SN/T 4230-2015
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标准简介
SN/T 4230-2015.Quarantine protocol for haemophilus parasuis disease.
1范围
SN/T 4230规定了副猪嗜血杆菌病的临床诊断和实验室检测方法。
SN/T 4230适用于副猪嗜血杆菌病的诊断和检疫。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T4789.28食品微生物学检验染色法、培养基和试剂
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3培养基及试剂
3.1 水:符合GB/T 6682中一级水的规格。
3.2无菌脱纤绵羊血。
3..3无菌犊牛血清。
3.4 烟酰胺腺嘌吟二核苷酸(NAD)。
3.5 胰蛋白大豆琼脂(TSA):见A.1。
3.6 胰蛋白大豆肉汤(TSB):见A.2。
3.7 巧克力琼脂平板:见A.3。
3.8 鲜血琼脂平板:见A.4。
3.9 革兰氏染色液:见A.5。
3.10 生化用培养基:按GB/T 4789.28的规定配制。
3.11电泳级琼脂糖粉。
3.12 Taq DNA聚合酶:5U/μL。
3.13100 bp DNA ladder Marker(脱氧核糖核酸分子量标准)。
3.14 10倍浓度Taq DNA聚合酶缓冲液(10×Taq Buffer):含15 mmol/L氯化镁。
3.15 dNTP混合物:脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)各2.5 mmol/L。
1范围
SN/T 4230规定了副猪嗜血杆菌病的临床诊断和实验室检测方法。
SN/T 4230适用于副猪嗜血杆菌病的诊断和检疫。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T4789.28食品微生物学检验染色法、培养基和试剂
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3培养基及试剂
3.1 水:符合GB/T 6682中一级水的规格。
3.2无菌脱纤绵羊血。
3..3无菌犊牛血清。
3.4 烟酰胺腺嘌吟二核苷酸(NAD)。
3.5 胰蛋白大豆琼脂(TSA):见A.1。
3.6 胰蛋白大豆肉汤(TSB):见A.2。
3.7 巧克力琼脂平板:见A.3。
3.8 鲜血琼脂平板:见A.4。
3.9 革兰氏染色液:见A.5。
3.10 生化用培养基:按GB/T 4789.28的规定配制。
3.11电泳级琼脂糖粉。
3.12 Taq DNA聚合酶:5U/μL。
3.13100 bp DNA ladder Marker(脱氧核糖核酸分子量标准)。
3.14 10倍浓度Taq DNA聚合酶缓冲液(10×Taq Buffer):含15 mmol/L氯化镁。
3.15 dNTP混合物:脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)各2.5 mmol/L。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4230—2015
副猪嗜血杆菌病检疫技术规范
Quarantineprotocolforhaemophilus parasuis disease2015-05-26发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-01-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4230—2015
本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国重庆出入境检验检疫局、南通大学、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。本标准主要起草人：仇保丰、王昱、宋鸿雁、王春来、高峰、司微、顾炳泉、高逢结、刘文斌、李应国。I
