SN/T 4235-2015
基本信息
标准号： SN/T 4235-2015
中文名称：猪戊型肝炎检疫技术规范
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4235-2015.Quarantine protocol for swine hepatitis E.
1范围
SN/T 4235规定了猪戊型肝炎的临床诊断、酶联免疫吸附试验、实时荧光聚合酶链式反应检测技术。
SN/T 4235适用于猪戊型肝炎的诊断和流行病学调查。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 18088出 人境动物检疫采样
GB/T19489实验室生物安全通用要求
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
HEV :戊型肝炎病毒
BSA:牛血清白蛋白
HRP:辣根过氧化物酶
OD值:光密度值
ELISA:酶联免疫吸附试验
荧光RT-PCR:实时荧光聚合酶链式反应
4试剂
4.1 HEV 阳性对照血清。
4.2 HEV阴性对照血清。
4.3 HEV 抗原。
4.4 牛血清白蛋白。
4.5 HRP 标记的兔抗猪IgG。
4.60.01 mol/L PBS缓冲液。
4.7抗原稀释液(见附录 A)。
4.8洗涤液(见附录 A)。
4.9吐温-20。
4.10封闭液(见附录A)。
4.11显色剂(见附录A)
4.12终 止液(见附录A)。
4.13 TRIZOL。
4.14 三氯甲烷。
1范围
SN/T 4235规定了猪戊型肝炎的临床诊断、酶联免疫吸附试验、实时荧光聚合酶链式反应检测技术。
SN/T 4235适用于猪戊型肝炎的诊断和流行病学调查。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 18088出 人境动物检疫采样
GB/T19489实验室生物安全通用要求
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
HEV :戊型肝炎病毒
BSA:牛血清白蛋白
HRP:辣根过氧化物酶
OD值:光密度值
ELISA:酶联免疫吸附试验
荧光RT-PCR:实时荧光聚合酶链式反应
4试剂
4.1 HEV 阳性对照血清。
4.2 HEV阴性对照血清。
4.3 HEV 抗原。
4.4 牛血清白蛋白。
4.5 HRP 标记的兔抗猪IgG。
4.60.01 mol/L PBS缓冲液。
4.7抗原稀释液(见附录 A)。
4.8洗涤液(见附录 A)。
4.9吐温-20。
4.10封闭液(见附录A)。
4.11显色剂(见附录A)
4.12终 止液(见附录A)。
4.13 TRIZOL。
4.14 三氯甲烷。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4235—2015
猪戊型肝炎检疫技术规范
QuarantineprotocolforswinehepatitisE2015-05-26发布
刮涂质真件
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-01-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4235—2015
本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫局、上海市动物疫病预防控制中心本标准主要起草人：鱼海琼、张强、乔彩霞、罗长保、赵吟、蔡先全、刘佩红、周锦萍、李树清、吴晓薇。I
1范围
猪戊型肝炎检疫技术规范
SN/T4235—2015
本标准规定了猪戊型肝炎的临床诊断、酶联免疫吸附试验、实时荧光聚合酶链式反应检测技术。本标准适用于猪戊型肝炎的诊断和流行病学调查。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注口期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T18088出人境动物检疫采样
GB/T19489
3缩略语
实验室生物安全通用要求
下列缩略语适用于本文件。
HEV：戊型肝炎病毒
BSA：牛血清白蛋白
HRP：辣根过氧化物酶
OD值：光密度值
ELISA：酶联免疫吸附试验
荧光RT-PCR：实时荧光聚合酶链式反应4试剂
HEV阳性对照血清。
