SN/T 4163-2015.Real time PCR detection methods of Lassa fever virus at ports.
1范围
SN/T 4163规定了国境口岸拉沙热病毒检测的生物安全要求,标本的采集、运输和保存,标本的处理,拉沙热病毒实时荧光RT-PCR检测方法。
SN/T 4163适用于国境口岸人出境疑似拉沙热病毒感染对象的实时荧光RT-PCR检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安 全通用要求
人间传染的病原微生物名录(卫生部)
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1拉沙热病毒Lassa fever virus
属于沙粒病毒科,病毒直径约80nm~150nm(平均100 nm),有包膜。拉沙热病毒的基因组为2条单股负链RNA(S和L),S片段全长3.5 kb,编码病毒的核蛋白(NP)和包膜糖蛋白(GP1、GP2),L片段全长7.2 kb,编码病毒RNA多聚酶和Z蛋白。
3.2拉沙热Lassa fever
是由拉沙热病毒(Lassa fever virus)引起、主要经啮齿类动物传播的一种急性传染病。临床表现主要为发热、寒战、咽炎、胸骨后疼痛和蛋白尿,可出现多系统病变。本病主要在几内亚、利比里亚、塞拉利昂和尼日利亚等西非国家流行。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
实时荧光RT-PCR:实时荧光反转录聚合酶链反应;
Ct值:    每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数;
RNA:    核糖核酸;
FAM:   FAM荧光染料,一种荧光报告基团。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4163—2015
国境口岸拉沙热病毒荧光PCR检测方法Real timePCRdetection methods of Lassa fever virus at ports2015-02-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-09-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草，本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4163—2015
本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中国科学院武汉病毒研究所。本标准主要起草人：师永霞、史蕾、卓锦雪、丁国允、郑、袁志明、黄吉城、李小波、幸芦琴、洪烨、孙薇、黄弋、钟玉清、相大鹏、郭波旋SN/T4163—2015
由于目前可获得的拉沙热病毒毒株之间基因变异比较大，难以找到所有毒株均保守的基因片段，本标准选用的引物及探针只是针对近十多年来世界各地发现的毒株的序列信息所设计，并不能保证所有不同地理来源的拉沙热病毒均可检出，特此说明。1范围
国境口岸拉沙热病毒荧光PCR检测方法SN/T4163—2015
本标准规定了国境口岸拉沙热病毒检测的生物安全要求，标本的采集、运输和保存，标本的处理，拉沙热病毒实时荧光RT-PCR检测方法。本标准适用于国境口岸人出境疑似拉沙热病毒感染对象的实时荧光RT-PCR检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求人间传染的病原微生物名录（卫生部）3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
拉沙热病毒Lassafevervirus
属于沙粒病毒科，病毒直径约80nm~150nm（平均100nm），有包膜。拉沙热病毒的基因组为2条单股负链RNA（S和L)，S片段全长3.5kb，编码病毒的核蛋白（NP）和包膜糖蛋白（GP1、GP2），L片段全长7.2kb，编码病毒RNA多聚酶和Z蛋白。3.2
拉沙热Lassafever
是由拉沙热病毒（Lassafevervirus）引起、主要经啮齿类动物传播的一种急性传染病。临床表现主要为发热、寒战、咽炎、胸骨后疼痛和蛋白尿，可出现多系统病变。本病主要在几内亚、利比里亚、塞拉利昂和尼日利亚等西非国家流行。4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
实时荧光RT-PCR：实时荧光反转录-聚合酶链反应；Ct值：
RNA：
5生物安全要求
每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数；核糖核酸；
FAM荧光染料，一种荧光报告基团。拉沙热病毒相关材料的实验活动按照GB19489和《人间传染的病原微生物名录》中的生物安全要1
SN/T4163—2015
求进行。
6标本的采集、运输和保存
