SN/T 4230-2015
基本信息
标准号:
SN/T 4230-2015
中文名称:副猪嗜血杆菌病检疫技术规范
标准类别:商检行业标准(SN)
标准状态:现行
出版语种:简体中文
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相关标签:
嗜血
杆菌
检疫
技术规范
标准分类号
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出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4230-2015.Quarantine protocol for haemophilus parasuis disease.
1范围
SN/T 4230规定了副猪嗜血杆菌病的临床诊断和实验室检测方法。
SN/T 4230适用于副猪嗜血杆菌病的诊断和检疫。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T4789.28食品微生物学检验染色法、培养基和试剂
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3培养基及试剂
3.1 水:符合GB/T 6682中一级水的规格。
3.2无菌脱纤绵羊血。
3..3无菌犊牛血清。
3.4 烟酰胺腺嘌吟二核苷酸(NAD)。
3.5 胰蛋白大豆琼脂(TSA):见A.1。
3.6 胰蛋白大豆肉汤(TSB):见A.2。
3.7 巧克力琼脂平板:见A.3。
3.8 鲜血琼脂平板:见A.4。
3.9 革兰氏染色液:见A.5。
3.10 生化用培养基:按GB/T 4789.28的规定配制。
3.11电泳级琼脂糖粉。
3.12 Taq DNA聚合酶:5U/μL。
3.13100 bp DNA ladder Marker(脱氧核糖核酸分子量标准)。
3.14 10倍浓度Taq DNA聚合酶缓冲液(10×Taq Buffer):含15 mmol/L氯化镁。
3.15 dNTP混合物:脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)各2.5 mmol/L。
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4230—2015
副猪嗜血杆菌病检疫技术规范
Quarantineprotocolforhaemophilus parasuis disease2015-05-26发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-01-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4230—2015
本标准起草单位:中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国重庆出入境检验检疫局、南通大学、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。本标准主要起草人:仇保丰、王昱、宋鸿雁、王春来、高峰、司微、顾炳泉、高逢结、刘文斌、李应国。I
1范围
副猪嗜血杆菌病检疫技术规范
本标准规定了副猪嗜血杆菌病的临床诊断和实验室检测方法。本标准适用于副猪嗜血杆菌病的诊断和检疫。2
规范性引用文件
SN/T4230——2015
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T4789.28食品微生物学检验染色法、培养基和试剂GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3
培养基及试剂
水:符合GB/T6682中一级水的规格。无菌脱纤绵羊血。
无菌特牛血清。
烟酰胺腺嘌吟二核苷酸(NAD)。胰蛋白大豆琼脂(TSA):见A.1。胰蛋白大豆肉汤(TSB):见A.2。巧克力琼脂平板:见A.3。
鲜血琼脂平板:见A.4。
革兰氏染色液:见A.5。
生化用培养基:按GB/T4789.28的规定配制。电泳级琼脂糖粉。
TaqDNA聚合酶:5U/μL。