HEV阴性对照血清。
HEV抗原。
牛血清白蛋白。
HRP标记的免抗猪IgG。
0.01mol/LPBS缓冲液。
抗原稀释液（见附录A）。
洗涤液（见附录A）。
吐温-20。
封闭液（见附录A）。
显色剂（见附录A)。
终止液（见附录A）。
TRIZOL。
三氯甲烷。
SN/T4235—2015
异丙醇：一20℃预冷。
0.1%DEPC水。
75%乙醇。
RNA酶抑制剂（40U/μL)。
TaqDNA聚合酶（5U/μL)及相应10X缓冲液。M-MLV反转录酶（200U/μL)及相应5X反转录反应缓冲液。dNTP(2.5mmol/L)。
MgClz(25mmol/L)。
5设备
二级生物安全柜。
高压灭菌锅。
微量移液器。
5.4酶标仪。
5洗板机。
高速冷冻离心机。
荧光PCR仪。
临床诊断
流行病学
戊型肝炎的流行病学特点与甲肝相似，参见B.1。6.2
临床症状及病理变化
猪自身感染HEV临床症状并不明显，参见B.2。6.3初步诊断
根据临床症状、病理变化和流行病学可以作出初步判断，进一步诊断应采集样品进行实验室检测。该病原属人畜共患病原，涉及病原的检测应在二级生物安全实验室进行，样品保存和废弃物处理应按照GB/T19489生物安全要求进行。
实验室检测
酶联免疫吸附试验（间接ELISA）7.1
7.1.1原理
96孔微量板的奇数列包被有戊型肝炎病毒衣壳蛋白重组抗原，偶数列则未包被。检测样品和对照样品加入到反应孔内，每个样至少加平行的两孔（一个奇数孔和一个偶数孔）。如果血清中存在特异性抗体，会形成抗原-抗体复合物。洗板后，加人HRP标记的酶结合物，该酶标结合物与HEV抗原抗体复合物结合，形成抗原-抗体-酶复合物。洗去过剩的酶结合物，加人底物液，样品中特异性抗体的数量就会在奇数、偶数孔间出现颜色差异：如果存在抗体，加人终止液后蓝色液体会变成黄色；如果没有抗体，则无色。
7.1.2样品采集制备
SN/T4235—2015
按照GB/T18088，无菌操作采集动物血，每头不少于5mL，自然凝固后无菌分离血清，分装，加盖密封后冷藏保存。样品1周内检测可存放于2℃～8℃，超过1周应置于一20℃。7.1.3操作步骤
7.1.3.1使用前将所有试剂平衡至室温（21土5）℃，将反应板/条做好标记，阴性对照孔A1、A2、B1、B2，阳性对照孔C1、C2、D1、D2。7.1.3.2用多通道移液器加190uL样品稀释液至所有样品孔。7.1.3.3加10μL阴性对照至A1、A2、B1、B2孔加10μL阳性对照至C1、C2、D1、D2孔；加10μL待检血清到其他剩余的孔，各加两孔，微量振荡器混匀。密封微量反应板，室温（21土5）℃反应（45士4）min。7.1.3.4
用300μL/孔洗液洗板3次，最后一次拍干以去除残留洗液。将酶标结合物用酶稀释液10倍稀释后，加100μL至所有样品孔，微量振荡器混匀。密封微量反应板，室温（21土5）℃反应（30士3）min。同上洗板。
加100μL底物液至所有样品孔。7.1.3.10
密封微量反应板，室温（21士5）℃避光反应（15士2）min至颜色变化。加100μL终止液至所有孔终止反应，终止液添加顺序与底物溶液添加顺序相同。振荡混匀，用酶标仪在450nm条件下读取OD值，15min内完成结果读取。7.1.4
结果分析
数据计算
依据式（1)分别计算每一份样品的净OD值：净OD值=OD值奇数孔一OD值偶数孔式中：
净OD值—被检样品的真实光密度值。OD值奇数孔——奇数列微孔的光密度值。OD值偶数孔——偶数列微孔的光密度值。7.1.4.2有效性判断
当下列条件成立时，本试验有效：阳性对照平均净OD值应大于0.350。a)
b）阳性对照平均净OD值与阴性对照平均净OD值比值应大于3。7.1.4.3结果判定
根据式（2)计算每一份样品的S/P值：S/P=净ODsample/净ODpc
式中：
净ODsample
挣ODpc
被检样品与阳性对照真实光密度值的比值。被检样品微孔真实的光密度值。阳性对照微孔真实的光密度值。....(1)
·（2)
SN/T4235—2015
判定如下：
当S/P小于或等于0.6时判为阴性；a)
当S/P大于或等于0.7时判为阳性；b）
当S/P小于0.7且大于0.6时判为可疑。7.2酶联免疫吸附试验（双抗原夹心ELISA）7.2.1原理
以HEV的ORF2和ORF3融合抗原包被微孔反应板，加人待检样品，再加人HRP标记的HEV保守抗原片段。如果样品中含有HEV抗体，则能与包被在反应板上的融合抗原和酶标HEV保守抗原片段结合，形成“抗原-抗体-抗原-HRP复合物”，加入底物产生显色反应，反之则无显色反应。