1范围
副猪嗜血杆菌病检疫技术规范
本标准规定了副猪嗜血杆菌病的临床诊断和实验室检测方法。本标准适用于副猪嗜血杆菌病的诊断和检疫。2
规范性引用文件
SN/T4230——2015
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T4789.28食品微生物学检验染色法、培养基和试剂GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3
培养基及试剂
水：符合GB/T6682中一级水的规格。无菌脱纤绵羊血。
无菌特牛血清。
烟酰胺腺嘌吟二核苷酸（NAD)。胰蛋白大豆琼脂（TSA）：见A.1。胰蛋白大豆肉汤（TSB)：见A.2。巧克力琼脂平板：见A.3。
鲜血琼脂平板：见A.4。
革兰氏染色液：见A.5。
生化用培养基：按GB/T4789.28的规定配制。电泳级琼脂糖粉。
TaqDNA聚合酶：5U/μL。
10obpDNAladderMarker（脱氧核糖核酸分子量标准）。410倍浓度TaqDNA聚合酶缓冲液（10XTaqBuffer）：含15mmol/L氯化镁。3.14
dNTP混合物：脱氧腺苷三磷酸（dATP)、脱氧胸苷三磷酸（dTTP)、脱氧鸟苷三磷酸（dGTP）、脱氧胞苷三磷酸（dCTP）各2.5mmol/L。3.16
引物（HPS-F:5-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3；HPS-R：5-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3)。
50XTAE电泳缓冲液：见A.6。
6×加样缓冲液：见A.7。
溴化乙锭溶液：见A.8。
副猪嗜血杆菌标准菌株（1～15型）：由指定单位提供。金黄色葡萄球菌（ATCC25923）。猪胸膜肺炎放线杆菌（ATCC27088）。1
SN/T4230—2015
副猪嗜血杆菌阳性血清：由指定单位提供。副猪嗜血杆菌阴性血清：由指定单位提供。牛血清白蛋白(BSA)。
辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG。邻苯二胺（OPD）。
吐温-20。
0.1mol/LPBS缓冲液：见A.9。
包被液：见A.10。
洗涤液：见A.11。
封闭液：见A.12。
底物溶液：见A.13。
终止液：见A.14。
设备与材料wwW.bzxz.Net
电热恒温水槽。
恒温培养箱。
二氧化碳培养箱。
高压灭菌器。
生物显微镜。
微量加样器。
高速冷冻离心机。
PCR仪。
水平凝胶电泳槽。
电泳仪。
凝胶成像系统。
APINH鉴定条或类似产品
16SrDNA细菌鉴定PCR试剂盒。
酶标仪。
空白酶标板。
临床诊断
临床症状及病理变化
临床症状
副猪嗜血杆菌病又称猪的革拉氏病（Glasser'sDisease)，临床表现以呼吸道症状、跛行、胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等为特征。主要在断奶前后和保育阶段发病，通常见于5～8周龄的仔猪，发病率一般为10%15%，死亡率可达50%。急性病例：往往发生于骠情良好的猪，病猪发热（40℃~1）
由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。SN/T4230—2015
42℃)，精神沉郁，厌食消瘦；气喘咳嗽，呼吸困难，鼻孔有黏液性及浆液性分泌物；个别猪腕关节、距关节肿大、疼痛，跛行，运动不协调：可视粘膜发，眼脸皮下水肿，2d～3d死亡：急性感染病例存活后可留下后遗症，如母猪流产，公猪慢性跛行等，仔猪和育肥猪可遗留呼吸道症状和神经症状。慢性病例：多见于保育猪，病猪体温稍高，食欲下降，被毛粗乱，咳嗽，呼吸困难和生长迟滞；四肢无力或肿胀跛行；严重时衰竭死亡。
5.1.2病理变化