10obpDNAladderMarker(脱氧核糖核酸分子量标准)。410倍浓度TaqDNA聚合酶缓冲液(10XTaqBuffer):含15mmol/L氯化镁。3.14
dNTP混合物:脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)各2.5mmol/L。3.16
引物(HPS-F:5-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3;HPS-R:5-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3)。
50XTAE电泳缓冲液:见A.6。
6×加样缓冲液:见A.7。
溴化乙锭溶液:见A.8。
副猪嗜血杆菌标准菌株(1~15型):由指定单位提供。金黄色葡萄球菌(ATCC25923)。猪胸膜肺炎放线杆菌(ATCC27088)。1
SN/T4230—2015
副猪嗜血杆菌阳性血清:由指定单位提供。副猪嗜血杆菌阴性血清:由指定单位提供。牛血清白蛋白(BSA)。
辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG。邻苯二胺(OPD)。
吐温-20。
0.1mol/LPBS缓冲液:见A.9。
包被液:见A.10。bzxz.net
洗涤液:见A.11。
封闭液:见A.12。
底物溶液:见A.13。
终止液:见A.14。
设备与材料
电热恒温水槽。
恒温培养箱。
二氧化碳培养箱。
高压灭菌器。
生物显微镜。
微量加样器。
高速冷冻离心机。
PCR仪。
水平凝胶电泳槽。
电泳仪。
凝胶成像系统。
APINH鉴定条或类似产品
16SrDNA细菌鉴定PCR试剂盒。
酶标仪。
空白酶标板。
临床诊断
临床症状及病理变化
临床症状
副猪嗜血杆菌病又称猪的革拉氏病(Glasser'sDisease),临床表现以呼吸道症状、跛行、胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等为特征。主要在断奶前后和保育阶段发病,通常见于5~8周龄的仔猪,发病率一般为10%15%,死亡率可达50%。急性病例:往往发生于骠情良好的猪,病猪发热(40℃~1)
由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果,则可使用这些等效的产品。SN/T4230—2015
42℃),精神沉郁,厌食消瘦;气喘咳嗽,呼吸困难,鼻孔有黏液性及浆液性分泌物;个别猪腕关节、距关节肿大、疼痛,跛行,运动不协调:可视粘膜发,眼脸皮下水肿,2d~3d死亡:急性感染病例存活后可留下后遗症,如母猪流产,公猪慢性跛行等,仔猪和育肥猪可遗留呼吸道症状和神经症状。慢性病例:多见于保育猪,病猪体温稍高,食欲下降,被毛粗乱,咳嗽,呼吸困难和生长迟滞;四肢无力或肿胀跛行;严重时衰竭死亡。
5.1.2病理变化
浆液性纤维素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎和多发性关节炎:渗出于浆膜表面的浆液性纤维素性渗出物,有时可形成一种假膜;胸腔内有大量的淡红色液体、纤维性渗出物及凝块,肺脏呈纤维素性胸膜肺炎,肺胀水肿,部分有对称性肉样变化脓性或腔积液或内脏粘连;心包积液,心包膜上有奶酪样坏死,并与心脏粘连;全身淋巴结肿大,呈浆液性卡他性炎,暗红色;关节肿大,有浆液性渗出性炎症。
5.2结果判定
根据特征性临床症状和病理变化可以作出初步诊断。进一步确诊应采集样品进行实验室检测。6实验室检测
样品的采集与处理
6.1.1活猪的样品采集
用无菌棉拭子采集鼻腔分泌物,放人无菌试管中;无菌采血并用注射器穿刺采取胸腔液。死猪的样品采集
病猪死亡或扑杀后12h以内,尽早无菌采集死亡猪肺脏、扁桃体、心血、胸水、脑脊液、气管和关节积液等病料。
6.1.3样品处理
采集样品应保存在0℃~4℃条件下,12h以内送到实验室6.2细菌的分离鉴定
6.2.1细菌培养
无菌操作从疑似病猪的肺脏、胸腔积液、心血、关节液、鼻腔分泌物和脑组织等病料中取样,在含NAD的巧克力琼脂平板或TSA琼脂平板分别划线接种,置5%的二氧化碳(CO2)培养箱,37℃培养24h~48h。在巧克力琼脂平板或TSA琼脂平板上,副猪嗜血杆菌呈光滑型、灰白色透明、直径大约0.5mm菌落
6.2.2革兰氏染色