7.2.2样品采集制备
同7.1.2。
7.2.3包被反应板的制备
7.2.3.1用抗原稀释液（见A.1)稀释HEVORF2和ORF3融合抗原至工作浓度1.0μg/mL，取96孔2℃～8℃过夜。使用前弃去板中包被液，加洗涤液（见A.2）洗板微量反应板，每孔加人100μL，封板2
3次，每次1min，拍干。
7.2.3.2每孔加人封闭液150μL，封板后37℃温育60min。7.2.3.3将反应板中封闭液（见A.3）吸干，用铝箔纸密封，2℃~8℃保存备用。7.2.4
正式试验
每孔加入50μL待检血清；设阴、阳性对照各2孔，每孔加人对照血清各50μL。每孔加入HRP标记的免抗猪IgG
50.振荡混
℃温育60min。
匀，封板，置37
弃去孔内液体，用洗涤液注满各重复5次后拍干
孔，甩干
每孔加显色剂（见A.4)100
每孔加终止液（见A.5)50
荡混匀，封板，置37℃温育15min。取波长450nm（使用双波长酶标仪时，参考波长6300nm），读取各孔OD值。
结果判定
有效性判断
阳性对照OD值大于等于0.8，阴性对照OD值小于等于0.15时，检测有效。7.2.5.2
判定标准
根据式(3)计算临界值：
临界值=0.25十阴性对照平均OD值式中：
临界值
阴性对照平均OD值
判定标准如下：
阴、阳性结果判定的界点数值。阴性对照微孔光密度值的平均值。a）待检样品OD值大于等于临界值，则判为阳性。b）待检样品OD值小于临界值，则判为阴性。4
7.3荧光RT-PCR检测方法
7.3.1原理
SN/T4235—2015
采用TaqMan方法，针对HEV四个主要基因型毒株均高度保守的ORF2区域，设计合成一对引物和一条特异性的荧光素双标记探针。探针5'端标记FAM荧光素为报告荧光基团（用R表示），3'端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团（用Q表示），它在近距离内能吸收5端荧光基团发出的荧光信号。PCR反应进人退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶的5'-→3外切核酸酶功能将探针降解，探针上的R基团游离出来.所发出的荧光不再为Q基团所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。7.3.2引物和探针
引物和探针针对戊型肝炎病毒ORF2编码区高度保守序列设计，可由生物公司合成，纯度为HPLC级，用DEPC溶解至10μmol/L后，保存于一20℃备用，引物、探针的名称、序列及位置参见表c.1。
7.3.3质控物质
7.3.3.1阳性对照
克隆HEVORF2基因片段，经体外转录后制备cRNA溶液，用做阳性对照；或HEV阳性猪肝脏，经研磨匀浆后，1000r/min离心5min，上清经1%福尔马林37℃24h灭活后，用做阳性对照。7.3.3.2阴性对照
HEV阴性猪肝脏，经匀浆后，1000r/min离心5min，取上清用做阴性对照。
空白对照
DEPC水溶液（见C.2）。
样品的采集制备
猪肝样品
用无菌剪刀和镊子剪取待检样品1.0g于研钵中充分研磨，再加5.0mLPBS混勾，然后将组织悬液转入无菌离心管中，编号备用。7.3.4.2猪胆汁bZxz.net
用无菌注射器直接吸取500μL至无菌离心管中，编号备用。7.3.4.3猪粪便
取0.1g固体粪便标本或0.1mL液体粪便标本至1.5mL无菌离心管中，再加人1mLPBS，置于漩涡振荡器混匀，编号备用。
7.3.4.4血清
用无菌注射器直接吸取500μL至无菌离心管中，编号备用。5
SN/T4235—2015
7.3.4.5存放与运送
采集或处理的样品在2℃～8℃条件下保存不超过24h；若需长期保存，应放置一70℃冰箱，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。
7.3.5样品核酸的提取
7.3.5.1取n个1.5mL灭菌离心管，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。
7.3.5.2每管加人600uL裂解液，然后分别加入待测样品、阴性对照和阳性对照各200μL，一份样品换用一个吸头；再加人200μL三氯甲烷，混勾器上振荡混匀5s。于4℃条件下，12000r/min离心15min。