浆液性纤维素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎和多发性关节炎：渗出于浆膜表面的浆液性纤维素性渗出物，有时可形成一种假膜；胸腔内有大量的淡红色液体、纤维性渗出物及凝块，肺脏呈纤维素性胸膜肺炎，肺胀水肿，部分有对称性肉样变化脓性或腔积液或内脏粘连；心包积液，心包膜上有奶酪样坏死，并与心脏粘连；全身淋巴结肿大，呈浆液性卡他性炎，暗红色；关节肿大，有浆液性渗出性炎症。
5.2结果判定
根据特征性临床症状和病理变化可以作出初步诊断。进一步确诊应采集样品进行实验室检测。6实验室检测
样品的采集与处理
6.1.1活猪的样品采集
用无菌棉拭子采集鼻腔分泌物，放人无菌试管中；无菌采血并用注射器穿刺采取胸腔液。死猪的样品采集
病猪死亡或扑杀后12h以内，尽早无菌采集死亡猪肺脏、扁桃体、心血、胸水、脑脊液、气管和关节积液等病料。
6.1.3样品处理
采集样品应保存在0℃～4℃条件下，12h以内送到实验室6.2细菌的分离鉴定
6.2.1细菌培养
无菌操作从疑似病猪的肺脏、胸腔积液、心血、关节液、鼻腔分泌物和脑组织等病料中取样，在含NAD的巧克力琼脂平板或TSA琼脂平板分别划线接种，置5%的二氧化碳（CO2）培养箱，37℃培养24h～48h。在巧克力琼脂平板或TSA琼脂平板上，副猪嗜血杆菌呈光滑型、灰白色透明、直径大约0.5mm菌落
6.2.2革兰氏染色
将典型菌落制备涂片，火焰固定。结晶紫染色1min，水洗，革兰氏碘液染色1min，水洗，95%酒精脱色30s，水洗，沙黄复染30s，水洗，干燥，镜检。副猪嗜血杆菌为革兰氏阴性杆菌，具有多种不同形态，一般呈短小杆菌，也有曾球形、短链或丝状等，大小不等，约0.5μm×1.5μm~0.5μm×2.0μm。3
SN/T4230—2015
6.2.3生化试验
将可疑的单菌落进一步纯化后，与金黄色葡萄球菌垂直划线于绵羊鲜血琼脂平板，37℃培养24h～48h。副猪嗜血杆菌在葡萄球菌条状菌苔附近呈现“卫星生长现象”，即金黄色葡萄球菌菌苔附近有较大的菌落生长，而远侧菌落生长较小或无菌生长。同时，观察到菌落具有不溶血现象。接下来将可疑单菌落接种微量生化管，置于5%的二氧化碳（CO2）培养箱中37℃培养24h～48h；或用等效的APINH鉴定条等进行细菌生化鉴定。副猪嗜血杆菌的主要生化特征见表B.1。6.2.4
结果判定
对具有副猪嗜血杆菌特征的菌落进行革兰氏染色，结果为革兰氏阴性。生化试验结果与副猪嗜血杆菌生化特性完全符合时，判定为副猪嗜血杆菌细菌培养阳性；否则，判定为副猪嗜血杆菌培养阴性。聚合酶链式反应（PCR）
6.3.1DNA的提取
从琼脂平板上挑取副猪嗜血杆菌可疑单菌落，接种到5mLTSB培养液中，置37℃摇床中160r/min振荡培养约12h，取1.5mL加人到无菌小离心管中，12000r/min离心5min，弃去上清液，再用25μL灭菌水重悬沉淀，于沸水中作用5min，然后于冰浴中冷却至4℃左右，12000r/min离心10min，取上清液作为PCR反应模板。或者用商品化等效DNA提取试剂盒进行提取。6.3.2
PCR扩增
PCR扩增的目的片段为副猪嗜血杆菌16SrDNA序列的一段。按照表1进行PCR反应体系的配制。
PCR反应体系（50μL体系）
10XTag缓冲液
dNTP混合物（各2.5mmol/L）
引物HPS-F(25pmol/μL)
引物HPS-R(25pmol/μL)
TaqDNA聚合酶（5U/μL)
灭菌水
模板DNA
体积（1个反应）
同时设立阳性对照、阴性对照和空白对照，用副猪嗜血杆菌标准菌株的模板DNA作为阳性对照用猪胸膜肺炎放线杆菌标准菌株的模板DNA作为阴性对照，用水作为空白对照。循环条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃～60℃退火60s，72℃延伸90s，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃下保存。
6.3.3电泳
取1.5g琼脂糖，加人100mL电泳缓冲液加热溶解，加入溴化乙锭至终浓度为1ug/mL，制胶，待胶凝固后加人PCR扩增产物进行电泳，并用DNAladderMarker作对照。电泳完毕后用凝胶成像系统观察、记录结果。
6.3.4结果判定
SN/T4230—2015