将典型菌落制备涂片,火焰固定。结晶紫染色1min,水洗,革兰氏碘液染色1min,水洗,95%酒精脱色30s,水洗,沙黄复染30s,水洗,干燥,镜检。副猪嗜血杆菌为革兰氏阴性杆菌,具有多种不同形态,一般呈短小杆菌,也有曾球形、短链或丝状等,大小不等,约0.5μm×1.5μm~0.5μm×2.0μm。3
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6.2.3生化试验
将可疑的单菌落进一步纯化后,与金黄色葡萄球菌垂直划线于绵羊鲜血琼脂平板,37℃培养24h~48h。副猪嗜血杆菌在葡萄球菌条状菌苔附近呈现“卫星生长现象”,即金黄色葡萄球菌菌苔附近有较大的菌落生长,而远侧菌落生长较小或无菌生长。同时,观察到菌落具有不溶血现象。接下来将可疑单菌落接种微量生化管,置于5%的二氧化碳(CO2)培养箱中37℃培养24h~48h;或用等效的APINH鉴定条等进行细菌生化鉴定。副猪嗜血杆菌的主要生化特征见表B.1。6.2.4
结果判定
对具有副猪嗜血杆菌特征的菌落进行革兰氏染色,结果为革兰氏阴性。生化试验结果与副猪嗜血杆菌生化特性完全符合时,判定为副猪嗜血杆菌细菌培养阳性;否则,判定为副猪嗜血杆菌培养阴性。聚合酶链式反应(PCR)
6.3.1DNA的提取
从琼脂平板上挑取副猪嗜血杆菌可疑单菌落,接种到5mLTSB培养液中,置37℃摇床中160r/min振荡培养约12h,取1.5mL加人到无菌小离心管中,12000r/min离心5min,弃去上清液,再用25μL灭菌水重悬沉淀,于沸水中作用5min,然后于冰浴中冷却至4℃左右,12000r/min离心10min,取上清液作为PCR反应模板。或者用商品化等效DNA提取试剂盒进行提取。6.3.2
PCR扩增
PCR扩增的目的片段为副猪嗜血杆菌16SrDNA序列的一段。按照表1进行PCR反应体系的配制。
PCR反应体系(50μL体系)
10XTag缓冲液
dNTP混合物(各2.5mmol/L)
引物HPS-F(25pmol/μL)
引物HPS-R(25pmol/μL)
TaqDNA聚合酶(5U/μL)
灭菌水
模板DNA
体积(1个反应)
同时设立阳性对照、阴性对照和空白对照,用副猪嗜血杆菌标准菌株的模板DNA作为阳性对照用猪胸膜肺炎放线杆菌标准菌株的模板DNA作为阴性对照,用水作为空白对照。循环条件为:95℃预变性5min,95℃变性30s,56℃~60℃退火60s,72℃延伸90s,共35个循环;最后72℃延伸10min,4℃下保存。
6.3.3电泳
取1.5g琼脂糖,加人100mL电泳缓冲液加热溶解,加入溴化乙锭至终浓度为1ug/mL,制胶,待胶凝固后加人PCR扩增产物进行电泳,并用DNAladderMarker作对照。电泳完毕后用凝胶成像系统观察、记录结果。
6.3.4结果判定
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阴性对照和空白对照未扩增出自的片段,阳性对照扩增出大小为822bp的清晰条带,DNA分子量标准成立时;被检样品扩增出大小为822bp的条带,判定为副猪嗜血杆菌阳性;被检样品未扩增出大小为822bp的条带,判定为副猪嗜血杆菌阴性。6.4间接酶联免疫吸附试验(I-ELISA)6.4.1包被抗原的制备
将副猪嗜血杆菌5型标准株挑取单菌落接种50mLTSB液体培养基,置37℃摇床中160r/min振荡培养约12h,将菌液移人无菌离心管中,6000r/min离心10min,如此反复用0.1mol/LpH7.4的PBS缓冲液清洗3次。用PBS缓冲液按菌体体积比1:10重悬,在冰浴中进行超声波破碎(时间20min,振幅20%,超声3s停3s)。然后用紫外吸收法测定蛋白含量,确定其浓度,一20℃保存备用。6.4.2操作步骤
6.4.2.1抗原包被:将裂解抗原用包被液稀释至40μg/mL,每孔100μL加入酶标板各孔中,置于湿盒中37℃作用2h后转入4℃包被过夜。6.4.2.2洗涤:甩净孔内抗原溶液,用洗涤液PBST加满各孔,放置3min,然后甩净液体,并在洁净的吸水纸上拍干,如此重复3次。