7.3.5.3取与7.3.5.1中相同数量的1.5mL灭菌离心管，加人500μL异丙醇（-20℃预冷），对每个管进行编号。吸取7.3.5.2离心后各管中的上清液转移至相应的管中，上清液至少吸取500μL，注意不要吸出中间层，颠倒混匀。
7.3.5.4于4℃条件下，12000r/min离心15min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。加人600μL75%乙醇，颠倒洗涤。
7.3.5.5于4℃条件下，12000r/min离心10min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。7.3.5.64000r/min离心10s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样品换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥3min。不宜过于干燥，以免RNA不溶。7.3.5.7加入11μLDEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用。提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增或放置于一70℃冰箱，将核酸转移至反应混合物配制区。7.3.6扩增试剂准备与配制
本步骤在反应混合物配制区进行每个测试反应体系需使用15μL荧光RT-PCR反应液，反应液配方见表C.2。根据7.3.5.1中所设定的n值，计算各试剂的使用量，加人适当体积试管中，充分混合均匀后，向每个PCR管中各分装15μL，转移至样品处理区。
7.3.7加样
在样品处理区进行。在7.3.6的PCR管中分别加入制备好的RNA溶液10μL，使总体积达25μL。
盖紧管盖后，500r/min离心30s。7.3.8荧光RT-PCR反应
在检测区进行。将7.3.7中加样后的PCR管放入荧光PCR检测仪内，记录样品摆放顺序，选定FAM检测通道读取检测结果，选择TAMRA作为淬灭基团。设置如下反应参数：a）第一阶段，反转录42℃/30min；b）第二阶段，预变性92℃/3min；第三阶段，92℃/10s，45℃/30s，72℃/1min，5个循环；c）
第四阶段，92℃/10s，60℃/30s，40个循环，荧光收集设置在第四阶段每次循环的退火延伸d）
时进行。
7.3.9结果判定
结果分析条件设定
SN/T4235—2015
阅值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阅值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点，且相交于阳性对照扩增曲线的指数增长期为准。7.3.9.2
质控标准
阴性对照无Ct值并且无特定扩增曲线。阳性对照的Ct值应≤30，并出现特定的扩增曲线。如阴性对照和阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。7.3.9.3
结果描述及判定
结果描述及判定如下：
阴性：无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无戊型肝炎病毒，a）
阳性：Ct值≤30，且出现特定的扩增曲线，表示样品中存在戊型肝炎病毒。b)
7.4综合判定
依据7.1或者7.2方法检测获得阳性结果的即可判定为猪戊型肝炎血清抗体阳性；依据7.3方法检测获得阳性结果的可判定为猪戊型肝炎抗原阳性。7
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猪戊型肝炎检疫技术规范
QuarantineprotocolforswinehepatitisE2015-05-26发布
刮涂质真件
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-01-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4235—2015
本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫局、上海市动物疫病预防控制中心本标准主要起草人：鱼海琼、张强、乔彩霞、罗长保、赵吟、蔡先全、刘佩红、周锦萍、李树清、吴晓薇。I
1范围
猪戊型肝炎检疫技术规范