阴性对照和空白对照未扩增出自的片段，阳性对照扩增出大小为822bp的清晰条带，DNA分子量标准成立时；被检样品扩增出大小为822bp的条带，判定为副猪嗜血杆菌阳性；被检样品未扩增出大小为822bp的条带，判定为副猪嗜血杆菌阴性。6.4间接酶联免疫吸附试验（I-ELISA）6.4.1包被抗原的制备
将副猪嗜血杆菌5型标准株挑取单菌落接种50mLTSB液体培养基，置37℃摇床中160r/min振荡培养约12h，将菌液移人无菌离心管中，6000r/min离心10min，如此反复用0.1mol/LpH7.4的PBS缓冲液清洗3次。用PBS缓冲液按菌体体积比1：10重悬，在冰浴中进行超声波破碎（时间20min，振幅20%，超声3s停3s）。然后用紫外吸收法测定蛋白含量，确定其浓度，一20℃保存备用。6.4.2操作步骤
6.4.2.1抗原包被：将裂解抗原用包被液稀释至40μg/mL，每孔100μL加入酶标板各孔中，置于湿盒中37℃作用2h后转入4℃包被过夜。6.4.2.2洗涤：甩净孔内抗原溶液，用洗涤液PBST加满各孔，放置3min，然后甩净液体，并在洁净的吸水纸上拍干，如此重复3次。
6.4.2.3封闭：每孔加入1%BSA封闭液100uL，37℃作用1h后，按6.4.2.2的方法洗涤3次。6.4.2.4加待检血清：用封闭液稀释待检血清，按1：200稀释，每孔50μL，同时设立标准阴性血清对照孔两个、阳性血清对照孔和空白对照孔各一个，37℃作用1h后，按6.4.2.2的方法洗涤3次，6.4.2.5加酶标二抗：将免抗猪IgG-辣根过氧化物酶结合物按1：15000稀释，每孔50μL，37℃作用1h后，按步骤6.4.2.2的方法洗涤3次。6.4.2.6显色：加人现配制的OPD底物显色液100μL，37℃避光显色15min。6.4.2.7终止及读数：加人2mol/L的H,SO，终止液，每孔50μL，然后在酶标仪上检测490nm处的OD值。
结果判定
将样品的OD值代人式（1)计算：被检血清样品OD值
阴性对照平均OD值
式中：
S被检血清样品OD值；
N阴性对照平均OD值。
若S/N≥2.5则结果判定为副猪嗜血杆菌抗体阳性，否则判定为副猪嗜血杆菌抗体阴性，6.5琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID）6.5.1琼脂凝胶平板的制备
.（1)
称取琼脂糖1.0g，氯化钠0.85g，加水至100mL，经煮沸溶解后，冷却至45℃，加入0.01g叠氮钠。每个平血加融化琼脂，使琼脂板厚度约为4mm，待凝固后倒置4℃冰箱保存备用。5
SN/T4230—2015
6.5.2打孔
中间1孔，周围6孔为一组。孔径4mm，孔间距3mm。用针挑出或吸出孔内琼脂，用火焰封底。孔的布局参见图1。
6.5.3加样
检测血清：用微量移液器加样，周边孔加副猪嗜血杆菌1～15型标准菌株抗原，中间加入待检血清，待检血清加样孔两边分别设立阴性血清对照孔和阳性血清对照孔，同时要保证一对标准抗原能与其相应的阳性血清对照孔相邻，加样量以加满为宜。加样完毕后，将凝胶板放人湿盒置37℃温箱中孵育。6.5.4结果判定
加样后24h开始观察，每天观察并记录，连续观察3d，当标准抗原与与相应标准阳性血清间出现沉
淀线时，被检血清与标准菌株抗原间也出现明显清晰的沉淀线，即可判定待检血清为阳性；否则判定为阴性。见图1。
说明：
待检血清孔：
7综合判定
标准抗原孔：
阴性血清对照孔：
阳性血清对照孔。
琼脂凝胶免疫扩散试验加样示意图7.1当猪出现特征性的临床症状和病理变化，若细菌分离鉴定和PCR的结果均为阳性时，判定为副猪嗜血杆菌病阳性；若细菌分离鉴定和PCR的结果均为阴性时，判定为副猪嗜血杆菌病阴性。7.2当猪出现的特征性临床症状和病理变化，若细菌分离鉴定和PCR的结果不一致时，可用6.3PCR或16SrDNA细菌鉴定PCR试剂盒对细菌16SrDNA进行扩增并测序，根据DNA测序和分析结果做出准确判定。
7.3当非免疫猪出现特征性的临床症状和病理变化，且实验室I-ELISA或AGID检测出副猪嗜血杆菌抗体时，判定为副猪嗜血杆菌病阳性，否则判定为阴性。6
胰蛋白大豆琼脂（TSA）
胰酶消化酪蛋白
大豆蛋白陈
氯化钠（NaCI）
蒸馏水加至
附录A
（规范性附录）
培养基与试剂配制
