灭菌离心管，加入500μL异丙醇（-20℃预冷），对各个管进行对应编号。吸取离心后各管中的上清液转移至相应的新管中，上清液约吸取500L（注意不要吸出中间白色絮状层），轻轻颠倒均匀。
7.3.1.5于4℃条件下，12000r/min离心15min。取出离心管，轻轻倒去上清液，加人1mL75%乙醇，颠倒洗涤。
7.3.1.6于4℃条件下，12000r/min离心15min。取出离心管，轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。7.3.1.7每管加入20μL灭菌DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保3
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存备用。提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增或放置于一70℃冰箱备用。7.3.2实时荧光定量RT-PCR反应体系使用OneStepPrimeScriptTMRT-PCRKit(ABI7500)试剂盒进行实时荧光RT-PCR，也可使用其他等效的荧光PCR检测试剂盒。25μL反应体系中含有2×OneStepRT-PCRBufferⅢ12.5μL,ExTaqHS0.25-μL，PrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.25μL，上游引物（浓度为20umol/L）、下游引物（浓度为20μmol/L)和探针（浓度为10μmol/L）各0.5μL，ddHO5.5μL，RNA模板5μL。7.3.3荧光PCR反应的循环程序
将PCR管放人荧光PCR热循环仪中，按下列程序进行猴麻疹病毒核酸扩增：50℃30min，94℃2min，94℃30s，59.1℃30s，72℃30s45个循环，收集荧光信号7.4结果判定
7.4.1结果分析条件设定
直接读取检测结果。阅值设定原则根据仪器噪音情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准。
7.4.2质控标准
空白对照：无Ct值并且无扩增曲线。阴性对照：无Ct值并且无扩增曲线。阳性对照：Ct值应小于或等于35.0，并出现特定的扩增曲线有效原则：如空白对照、阴性对照和阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。7.4.3结果描述及判定
同时进行的阴性、阳性和空白对照实验结果正常，待检样品无荧光增幅现象，则判断样品中未7.4.3.1
检出猴麻疹病毒病原。
7.4.3.2同时进行的阴性、阳性和空白对照实验结果正常，待检样品有明显的荧光增幅曲线，且Ct值小于或等于35时，则判断样品中检出猴麻疹病毒病原阳性。7.4.3.3同时进行的阴性、阳性和空白对照实验结果正常，待检样品荧光增幅曲线的Ct值介于35和40之间时，应重新进行实时荧光PCR检测。若重新检测的Ct值大于或等于40时，则判断样品中未检出猴麻疹病毒病原。若重新检测的Ct值仍介于35和40之间，则判断样品中检出猴麻疹病毒病原阳性。
8ELISA抗体检测试验
设备和器材
可检测450nm波长的酶标仪、培养箱、4℃冰箱、微量移液器、96孔酶标板、吸管、量筒等。8.2试剂和材料
包被液、抗原和单抗稀释液、血清稀释液、PBST、底物液和终止液的配置方法见B.6。4
8.3操作步骤
8.3.1包被
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用碳酸盐缓冲液（pH9.6）稀释抗原（猴麻疹病毒或表达蛋白）至工作浓度，包被96孔ELISA反应板，每孔100μL，4℃包被过夜。8.3.2洗板
甩去板中液体，每孔加200μLPBST缓冲液，洗板3次，每次5min，拍干。8.3.3封闭
每孔加人200μL含5%脱脂乳的PBST封闭液，37℃封闭2h8.3.4洗板
按8.3.2操作进行。
8.3.5加样
加入已经稀释的待检血清，在微量孔内分别加人100p阴性对照、阳性对照和1：25倍稀释的待检血清。留一个孔为底物空白使用。37℃孵育1h。8.3.6洗板
按8.3.2操作进行。
8.3.7加单抗
加人工作浓度酶标猴麻疹单克隆抗体（空白孔除外），每孔100μL，37℃孵育1h。8.3.8洗板
按8.3.2操作进行。
8.3.9加底物
每孔加人100μL底物显色液TMB包括空白孔），37℃避光作用10min。8.3.10
每孔加入2mol/L硫酸50μL，终止反应。在10min内测各孔OD值。8.3.11读数
用酶标仪在450nm波长下，测定其吸光值。8.4结果判定
强阳性血清抑制率PI大于或等于85%，弱阳性血清抑制率PI在45%～65%之间，阴性血清OD值在0.8～1.4之间。试验成立，可进行结果判定。被检血清PI大于或等于45%的，判为阳性；被检血清PI小于35%的，判为阴性：被检血清35%≤PI<45%的，判为可疑，需重新检验。如重新检验结果仍为35%≤PI<45%的，则判为阳性。5
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PI按式(1)计算：
式中：
PI——血清抑制率，%。
被检或阳性血清OD值
阴性血清平均OD值
×100%
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....(1)
A.1猴麻疹病毒介绍
附录A
（资料性附录）
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麻疹是麻疹病毒引起的急性呼吸道传染病，主要症状有发热、上呼吸道感染、眼结膜炎等，而出现红色斑丘疹和颊粘膜上有麻疹粘膜斑为其特征，该病主要通过呼吸道传播，患猴咳嗽、喷嚏时，病毒随飞沫排出，直接到达易感猴的呼吸道或眼结膜而致感染，患猴为唯一传染源。一般认为出疹前后5d均有传染性，该病传染性强，易感猴直接接触后90%以上可发病。实验猴麻疹是造成断奶仔猴死亡的重要传染病之一。据统计，在断奶仔猴中麻疹发病率为5%，死亡率为90%。2006年底至2007年在中国南方部分实验猴养殖场曾出现实验猴麻疹，致死率高达90%，给实验猴养殖业造成了极大的经济损失，也直接影响到科学研究的开展。
A.2临床诊断
主要症状有发热，流涕、喷嚏、咳嗽、流泪、畏光，眼结膜充血等，而以皮肤出现红色斑丘疹和口腔颊粘膜上有麻疹粘膜斑为其特征。A.3病理变化
当麻疹病毒侵犯各类组织和细胞时，主要引起炎症，有广泛单核细胞浸润和细胞坏死、融合形成多核巨细胞，此种巨细胞大小不等，形状不一，可含100个以上的细胞核，胞质内及胞核内均可见到嗜酸性包涵体，也可见到聚合的病毒衣壳体，尤以胞质内为多。在单核巨噬细胞系统中见到的多核巨细胞称为华-佛巨细胞（Warthin-Finkeldeycell)，广泛存在于咽部淋巴组织、扁桃体、支气管旁及肠系膜淋巴结、阑尾及肠壁淋巴组织中；在呼吸道和肠道黏膜、皮肤上皮表层等组织找到的融合多核巨细胞称之为上皮巨细胞。呼吸道卡他症状明显时，呼吸道上皮巨细胞常从表面脱落，可在呼吸道分泌物中找到，有一定诊断意义。麻疹皮疹病理活检中可找到典型的上皮巨细胞，皮肤上皮细胞肿胀，空泡变性，出现坏死，继而角化脱屑。皮疹真皮层毛细血管内皮细胞肿胀、增生，伴淋巴细胞和组织细胞浸润，血管扩张，也曾在皮疹处找到病毒抗原。科氏斑病变与皮疹相仿，可坏死成小溃疡，大多为病毒血症结果，而非原发病灶。
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