SN/T4235—2015
本标准规定了猪戊型肝炎的临床诊断、酶联免疫吸附试验、实时荧光聚合酶链式反应检测技术。本标准适用于猪戊型肝炎的诊断和流行病学调查。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注口期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T18088出人境动物检疫采样
GB/T19489
3缩略语
实验室生物安全通用要求
下列缩略语适用于本文件。
HEV：戊型肝炎病毒
BSA：牛血清白蛋白
HRP：辣根过氧化物酶
OD值：光密度值
ELISA：酶联免疫吸附试验
荧光RT-PCR：实时荧光聚合酶链式反应4试剂
HEV阳性对照血清。
HEV阴性对照血清。
HEV抗原。
牛血清白蛋白。
HRP标记的免抗猪IgG。
0.01mol/LPBS缓冲液。
抗原稀释液（见附录A）。
洗涤液（见附录A）。
吐温-20。
封闭液（见附录A）。
显色剂（见附录A)。
终止液（见附录A）。
TRIZOL。
三氯甲烷。
SN/T4235—2015
异丙醇：一20℃预冷。
0.1%DEPC水。
75%乙醇。
RNA酶抑制剂（40U/μL)。
TaqDNA聚合酶（5U/μL)及相应10X缓冲液。M-MLV反转录酶（200U/μL)及相应5X反转录反应缓冲液。dNTP(2.5mmol/L)。
MgClz(25mmol/L)。
5设备
二级生物安全柜。
高压灭菌锅。
微量移液器。
5.4酶标仪。
5洗板机。
高速冷冻离心机。
荧光PCR仪。
临床诊断
流行病学
戊型肝炎的流行病学特点与甲肝相似，参见B.1。6.2
临床症状及病理变化
猪自身感染HEV临床症状并不明显，参见B.2。6.3初步诊断
根据临床症状、病理变化和流行病学可以作出初步判断，进一步诊断应采集样品进行实验室检测。该病原属人畜共患病原，涉及病原的检测应在二级生物安全实验室进行，样品保存和废弃物处理应按照GB/T19489生物安全要求进行。
实验室检测
酶联免疫吸附试验（间接ELISA）7.1
7.1.1原理
96孔微量板的奇数列包被有戊型肝炎病毒衣壳蛋白重组抗原，偶数列则未包被。检测样品和对照样品加入到反应孔内，每个样至少加平行的两孔（一个奇数孔和一个偶数孔）。如果血清中存在特异性抗体，会形成抗原-抗体复合物。洗板后，加人HRP标记的酶结合物，该酶标结合物与HEV抗原抗体复合物结合，形成抗原-抗体-酶复合物。洗去过剩的酶结合物，加人底物液，样品中特异性抗体的数量就会在奇数、偶数孔间出现颜色差异：如果存在抗体，加人终止液后蓝色液体会变成黄色；如果没有抗体，则无色。
7.1.2样品采集制备
SN/T4235—2015
按照GB/T18088，无菌操作采集动物血，每头不少于5mL，自然凝固后无菌分离血清，分装，加盖密封后冷藏保存。样品1周内检测可存放于2℃～8℃，超过1周应置于一20℃。7.1.3操作步骤
7.1.3.1使用前将所有试剂平衡至室温（21土5）℃，将反应板/条做好标记，阴性对照孔A1、A2、B1、B2，阳性对照孔C1、C2、D1、D2。7.1.3.2用多通道移液器加190uL样品稀释液至所有样品孔。7.1.3.3加10μL阴性对照至A1、A2、B1、B2孔加10μL阳性对照至C1、C2、D1、D2孔；加10μL待检血清到其他剩余的孔，各加两孔，微量振荡器混匀。密封微量反应板，室温（21土5）℃反应（45士4）min。7.1.3.4
用300μL/孔洗液洗板3次，最后一次拍干以去除残留洗液。将酶标结合物用酶稀释液10倍稀释后，加100μL至所有样品孔，微量振荡器混匀。密封微量反应板，室温（21土5）℃反应（30士3）min。同上洗板。
加100μL底物液至所有样品孔。7.1.3.10
密封微量反应板，室温（21士5）℃避光反应（15士2）min至颜色变化。加100μL终止液至所有孔终止反应，终止液添加顺序与底物溶液添加顺序相同。振荡混匀，用酶标仪在450nm条件下读取OD值，15min内完成结果读取。7.1.4
结果分析
数据计算
依据式（1)分别计算每一份样品的净OD值：净OD值=OD值奇数孔一OD值偶数孔式中：
净OD值—被检样品的真实光密度值。OD值奇数孔——奇数列微孔的光密度值。OD值偶数孔——偶数列微孔的光密度值。7.1.4.2有效性判断
当下列条件成立时，本试验有效：阳性对照平均净OD值应大于0.350。a)
b）阳性对照平均净OD值与阴性对照平均净OD值比值应大于3。7.1.4.3结果判定