1000ml
SN/T4230—2015
将以上各成分溶解于蒸馏水中，调pH至7.1~7.5，加热煮沸溶解。于121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却至50℃，加入50mL灭活的新生牛血清和10mL经过滤除菌的1%NAD，充分摇匀后倾注平板。
胰蛋白大豆肉汤（TSB）
胰酶消化酪蛋白
大豆蛋白陈
氯化钠(NaCI)
磷酸氢二钾（K,HPO4·3HzO）
葡萄糖
蒸馏水加至
1000ml
将以上各成分溶解于蒸馏水中，调pH至71～7.5.加热煮沸溶解。于121℃高压蒸汽灭菌15min。使用前，加人50mL灭活的新生巧克力琼脂平板
血清和10mL过滤除菌的1%NAD，充分摇匀后使用。配制TSA培养基1000mL，于121C高压蒸汽灭菌15min.冷却至50℃，加人50mL~100mL无菌脱纤绵羊鲜血，充分混勾后于80℃水浴，待培养基颜色完全变成巧克力色（约需5min～10min）后，冷却至50℃，加人50mL灭活的新生牛血清和10mL过滤除菌的1%NAD，充分摇匀后倾注平板。A.4
鲜血琼脂平板
配制TSA培养基1000mL，于121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却至50℃，加入50mL~100mL无菌脱纤绵羊鲜血，充分摇勾后倾注平板。A.5
革兰氏染色液
A.5.1结晶紫染色液
结晶紫
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副猪嗜血杆菌病检疫技术规范
Quarantineprotocolforhaemophilus parasuis disease2015-05-26发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-01-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4230—2015
本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国重庆出入境检验检疫局、南通大学、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。本标准主要起草人：仇保丰、王昱、宋鸿雁、王春来、高峰、司微、顾炳泉、高逢结、刘文斌、李应国。I
1范围
副猪嗜血杆菌病检疫技术规范
本标准规定了副猪嗜血杆菌病的临床诊断和实验室检测方法。本标准适用于副猪嗜血杆菌病的诊断和检疫。2
规范性引用文件
SN/T4230——2015
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T4789.28食品微生物学检验染色法、培养基和试剂GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3
培养基及试剂
水：符合GB/T6682中一级水的规格。无菌脱纤绵羊血。
无菌特牛血清。
烟酰胺腺嘌吟二核苷酸（NAD)。胰蛋白大豆琼脂（TSA）：见A.1。胰蛋白大豆肉汤（TSB)：见A.2。巧克力琼脂平板：见A.3。
鲜血琼脂平板：见A.4。
革兰氏染色液：见A.5。
生化用培养基：按GB/T4789.28的规定配制。电泳级琼脂糖粉。
TaqDNA聚合酶：5U/μL。
10obpDNAladderMarker（脱氧核糖核酸分子量标准）。410倍浓度TaqDNA聚合酶缓冲液（10XTaqBuffer）：含15mmol/L氯化镁。3.14
dNTP混合物：脱氧腺苷三磷酸（dATP)、脱氧胸苷三磷酸（dTTP)、脱氧鸟苷三磷酸（dGTP）、脱氧胞苷三磷酸（dCTP）各2.5mmol/L。3.16
引物（HPS-F:5-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3；HPS-R：5-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3)。
50XTAE电泳缓冲液：见A.6。
6×加样缓冲液：见A.7。
