SN/T 3993-2014
基本信息
标准号： SN/T 3993-2014
中文名称：箭毒蛙壶菌感染检疫技术规范
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.zip .pdf
下载大小：5186682
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3993-2014.Quarantine protocol for infection with batrachochytrium dendrobatidis.
1范围
SN/T 3993规定了箭毒蛙壶菌感染的临床诊断、实时荧光聚合酶链式反应检测方法。
SN/T 3993适用于箭毒蛙壶菌感染的流行病学调查、诊断、检疫和监测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 18088出入境动物 检疫采样
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
bp:碱基对( base pair)
DNA :脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)
dNTP:脱氧核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate)
FAM:荧光报告基团(Carboxyfuorescein)
MGB:荧光淬灭基团( Minor groove binder)
Real-time PCR:实时荧光聚合酶链武反应( real-time polymerase chain reaction)
Taq:水生热栖菌(Thermusaquaticu)
4仪器和试剂
4.1仪器
4.1.1冷冻离心机。
4.1.2 -20℃低温冰箱。
4.1.3组织匀浆器。
4.1.4实时荧光 PCR反应管。
4.1.5实时荧光 PCR仪。
4.1.6高压灭菌器。
4.1.7紫外分光光度计。
1范围
SN/T 3993规定了箭毒蛙壶菌感染的临床诊断、实时荧光聚合酶链式反应检测方法。
SN/T 3993适用于箭毒蛙壶菌感染的流行病学调查、诊断、检疫和监测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 18088出入境动物 检疫采样
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
bp:碱基对( base pair)
DNA :脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)
dNTP:脱氧核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate)
FAM:荧光报告基团(Carboxyfuorescein)
MGB:荧光淬灭基团( Minor groove binder)
Real-time PCR:实时荧光聚合酶链武反应( real-time polymerase chain reaction)
Taq:水生热栖菌(Thermusaquaticu)
4仪器和试剂
4.1仪器
4.1.1冷冻离心机。
4.1.2 -20℃低温冰箱。
4.1.3组织匀浆器。
4.1.4实时荧光 PCR反应管。
4.1.5实时荧光 PCR仪。
4.1.6高压灭菌器。
4.1.7紫外分光光度计。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3993—2014
箭毒蛙壶菌感染检疫技术规范
Quarantine protocol for infection with batrachochytrium dendrobatidis2014-11-19发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-05-01实施
本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。SN/T3993—2014
本标准非等效部分采用世界动物卫生组织（OIE）《水生动物疾病诊断手册》（2012版）第2.1.1章等有关章节。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国吉林出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：谢明星、彭小莉、石建平、刘棠、王群力、陈双雅、陈伟玲、许秋贝、孙福泉、王景明。
1范围
箭毒蛙壶菌感染检疫技术规范
本标准规定了箭毒蛙壶菌感染的临床诊断，实时荧光聚合酶链式反应检测方法本标准适用于箭毒蛙壶菌感染的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2规范性引用文件
SN/T3993—2014
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出人境动物检疫采样
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
bp:碱基对(basepair)
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate)
FAM：荧光报告基团（Carboxyfluorescein）groove binder)