6.4.2.3封闭:每孔加入1%BSA封闭液100uL,37℃作用1h后,按6.4.2.2的方法洗涤3次。6.4.2.4加待检血清:用封闭液稀释待检血清,按1:200稀释,每孔50μL,同时设立标准阴性血清对照孔两个、阳性血清对照孔和空白对照孔各一个,37℃作用1h后,按6.4.2.2的方法洗涤3次,6.4.2.5加酶标二抗:将免抗猪IgG-辣根过氧化物酶结合物按1:15000稀释,每孔50μL,37℃作用1h后,按步骤6.4.2.2的方法洗涤3次。6.4.2.6显色:加人现配制的OPD底物显色液100μL,37℃避光显色15min。6.4.2.7终止及读数:加人2mol/L的H,SO,终止液,每孔50μL,然后在酶标仪上检测490nm处的OD值。
结果判定
将样品的OD值代人式(1)计算:被检血清样品OD值
阴性对照平均OD值
式中:
S被检血清样品OD值;
N阴性对照平均OD值。
若S/N≥2.5则结果判定为副猪嗜血杆菌抗体阳性,否则判定为副猪嗜血杆菌抗体阴性,6.5琼脂凝胶免疫扩散试验(AGID)6.5.1琼脂凝胶平板的制备
.(1)
称取琼脂糖1.0g,氯化钠0.85g,加水至100mL,经煮沸溶解后,冷却至45℃,加入0.01g叠氮钠。每个平血加融化琼脂,使琼脂板厚度约为4mm,待凝固后倒置4℃冰箱保存备用。5
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6.5.2打孔
中间1孔,周围6孔为一组。孔径4mm,孔间距3mm。用针挑出或吸出孔内琼脂,用火焰封底。孔的布局参见图1。
6.5.3加样
检测血清:用微量移液器加样,周边孔加副猪嗜血杆菌1~15型标准菌株抗原,中间加入待检血清,待检血清加样孔两边分别设立阴性血清对照孔和阳性血清对照孔,同时要保证一对标准抗原能与其相应的阳性血清对照孔相邻,加样量以加满为宜。加样完毕后,将凝胶板放人湿盒置37℃温箱中孵育。6.5.4结果判定
加样后24h开始观察,每天观察并记录,连续观察3d,当标准抗原与与相应标准阳性血清间出现沉
淀线时,被检血清与标准菌株抗原间也出现明显清晰的沉淀线,即可判定待检血清为阳性;否则判定为阴性。见图1。
说明:
待检血清孔:
7综合判定
标准抗原孔:
阴性血清对照孔:
阳性血清对照孔。
琼脂凝胶免疫扩散试验加样示意图7.1当猪出现特征性的临床症状和病理变化,若细菌分离鉴定和PCR的结果均为阳性时,判定为副猪嗜血杆菌病阳性;若细菌分离鉴定和PCR的结果均为阴性时,判定为副猪嗜血杆菌病阴性。7.2当猪出现的特征性临床症状和病理变化,若细菌分离鉴定和PCR的结果不一致时,可用6.3PCR或16SrDNA细菌鉴定PCR试剂盒对细菌16SrDNA进行扩增并测序,根据DNA测序和分析结果做出准确判定。
7.3当非免疫猪出现特征性的临床症状和病理变化,且实验室I-ELISA或AGID检测出副猪嗜血杆菌抗体时,判定为副猪嗜血杆菌病阳性,否则判定为阴性。6
胰蛋白大豆琼脂(TSA)
胰酶消化酪蛋白
大豆蛋白陈
氯化钠(NaCI)
蒸馏水加至
附录A
(规范性附录)
培养基与试剂配制
1000ml
SN/T4230—2015
将以上各成分溶解于蒸馏水中,调pH至7.1~7.5,加热煮沸溶解。于121℃高压蒸汽灭菌15min,冷却至50℃,加入50mL灭活的新生牛血清和10mL经过滤除菌的1%NAD,充分摇匀后倾注平板。
胰蛋白大豆肉汤(TSB)
胰酶消化酪蛋白
大豆蛋白陈
氯化钠(NaCI)
磷酸氢二钾(K,HPO4·3HzO)
葡萄糖
蒸馏水加至
1000ml
将以上各成分溶解于蒸馏水中,调pH至71~7.5.加热煮沸溶解。于121℃高压蒸汽灭菌15min。使用前,加人50mL灭活的新生巧克力琼脂平板
血清和10mL过滤除菌的1%NAD,充分摇匀后使用。配制TSA培养基1000mL,于121C高压蒸汽灭菌15min.冷却至50℃,加人50mL~100mL无菌脱纤绵羊鲜血,充分混勾后于80℃水浴,待培养基颜色完全变成巧克力色(约需5min~10min)后,冷却至50℃,加人50mL灭活的新生牛血清和10mL过滤除菌的1%NAD,充分摇匀后倾注平板。A.4
鲜血琼脂平板
配制TSA培养基1000mL,于121℃高压蒸汽灭菌15min,冷却至50℃,加入50mL~100mL无菌脱纤绵羊鲜血,充分摇勾后倾注平板。A.5
革兰氏染色液
A.5.1结晶紫染色液
结晶紫
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