溴化乙锭溶液：见A.8。
副猪嗜血杆菌标准菌株（1～15型）：由指定单位提供。金黄色葡萄球菌（ATCC25923）。猪胸膜肺炎放线杆菌（ATCC27088）。1
SN/T4230—2015
副猪嗜血杆菌阳性血清：由指定单位提供。副猪嗜血杆菌阴性血清：由指定单位提供。牛血清白蛋白(BSA)。
辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG。邻苯二胺（OPD）。
吐温-20。
0.1mol/LPBS缓冲液：见A.9。
包被液：见A.10。
洗涤液：见A.11。
封闭液：见A.12。
底物溶液：见A.13。
终止液：见A.14。
设备与材料wwW.bzxz.Net
电热恒温水槽。
恒温培养箱。
二氧化碳培养箱。
高压灭菌器。
生物显微镜。
微量加样器。
高速冷冻离心机。
PCR仪。
水平凝胶电泳槽。
电泳仪。
凝胶成像系统。
APINH鉴定条或类似产品
16SrDNA细菌鉴定PCR试剂盒。
酶标仪。
空白酶标板。
临床诊断
临床症状及病理变化
临床症状
副猪嗜血杆菌病又称猪的革拉氏病（Glasser'sDisease)，临床表现以呼吸道症状、跛行、胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等为特征。主要在断奶前后和保育阶段发病，通常见于5～8周龄的仔猪，发病率一般为10%15%，死亡率可达50%。急性病例：往往发生于骠情良好的猪，病猪发热（40℃~1）
由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。SN/T4230—2015
42℃)，精神沉郁，厌食消瘦；气喘咳嗽，呼吸困难，鼻孔有黏液性及浆液性分泌物；个别猪腕关节、距关节肿大、疼痛，跛行，运动不协调：可视粘膜发，眼脸皮下水肿，2d～3d死亡：急性感染病例存活后可留下后遗症，如母猪流产，公猪慢性跛行等，仔猪和育肥猪可遗留呼吸道症状和神经症状。慢性病例：多见于保育猪，病猪体温稍高，食欲下降，被毛粗乱，咳嗽，呼吸困难和生长迟滞；四肢无力或肿胀跛行；严重时衰竭死亡。
5.1.2病理变化
浆液性纤维素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎和多发性关节炎：渗出于浆膜表面的浆液性纤维素性渗出物，有时可形成一种假膜；胸腔内有大量的淡红色液体、纤维性渗出物及凝块，肺脏呈纤维素性胸膜肺炎，肺胀水肿，部分有对称性肉样变化脓性或腔积液或内脏粘连；心包积液，心包膜上有奶酪样坏死，并与心脏粘连；全身淋巴结肿大，呈浆液性卡他性炎，暗红色；关节肿大，有浆液性渗出性炎症。
5.2结果判定
根据特征性临床症状和病理变化可以作出初步诊断。进一步确诊应采集样品进行实验室检测。6实验室检测
样品的采集与处理
6.1.1活猪的样品采集
用无菌棉拭子采集鼻腔分泌物，放人无菌试管中；无菌采血并用注射器穿刺采取胸腔液。死猪的样品采集
病猪死亡或扑杀后12h以内，尽早无菌采集死亡猪肺脏、扁桃体、心血、胸水、脑脊液、气管和关节积液等病料。
6.1.3样品处理
采集样品应保存在0℃～4℃条件下，12h以内送到实验室6.2细菌的分离鉴定
6.2.1细菌培养
无菌操作从疑似病猪的肺脏、胸腔积液、心血、关节液、鼻腔分泌物和脑组织等病料中取样，在含NAD的巧克力琼脂平板或TSA琼脂平板分别划线接种，置5%的二氧化碳（CO2）培养箱，37℃培养24h～48h。在巧克力琼脂平板或TSA琼脂平板上，副猪嗜血杆菌呈光滑型、灰白色透明、直径大约0.5mm菌落
6.2.2革兰氏染色
将典型菌落制备涂片，火焰固定。结晶紫染色1min，水洗，革兰氏碘液染色1min，水洗，95%酒精脱色30s，水洗，沙黄复染30s，水洗，干燥，镜检。副猪嗜血杆菌为革兰氏阴性杆菌，具有多种不同形态，一般呈短小杆菌，也有曾球形、短链或丝状等，大小不等，约0.5μm×1.5μm~0.5μm×2.0μm。3
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6.2.3生化试验