根据式（2)计算每一份样品的S/P值：S/P=净ODsample/净ODpc
式中：
净ODsample
挣ODpc
被检样品与阳性对照真实光密度值的比值。被检样品微孔真实的光密度值。阳性对照微孔真实的光密度值。....(1)
·（2)
SN/T4235—2015
判定如下：
当S/P小于或等于0.6时判为阴性；a)
当S/P大于或等于0.7时判为阳性；b）
当S/P小于0.7且大于0.6时判为可疑。7.2酶联免疫吸附试验（双抗原夹心ELISA）7.2.1原理
以HEV的ORF2和ORF3融合抗原包被微孔反应板，加人待检样品，再加人HRP标记的HEV保守抗原片段。如果样品中含有HEV抗体，则能与包被在反应板上的融合抗原和酶标HEV保守抗原片段结合，形成“抗原-抗体-抗原-HRP复合物”，加入底物产生显色反应，反之则无显色反应。
7.2.2样品采集制备
同7.1.2。
7.2.3包被反应板的制备
7.2.3.1用抗原稀释液（见A.1)稀释HEVORF2和ORF3融合抗原至工作浓度1.0μg/mL，取96孔2℃～8℃过夜。使用前弃去板中包被液，加洗涤液（见A.2）洗板微量反应板，每孔加人100μL，封板2
3次，每次1min，拍干。
7.2.3.2每孔加人封闭液150μL，封板后37℃温育60min。7.2.3.3将反应板中封闭液（见A.3）吸干，用铝箔纸密封，2℃~8℃保存备用。7.2.4
正式试验
每孔加入50μL待检血清；设阴、阳性对照各2孔，每孔加人对照血清各50μL。每孔加入HRP标记的免抗猪IgG
50.振荡混
℃温育60min。
匀，封板，置37
弃去孔内液体，用洗涤液注满各重复5次后拍干
孔，甩干
每孔加显色剂（见A.4)100
每孔加终止液（见A.5)50
荡混匀，封板，置37℃温育15min。取波长450nm（使用双波长酶标仪时，参考波长6300nm），读取各孔OD值。
结果判定
有效性判断
阳性对照OD值大于等于0.8，阴性对照OD值小于等于0.15时，检测有效。7.2.5.2
判定标准
根据式(3)计算临界值：
临界值=0.25十阴性对照平均OD值式中：
临界值
阴性对照平均OD值
判定标准如下：
阴、阳性结果判定的界点数值。阴性对照微孔光密度值的平均值。a）待检样品OD值大于等于临界值，则判为阳性。b）待检样品OD值小于临界值，则判为阴性。4
7.3荧光RT-PCR检测方法
7.3.1原理
SN/T4235—2015
采用TaqMan方法，针对HEV四个主要基因型毒株均高度保守的ORF2区域，设计合成一对引物和一条特异性的荧光素双标记探针。探针5'端标记FAM荧光素为报告荧光基团（用R表示），3'端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团（用Q表示），它在近距离内能吸收5端荧光基团发出的荧光信号。PCR反应进人退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶的5'-→3外切核酸酶功能将探针降解，探针上的R基团游离出来.所发出的荧光不再为Q基团所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。7.3.2引物和探针
引物和探针针对戊型肝炎病毒ORF2编码区高度保守序列设计，可由生物公司合成，纯度为HPLC级，用DEPC溶解至10μmol/L后，保存于一20℃备用，引物、探针的名称、序列及位置参见表c.1。
7.3.3质控物质
7.3.3.1阳性对照
克隆HEVORF2基因片段，经体外转录后制备cRNA溶液，用做阳性对照；或HEV阳性猪肝脏，经研磨匀浆后，1000r/min离心5min，上清经1%福尔马林37℃24h灭活后，用做阳性对照。7.3.3.2阴性对照
HEV阴性猪肝脏，经匀浆后，1000r/min离心5min，取上清用做阴性对照。
空白对照
DEPC水溶液（见C.2）。
样品的采集制备
猪肝样品
用无菌剪刀和镊子剪取待检样品1.0g于研钵中充分研磨，再加5.0mLPBS混勾，然后将组织悬液转入无菌离心管中，编号备用。7.3.4.2猪胆汁bZxz.net
用无菌注射器直接吸取500μL至无菌离心管中，编号备用。7.3.4.3猪粪便
取0.1g固体粪便标本或0.1mL液体粪便标本至1.5mL无菌离心管中，再加人1mLPBS，置于漩涡振荡器混匀，编号备用。
7.3.4.4血清
用无菌注射器直接吸取500μL至无菌离心管中，编号备用。5
SN/T4235—2015