MGB：荧光淬灭基团（Minor
Real-timePCR：实时荧光聚
合酶链式反应（real-timepolymerasechainreaction）Taq：水生热栖菌（Thermus
saguaticu)
仪器和试剂
冷冻离心机。
-20℃低温冰箱。
组织勾浆器。
实时荧光PCR反应管。
实时荧光PCR仪。
高压灭菌器。
紫外分光光度计。
4.2试剂
水应符合GB/T6682中一级水规定。4.2.2合
含有箭毒蛙壶菌的DNA或含有扩增区域序列的质粒。4.2.3www.bzxz.net
TagManFastUniversalPCRMasterMix（含dNTP、Tauq聚合酶和PCR反应缓冲液等）。SN/T39932014
4.2.4蛋白酶K、酚/三氯甲烷/异戊醇混合液（25：24：1）、三氯甲烷/兄戊醇混合液（24：1）、75%乙醇和TE缓冲液（见A.1）
5临床诊断
一般认为所有的两栖类均可感染，包括无尾口（青蛙和蟾）、有尾目（蝶螈，水螈、鳗螈）和蚓螈日（真蚓）所有成员。目前发现有14科250种以上两栖动物感染箭毒蛙壶菌感染。箭毒蛙壶菌感染在大多数情况下没有明显的临床症状，只有那些快要死亡的动物表现明显。患病的成体蛙类腹部、髋部、腿部皮肤出现弥散性红肿、局部轻度增厚和变色症状，后肢抽搐、身上积聚脱下的皮、脚部及其他部分的浅表皮脱落、皮肤出现轻微粗化及细小的溃疡或出血。患者行为上表现无力、厌食、精神沉郁、不能找到遮蔽处、不能逃跑、失去正常的反射作用及出现不正常姿势等神经症状。蝌蚪的口器变形和角质化可作为箭毒蛙壶菌感染的检测依据。
6实时荧光PCR反应
6.1采样
根据GBT18088的要求采集成年蛙的脚趾和腹部的皮肤、蝌料的口器、成年蛙腹部的皮肤和蚂器的棉拭了或蛙和蝌蚪浸泡液（见A.2）等。将感染的蛙放入含有浸泡液的容器中浸泡15min用于检测，在进行大规模的流行病学调查时可将不超过5条蛙病料混合在一起作为一个检样进行检测。最佳的器官和组织是成年蛙的腹部皮肤和脚趾，蝌的口器。6.2核酸抽提
用经典的酚三氯甲烷萃取法（见附录B)或商业化DVA提取试剂盒。6.3
引物和探针
引物序列：
ITSI-3:5-CCT-TGA-TAT-AAT-ACA-GTG-TGC-CAT-ATG-TC-3\5.8S.5'-AGC-CAA-GAG-ATC-CGT-TGT-CAA-A-3探针序列：
5FAMCGA-GTC-GAA-CAA-AAT-MGB-36.4PCR扩增体系
PCR扩增在标准的25uI的反应体系中进行，每个反应体系应设置三个平行反应。包括：TagManFastUniversalPCRMasterMix(2XITS-3引物（10μmol/L）
5.8S引物（10μmol/L）
探针（10μmol/L）
DNA模板（20ng/1~100ng/1.)
补水至25uL。
6.5PCR反应条件
实时荧光定量PCR反应包括以下步：50℃2min；95℃10min；95℃30s，60℃1min，循环45次。
-TTKAONiKAca
6.6对照的设立
阳性对照：含有箭毒蛙壶菌的DNA或含有扩增区域序列的质粒。阴性对照：不含有DNA模板样品的PCR反应扩增体系。6.7结果判定
阴性对照：无扩增曲线，无荧光增幅现象。阳性对照：有扩增曲线，C1值小于或等于30。SN/T3993—2014
6.7.3在阳性对照、阴性对照均成立的条件下，三个平行测试样品一致时，Ct值小于或等于39判定为箭毒蛙壶菌实时荧光PCR检测阳性Ct值大于或等于42判定为箭毒蛙壶菌实时荧光PCR检测阴性；测试样品Ct值介于40≤Ct≤41之间，应调整模板浓度，重新进行实时荧光PCR，再次扩增后Ct值小于42判定为箭毒蛙壶菌实时荧光PCR检测阳性；若三个平行测试样品不一致时，需重新进行检测。综合判定
临床诊断仅作为疑似箭毒蛙壶菌感染，本病的确证仍需进行实时荧光PCR检测，根据实时荧光PCR检测结果综合判定。
iiKAoNiKAca
SN/T3993—2014
TE(Tris-HCI、EDTA)缓冲液
1 mol/L Tris-HCI(pH 8.0)
0.5 mol/LEDTA(pH8.0)
附录A
（规范性附录）
试剂的配制
加水溶解至1000.0mL，分装后高压火菌备用。A.2
浸泡液
储存液A：
KH,PO,
K,HPO4
加水溶解至1000.0mL
储存液B：
CaCl,.2H-O
MgCl,-6H,O
加水溶解至500.0mL，用KOH调pH至7.和0.1mL储存液B，加水至1000.0ml现用时取0.5mL储存液A
CTAB裂解液
聚乙烯吡略烷酮（K30)（PVP）
二乙胺基二硫代甲酸钠（DIECA）NaCl
1 mol/L Tris HCl(pH8.0)
0.5mol/LEDTA(pH8.0)
加水溶解至1000.0mL，分装后高压灭菌，4℃保存备用。使用时加人0.2%（体积分数）的3-统基乙醇。
-irKAoNiKAca
B.1样品处理
附录B
（规范性附录）
DNA提取方法
SN/T3993—2014
采集成年蛙的脚趾和腹部的皮肤、蚪的口器或成年蛙腹部的皮肤等，置于勾浆研磨器中并加人液氮，进行手工充分研磨至粉末状。B.2DNA的抽提
B.2.1按照0.2g样品加入1mL的比例加人55C顶热的2%CTAB裂解液（见A.3），加20uL蛋白酶K（20mg/mL），上下颠倒混匀。B.2.2混合液置于55℃水浴，水浴2.5h.期间可适当每10min摇勾一次。B.2.3向勾浆液中按1：1比例加酚/三氯甲烷/异戊醇混合液（2524：1).轻轻振荡混匀5min.