将可疑的单菌落进一步纯化后，与金黄色葡萄球菌垂直划线于绵羊鲜血琼脂平板，37℃培养24h～48h。副猪嗜血杆菌在葡萄球菌条状菌苔附近呈现“卫星生长现象”，即金黄色葡萄球菌菌苔附近有较大的菌落生长，而远侧菌落生长较小或无菌生长。同时，观察到菌落具有不溶血现象。接下来将可疑单菌落接种微量生化管，置于5%的二氧化碳（CO2）培养箱中37℃培养24h～48h；或用等效的APINH鉴定条等进行细菌生化鉴定。副猪嗜血杆菌的主要生化特征见表B.1。6.2.4
结果判定
对具有副猪嗜血杆菌特征的菌落进行革兰氏染色，结果为革兰氏阴性。生化试验结果与副猪嗜血杆菌生化特性完全符合时，判定为副猪嗜血杆菌细菌培养阳性；否则，判定为副猪嗜血杆菌培养阴性。聚合酶链式反应（PCR）
6.3.1DNA的提取
从琼脂平板上挑取副猪嗜血杆菌可疑单菌落，接种到5mLTSB培养液中，置37℃摇床中160r/min振荡培养约12h，取1.5mL加人到无菌小离心管中，12000r/min离心5min，弃去上清液，再用25μL灭菌水重悬沉淀，于沸水中作用5min，然后于冰浴中冷却至4℃左右，12000r/min离心10min，取上清液作为PCR反应模板。或者用商品化等效DNA提取试剂盒进行提取。6.3.2
PCR扩增
PCR扩增的目的片段为副猪嗜血杆菌16SrDNA序列的一段。按照表1进行PCR反应体系的配制。
PCR反应体系（50μL体系）
10XTag缓冲液
dNTP混合物（各2.5mmol/L）
引物HPS-F(25pmol/μL)
引物HPS-R(25pmol/μL)
TaqDNA聚合酶（5U/μL)
灭菌水
模板DNA
体积（1个反应）
同时设立阳性对照、阴性对照和空白对照，用副猪嗜血杆菌标准菌株的模板DNA作为阳性对照用猪胸膜肺炎放线杆菌标准菌株的模板DNA作为阴性对照，用水作为空白对照。循环条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃～60℃退火60s，72℃延伸90s，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃下保存。
6.3.3电泳
取1.5g琼脂糖，加人100mL电泳缓冲液加热溶解，加入溴化乙锭至终浓度为1ug/mL，制胶，待胶凝固后加人PCR扩增产物进行电泳，并用DNAladderMarker作对照。电泳完毕后用凝胶成像系统观察、记录结果。
6.3.4结果判定
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阴性对照和空白对照未扩增出自的片段，阳性对照扩增出大小为822bp的清晰条带，DNA分子量标准成立时；被检样品扩增出大小为822bp的条带，判定为副猪嗜血杆菌阳性；被检样品未扩增出大小为822bp的条带，判定为副猪嗜血杆菌阴性。6.4间接酶联免疫吸附试验（I-ELISA）6.4.1包被抗原的制备
将副猪嗜血杆菌5型标准株挑取单菌落接种50mLTSB液体培养基，置37℃摇床中160r/min振荡培养约12h，将菌液移人无菌离心管中，6000r/min离心10min，如此反复用0.1mol/LpH7.4的PBS缓冲液清洗3次。用PBS缓冲液按菌体体积比1：10重悬，在冰浴中进行超声波破碎（时间20min，振幅20%，超声3s停3s）。然后用紫外吸收法测定蛋白含量，确定其浓度，一20℃保存备用。6.4.2操作步骤
6.4.2.1抗原包被：将裂解抗原用包被液稀释至40μg/mL，每孔100μL加入酶标板各孔中，置于湿盒中37℃作用2h后转入4℃包被过夜。6.4.2.2洗涤：甩净孔内抗原溶液，用洗涤液PBST加满各孔，放置3min，然后甩净液体，并在洁净的吸水纸上拍干，如此重复3次。
6.4.2.3封闭：每孔加入1%BSA封闭液100uL，37℃作用1h后，按6.4.2.2的方法洗涤3次。6.4.2.4加待检血清：用封闭液稀释待检血清，按1：200稀释，每孔50μL，同时设立标准阴性血清对照孔两个、阳性血清对照孔和空白对照孔各一个，37℃作用1h后，按6.4.2.2的方法洗涤3次，6.4.2.5加酶标二抗：将免抗猪IgG-辣根过氧化物酶结合物按1：15000稀释，每孔50μL，37℃作用1h后，按步骤6.4.2.2的方法洗涤3次。6.4.2.6显色：加人现配制的OPD底物显色液100μL，37℃避光显色15min。6.4.2.7终止及读数：加人2mol/L的H,SO，终止液，每孔50μL，然后在酶标仪上检测490nm处的OD值。