7.3.4.5存放与运送
采集或处理的样品在2℃～8℃条件下保存不超过24h；若需长期保存，应放置一70℃冰箱，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。
7.3.5样品核酸的提取
7.3.5.1取n个1.5mL灭菌离心管，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。
7.3.5.2每管加人600uL裂解液，然后分别加入待测样品、阴性对照和阳性对照各200μL，一份样品换用一个吸头；再加人200μL三氯甲烷，混勾器上振荡混匀5s。于4℃条件下，12000r/min离心15min。
7.3.5.3取与7.3.5.1中相同数量的1.5mL灭菌离心管，加人500μL异丙醇（-20℃预冷），对每个管进行编号。吸取7.3.5.2离心后各管中的上清液转移至相应的管中，上清液至少吸取500μL，注意不要吸出中间层，颠倒混匀。
7.3.5.4于4℃条件下，12000r/min离心15min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。加人600μL75%乙醇，颠倒洗涤。
7.3.5.5于4℃条件下，12000r/min离心10min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。7.3.5.64000r/min离心10s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样品换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥3min。不宜过于干燥，以免RNA不溶。7.3.5.7加入11μLDEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用。提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增或放置于一70℃冰箱，将核酸转移至反应混合物配制区。7.3.6扩增试剂准备与配制
本步骤在反应混合物配制区进行每个测试反应体系需使用15μL荧光RT-PCR反应液，反应液配方见表C.2。根据7.3.5.1中所设定的n值，计算各试剂的使用量，加人适当体积试管中，充分混合均匀后，向每个PCR管中各分装15μL，转移至样品处理区。
7.3.7加样
在样品处理区进行。在7.3.6的PCR管中分别加入制备好的RNA溶液10μL，使总体积达25μL。
盖紧管盖后，500r/min离心30s。7.3.8荧光RT-PCR反应
在检测区进行。将7.3.7中加样后的PCR管放入荧光PCR检测仪内，记录样品摆放顺序，选定FAM检测通道读取检测结果，选择TAMRA作为淬灭基团。设置如下反应参数：a）第一阶段，反转录42℃/30min；b）第二阶段，预变性92℃/3min；第三阶段，92℃/10s，45℃/30s，72℃/1min，5个循环；c）
第四阶段，92℃/10s，60℃/30s，40个循环，荧光收集设置在第四阶段每次循环的退火延伸d）
时进行。
7.3.9结果判定
结果分析条件设定
SN/T4235—2015
阅值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阅值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点，且相交于阳性对照扩增曲线的指数增长期为准。7.3.9.2
质控标准
阴性对照无Ct值并且无特定扩增曲线。阳性对照的Ct值应≤30，并出现特定的扩增曲线。如阴性对照和阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。7.3.9.3
结果描述及判定
结果描述及判定如下：
阴性：无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无戊型肝炎病毒，a）
阳性：Ct值≤30，且出现特定的扩增曲线，表示样品中存在戊型肝炎病毒。b)
7.4综合判定
依据7.1或者7.2方法检测获得阳性结果的即可判定为猪戊型肝炎血清抗体阳性；依据7.3方法检测获得阳性结果的可判定为猪戊型肝炎抗原阳性。7
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