12000g离心5min。
B.2.4吸上层水相800uL于灭菌离心管中，加人等体积三氯甲烷/异戊醇混合液（24：1），轻轻振荡混勺5min，12000g离心5min。
B.2.5吸上层水相500μL于灭菌离心管中，加人两倍体积的无水乙醇，一20℃放置2h或液氮中放置5min。
B.2.612000g离心5min.沉淀DNA，倾去上清液B.2.7于沉淀中加人75%乙醇溶液500L，轻轻混勾后12000g离心5min，倾去上清液，室温晾干。受冲液溶解。采用紫外分光光度法测定DNA浓度，OD值的范围应该在向DNA沉淀中加200μLTE缓
0.05～1之间，且所用DNA溶液的ODm/0Dzmmm比值为1.7~2.0。
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箭毒蛙壶菌感染检疫技术规范
Quarantine protocol for infection with batrachochytrium dendrobatidis2014-11-19发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-05-01实施
本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。SN/T3993—2014
本标准非等效部分采用世界动物卫生组织（OIE）《水生动物疾病诊断手册》（2012版）第2.1.1章等有关章节。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国吉林出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：谢明星、彭小莉、石建平、刘棠、王群力、陈双雅、陈伟玲、许秋贝、孙福泉、王景明。
1范围
箭毒蛙壶菌感染检疫技术规范
本标准规定了箭毒蛙壶菌感染的临床诊断，实时荧光聚合酶链式反应检测方法本标准适用于箭毒蛙壶菌感染的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2规范性引用文件
SN/T3993—2014
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出人境动物检疫采样
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
bp:碱基对(basepair)
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate)
FAM：荧光报告基团（Carboxyfluorescein）groove binder)
MGB：荧光淬灭基团（Minor
Real-timePCR：实时荧光聚
合酶链式反应（real-timepolymerasechainreaction）Taq：水生热栖菌（Thermus
saguaticu)
仪器和试剂
冷冻离心机。
-20℃低温冰箱。
组织勾浆器。
实时荧光PCR反应管。
实时荧光PCR仪。
高压灭菌器。
紫外分光光度计。
4.2试剂
水应符合GB/T6682中一级水规定。4.2.2合
含有箭毒蛙壶菌的DNA或含有扩增区域序列的质粒。4.2.3www.bzxz.net
TagManFastUniversalPCRMasterMix（含dNTP、Tauq聚合酶和PCR反应缓冲液等）。SN/T39932014
4.2.4蛋白酶K、酚/三氯甲烷/异戊醇混合液（25：24：1）、三氯甲烷/兄戊醇混合液（24：1）、75%乙醇和TE缓冲液（见A.1）
5临床诊断
一般认为所有的两栖类均可感染，包括无尾口（青蛙和蟾）、有尾目（蝶螈，水螈、鳗螈）和蚓螈日（真蚓）所有成员。目前发现有14科250种以上两栖动物感染箭毒蛙壶菌感染。箭毒蛙壶菌感染在大多数情况下没有明显的临床症状，只有那些快要死亡的动物表现明显。患病的成体蛙类腹部、髋部、腿部皮肤出现弥散性红肿、局部轻度增厚和变色症状，后肢抽搐、身上积聚脱下的皮、脚部及其他部分的浅表皮脱落、皮肤出现轻微粗化及细小的溃疡或出血。患者行为上表现无力、厌食、精神沉郁、不能找到遮蔽处、不能逃跑、失去正常的反射作用及出现不正常姿势等神经症状。蝌蚪的口器变形和角质化可作为箭毒蛙壶菌感染的检测依据。
6实时荧光PCR反应
6.1采样
根据GBT18088的要求采集成年蛙的脚趾和腹部的皮肤、蝌料的口器、成年蛙腹部的皮肤和蚂器的棉拭了或蛙和蝌蚪浸泡液（见A.2）等。将感染的蛙放入含有浸泡液的容器中浸泡15min用于检测，在进行大规模的流行病学调查时可将不超过5条蛙病料混合在一起作为一个检样进行检测。最佳的器官和组织是成年蛙的腹部皮肤和脚趾，蝌的口器。6.2核酸抽提
用经典的酚三氯甲烷萃取法（见附录B)或商业化DVA提取试剂盒。6.3
引物和探针
引物序列：
ITSI-3:5-CCT-TGA-TAT-AAT-ACA-GTG-TGC-CAT-ATG-TC-3\5.8S.5'-AGC-CAA-GAG-ATC-CGT-TGT-CAA-A-3探针序列：
5FAMCGA-GTC-GAA-CAA-AAT-MGB-36.4PCR扩增体系
PCR扩增在标准的25uI的反应体系中进行，每个反应体系应设置三个平行反应。包括：TagManFastUniversalPCRMasterMix(2XITS-3引物（10μmol/L）
5.8S引物（10μmol/L）
探针（10μmol/L）
DNA模板（20ng/1~100ng/1.)