结果判定
将样品的OD值代人式（1)计算：被检血清样品OD值
阴性对照平均OD值
式中：
S被检血清样品OD值；
N阴性对照平均OD值。
若S/N≥2.5则结果判定为副猪嗜血杆菌抗体阳性，否则判定为副猪嗜血杆菌抗体阴性，6.5琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID）6.5.1琼脂凝胶平板的制备
.（1)
称取琼脂糖1.0g，氯化钠0.85g，加水至100mL，经煮沸溶解后，冷却至45℃，加入0.01g叠氮钠。每个平血加融化琼脂，使琼脂板厚度约为4mm，待凝固后倒置4℃冰箱保存备用。5
SN/T4230—2015
6.5.2打孔
中间1孔，周围6孔为一组。孔径4mm，孔间距3mm。用针挑出或吸出孔内琼脂，用火焰封底。孔的布局参见图1。
6.5.3加样
检测血清：用微量移液器加样，周边孔加副猪嗜血杆菌1～15型标准菌株抗原，中间加入待检血清，待检血清加样孔两边分别设立阴性血清对照孔和阳性血清对照孔，同时要保证一对标准抗原能与其相应的阳性血清对照孔相邻，加样量以加满为宜。加样完毕后，将凝胶板放人湿盒置37℃温箱中孵育。6.5.4结果判定
加样后24h开始观察，每天观察并记录，连续观察3d，当标准抗原与与相应标准阳性血清间出现沉
淀线时，被检血清与标准菌株抗原间也出现明显清晰的沉淀线，即可判定待检血清为阳性；否则判定为阴性。见图1。
说明：
待检血清孔：
7综合判定
标准抗原孔：
阴性血清对照孔：
阳性血清对照孔。
琼脂凝胶免疫扩散试验加样示意图7.1当猪出现特征性的临床症状和病理变化，若细菌分离鉴定和PCR的结果均为阳性时，判定为副猪嗜血杆菌病阳性；若细菌分离鉴定和PCR的结果均为阴性时，判定为副猪嗜血杆菌病阴性。7.2当猪出现的特征性临床症状和病理变化，若细菌分离鉴定和PCR的结果不一致时，可用6.3PCR或16SrDNA细菌鉴定PCR试剂盒对细菌16SrDNA进行扩增并测序，根据DNA测序和分析结果做出准确判定。
7.3当非免疫猪出现特征性的临床症状和病理变化，且实验室I-ELISA或AGID检测出副猪嗜血杆菌抗体时，判定为副猪嗜血杆菌病阳性，否则判定为阴性。6
胰蛋白大豆琼脂（TSA）
胰酶消化酪蛋白
大豆蛋白陈
氯化钠（NaCI）
蒸馏水加至
附录A
（规范性附录）
培养基与试剂配制
1000ml
SN/T4230—2015
将以上各成分溶解于蒸馏水中，调pH至7.1~7.5，加热煮沸溶解。于121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却至50℃，加入50mL灭活的新生牛血清和10mL经过滤除菌的1%NAD，充分摇匀后倾注平板。
胰蛋白大豆肉汤（TSB）
胰酶消化酪蛋白
大豆蛋白陈
氯化钠(NaCI)
磷酸氢二钾（K,HPO4·3HzO）
葡萄糖
蒸馏水加至
1000ml
将以上各成分溶解于蒸馏水中，调pH至71～7.5.加热煮沸溶解。于121℃高压蒸汽灭菌15min。使用前，加人50mL灭活的新生巧克力琼脂平板
血清和10mL过滤除菌的1%NAD，充分摇匀后使用。配制TSA培养基1000mL，于121C高压蒸汽灭菌15min.冷却至50℃，加人50mL~100mL无菌脱纤绵羊鲜血，充分混勾后于80℃水浴，待培养基颜色完全变成巧克力色（约需5min～10min）后，冷却至50℃，加人50mL灭活的新生牛血清和10mL过滤除菌的1%NAD，充分摇匀后倾注平板。A.4
鲜血琼脂平板
配制TSA培养基1000mL，于121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却至50℃，加入50mL~100mL无菌脱纤绵羊鲜血，充分摇勾后倾注平板。A.5
革兰氏染色液
A.5.1结晶紫染色液
结晶紫
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