6.1人血清
无菌采集疑似病例发病14d内静脉血3mL～5mL，室温静置30min使其凝固，500×g离心10min，收集血清于2mL无菌螺口塑料管中，用耐低温油性记号笔记上编号，低温送到实验室检测。如24h内不能送到实验室，将血清置于一70℃保存。6.2
鼠排泄物
将鼠液体排泄物2mL或固体排泄物2g装至有螺旋帽的无菌管中，用耐低温油性记号笔记上编号，低温运输或一70℃以下保存待检。6.3鼠体标本
无菌解剖可疑染毒鼠后，收集鼠脏器于有螺旋帽的无菌管中，用耐低温油性记号笔记上编号，低温运输或一70℃以下保存待检。
7拉沙热病毒的实时荧光RT-PCR检测7.1主要仪器
本方法使用的主要仪器包括荧光定量PCR仪、超净工作台、ⅡA级生物安全柜、高压灭菌锅、低温高速离心机（最大离心力20000×g）、漩涡振荡器、冰箱（4℃7.2主要试剂
20℃和一70℃)和移液器等。
可包括核酸提取试剂如Qiagen公司的QIAampViralRNAKit提取病毒核本方法使用的主要试剂
酸!、实时荧光RT-PCR通用试剂如（pH7.0）、无RNA酶的DEPC
引物/探针名称
Lf1-FP
Lf1-RP
Ambion公司的Ag-Path-IDTN
物和探针等
OnestepRT-PCRKit2、PBS溶液
引物和探针序列见表1。
拉沙热病毒实时荧光RT-PCR检测的引物和探针序列（5*-3）
CTCATGGGATTGATGTCACAGA
CGAGGGAGTGCTTCTATAACTGC
FAM-acctggc+Tgtgc+Agcaaac-BHQ1AAGGACCTATGCCACATGCACAC
AGGAGTTATCTCTTCTTTGCCACC
CAAGGATTTGTGTCACATGCACAC
AGGGGTTATTTCCTCTTTGCC
FAM-ttcttct+Tc+Tcaa+Caa+Cg+Acacc-BHQl扩增片段
碱基前含“+\表示该碱基
为LNA修饰，预期扩增
NP基因片段为74bp
碱基前含“十”表示该碱基
为LNA修饰，预期扩增
NP基因片段为75bp
1)，2）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2
7.3样本处理
SN/T4163—2015
人血清样本不需进行处理，直接可用于核酸提取。在鼠排泄物样本中加人10mL的PBS溶液，涡旋混勾，配平后置预冷4℃的离心机上，8000×g离心15min，取上清液进行核酸的提取。鼠脏器加人适量PBS，将组织充分研磨均匀，同上离心处理取上清液进行核酸提取，7.4核酸提取
按试剂盒说明提取核酸，用于实时荧光RT-PCR检测。或一7O℃C储存RNA待检。7.5加样
根据加人引物和探针的不同，每份标本分别准备两管不同的实时荧光RT-PCR反应液。第一管待检标本反应液的组成为：2×RT-PCRBuffer10μL、10μMLf1-FP1μL、10μMLf1-RP1μL、5μMLP11μL、25×RT-PCREnzymeMix0.8μL、模板RNA6.2μL共20μL反应体系；第二管待检标本反应液的组成为:2×RT-PCRBuffer10μL、20μMLf2-10.5μL、20μMLr2-10.5μL、20μMLf2-20.5μL、20μMLr2-20.5μL、5μMLP21μL、25XRT-PCREnzymeMix0.8μL、模板RNA6.2μL,共20μL反应体系。每个反应体系均设立阴性对照和阳性对照，阳性对照模板分别为根据拉沙热病毒上下游引物间的核苷酸序列体外转录的RNA片段，阴性对照模板为不含拉沙热病毒核酸的标本或无RNA酶的水。
S实时荧光RT-PCR扩增反应
在不同的荧光定量PCR仪上，TaqMan探针实时荧光RT-PCR的反应条件略有不同。以ABI7900HT荧光定量PCR仪为例，实时荧光RT-PCR检测扩增程序为：50℃10min，95℃10min；95℃5S，56℃30s（收集荧光信号），45个循环。如使用其他仪器，应根据其他仪器的要求设置具体的反应条件。
7.7结果分析
7.7.1阈值确定
一般是以荧光PCR反应的前3个～15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，以本底信号标准差的10倍作为荧光阈值，以样品扩增产生的荧光信号达到荧光阈值时所对应的循环数为循环阈值(Ct值）。
7.7.2质量控制wwW.bzxz.Net
反应结果应同时符合以下2个条件：阴性对照无扩增曲线；
阳性对照Ct<35并有明显扩增曲线。7.7.3结果判定
根据以下条件进行结果判定：
一无明显扩增曲线，判断为拉沙热病毒实时荧光RT-PCR检测阴性；两管待检标本反应体系中有一管或两管有明显扩增曲线，且Ct值≤40，判断为拉沙热病毒实时荧光RT-PCR检测阳性；
SN/T4163—2015
有明显扩增曲线，且40阳性标本的确认：实时荧光RT-PCR结果阳性的标本可进一步采用其他相应的方法验证分析，确认是否为拉沙热病毒核酸阳性。
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