补水至25uL。
6.5PCR反应条件
实时荧光定量PCR反应包括以下步：50℃2min；95℃10min；95℃30s，60℃1min，循环45次。
-TTKAONiKAca
6.6对照的设立
阳性对照：含有箭毒蛙壶菌的DNA或含有扩增区域序列的质粒。阴性对照：不含有DNA模板样品的PCR反应扩增体系。6.7结果判定
阴性对照：无扩增曲线，无荧光增幅现象。阳性对照：有扩增曲线，C1值小于或等于30。SN/T3993—2014
6.7.3在阳性对照、阴性对照均成立的条件下，三个平行测试样品一致时，Ct值小于或等于39判定为箭毒蛙壶菌实时荧光PCR检测阳性Ct值大于或等于42判定为箭毒蛙壶菌实时荧光PCR检测阴性；测试样品Ct值介于40≤Ct≤41之间，应调整模板浓度，重新进行实时荧光PCR，再次扩增后Ct值小于42判定为箭毒蛙壶菌实时荧光PCR检测阳性；若三个平行测试样品不一致时，需重新进行检测。综合判定
临床诊断仅作为疑似箭毒蛙壶菌感染，本病的确证仍需进行实时荧光PCR检测，根据实时荧光PCR检测结果综合判定。
iiKAoNiKAca
SN/T3993—2014
TE(Tris-HCI、EDTA)缓冲液
1 mol/L Tris-HCI(pH 8.0)
0.5 mol/LEDTA(pH8.0)
附录A
（规范性附录）
试剂的配制
加水溶解至1000.0mL，分装后高压火菌备用。A.2
浸泡液
储存液A：
KH,PO,
K,HPO4
加水溶解至1000.0mL
储存液B：
CaCl,.2H-O
MgCl,-6H,O
加水溶解至500.0mL，用KOH调pH至7.和0.1mL储存液B，加水至1000.0ml现用时取0.5mL储存液A
CTAB裂解液
聚乙烯吡略烷酮（K30)（PVP）
二乙胺基二硫代甲酸钠（DIECA）NaCl
1 mol/L Tris HCl(pH8.0)
0.5mol/LEDTA(pH8.0)
加水溶解至1000.0mL，分装后高压灭菌，4℃保存备用。使用时加人0.2%（体积分数）的3-统基乙醇。
-irKAoNiKAca
B.1样品处理
附录B
（规范性附录）
DNA提取方法
SN/T3993—2014
采集成年蛙的脚趾和腹部的皮肤、蚪的口器或成年蛙腹部的皮肤等，置于勾浆研磨器中并加人液氮，进行手工充分研磨至粉末状。B.2DNA的抽提
B.2.1按照0.2g样品加入1mL的比例加人55C顶热的2%CTAB裂解液（见A.3），加20uL蛋白酶K（20mg/mL），上下颠倒混匀。B.2.2混合液置于55℃水浴，水浴2.5h.期间可适当每10min摇勾一次。B.2.3向勾浆液中按1：1比例加酚/三氯甲烷/异戊醇混合液（2524：1).轻轻振荡混匀5min.
12000g离心5min。
B.2.4吸上层水相800uL于灭菌离心管中，加人等体积三氯甲烷/异戊醇混合液（24：1），轻轻振荡混勺5min，12000g离心5min。
B.2.5吸上层水相500μL于灭菌离心管中，加人两倍体积的无水乙醇，一20℃放置2h或液氮中放置5min。
B.2.612000g离心5min.沉淀DNA，倾去上清液B.2.7于沉淀中加人75%乙醇溶液500L，轻轻混勾后12000g离心5min，倾去上清液，室温晾干。受冲液溶解。采用紫外分光光度法测定DNA浓度，OD值的范围应该在向DNA沉淀中加200μLTE缓
0.05～1之间，且所用DNA溶液的ODm/0Dzmmm比值为1.7~2.0。
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