SN/T 4053-2014
基本信息
标准号： SN/T 4053-2014
中文名称：鸡传染性贫血检疫技术规范
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4053-2014.Quarantine protocol for chicken infectious anemia.
1范围
SN/T 4053规定了鸡传染性贫血(CIA)病毒分离与鉴定、聚合酶链式反应(PCR)、荧光聚合酶链式反应(荧光PCR)、间接免疫荧光(IFA)以及酶联免疫吸附试验(ELISA)的技术要求。
SN/T 4053适用于鸡传染性贫血的检疫。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3病毒分离与鉴定
3.1 试剂
3.1.1改良最低要素营养液(DMEM)培养基,配制方法见A.1。
3.1.2马立克氏病病毒转化的淋巴细胞系MDCC-MSB1细胞。
3.1.3 标准阳性血清:用CIAV抗原免疫SPF鸡获得的血清。
3.1.4 标准阴性血清:无CIAV感染的SPF鸡血清。
3.1.5 新生牛血清、青霉素、链霉素。
3.2 仪器与器材
3.2.1二氧化碳培养箱。
3.2.2水浴锅。
3.2.3普通冰箱及低温冰箱。
3.2.4离心机。
3.2.5 倒置显微镜。
3.2.6微量移液器,容量2μL~20μL,20μL~200μL。
3.2.7细胞培养瓶、吸管、离心管、研磨器械、0.2μm微孔滤膜。
1范围
SN/T 4053规定了鸡传染性贫血(CIA)病毒分离与鉴定、聚合酶链式反应(PCR)、荧光聚合酶链式反应(荧光PCR)、间接免疫荧光(IFA)以及酶联免疫吸附试验(ELISA)的技术要求。
SN/T 4053适用于鸡传染性贫血的检疫。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3病毒分离与鉴定
3.1 试剂
3.1.1改良最低要素营养液(DMEM)培养基,配制方法见A.1。
3.1.2马立克氏病病毒转化的淋巴细胞系MDCC-MSB1细胞。
3.1.3 标准阳性血清:用CIAV抗原免疫SPF鸡获得的血清。
3.1.4 标准阴性血清:无CIAV感染的SPF鸡血清。
3.1.5 新生牛血清、青霉素、链霉素。
3.2 仪器与器材
3.2.1二氧化碳培养箱。
3.2.2水浴锅。
3.2.3普通冰箱及低温冰箱。
3.2.4离心机。
3.2.5 倒置显微镜。
3.2.6微量移液器,容量2μL~20μL,20μL~200μL。
3.2.7细胞培养瓶、吸管、离心管、研磨器械、0.2μm微孔滤膜。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4053—2014
鸡传染性贫血检疫技术规范
Quarantineprotocol for chicken infectious anemia2014-11-19发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-05-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准出国家认证认可监督委员会提出并归口。SN/T4053—2014
本标准起草单位：中华人民共和国珠海出人境检验检疫局、中华人民共和国东莞出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：沙才华、杨素、陈轩、许彩芸、梁玉英、王岚、陈进会、徐海聂、罗宝正、廖秀云。1范围
鸡传染性贫血检疫技术规范
SN/T 4053—2014
本标准规定了鸡传染性贫血（CIA)病毒分离与鉴定、聚合酶链式反应（PCR）、荧光聚合酶链式反应（荧光PCR）、间接免疫荧光（IFA）以及酶联免疫吸附试验（ELISA)的技术要求。本标准适用于鸡传染性贫血的检疫。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3病毒分离与鉴定
改良最低要素营养液（DMEM)培养基，配制方法见A.1马立克氏病病毒转化的淋巴细胞系MDCC-MSB1细胞。标准阳性血清：用CIAV抗原免疫SPF鸡获得的血清，3.1.3
标准阴性血清：无CIAV感染的SPF鸡血清。新生牛血清、青霉素、链霉素。仪器与器材
二氧化碳培养箱。
水浴锅。
普通冰箱及低温冰箱。
4离心机。
倒置显微镜。
微量移液器，容量2μ20m，20m~200μ。3.2.7
细胞培养瓶、吸管、离心管、研磨器械、0.2um微孔滤膜。样品的采集及处理
CIAV存在于病鸡肝脏、皮肤、牌脏、胸腺、法氏囊、肾脏和骨髓等组织器官中。无菌采集上述组织，用无血清DMEM制成20%组织悬液，3000r/min离心30min，取上清于70℃处理5min后，加等量10%三氯甲烷室温处理15min，10000r/min离心20min.取上清用于CIAV病毒分离。1
SN/T4053—2014
3.4操作方法
细胞培养
用含15新生牛血清的DMEM培养基在39℃和5%一氧化碳环境下培养MDCC-MSB1细胞每2d～~3d传代一次，待细胞长至2×105个/mL5×105个/mL时，用于CIAV病毒分离3.4.2病料接种
将0.1mL处理好的组织恩液接种MDCC-MSBI细胞，在39℃和5%二氧化碳环境下培养48h.观察结果。
3.4.3结果观察
CIAV感染细胞后，细胞体积增大，随后溶解。若第一次接种未出现细胞病变，将细胞培养物冻融后盲传三代。如仍无细胞病变.则判为CIAV阴性。3.5
5CIAV的鉴定
出现细胞病变的细胞培养物，用PCR和荧光PCR方法进行鉴定4聚合酶链式反应（PCR）1)
4.1试剂
除特别说明以外，本标准所用水应符合GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法的要求，所4.1.1
用试剂均为分析纯。
DNA提取液（配制方法参见附录B)。三氯甲烷（常温保存）。
异内醇（使用前预冷至一20℃）75%乙醇，采用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，使用前预冷至一20℃。0.01mol/LPBS.pH7.2(配方见A.2)。TE缓冲液（配制方法见A.3)。
电泳缓冲液（配制方法见A.4)。4.1.8
溴化乙锭溶液（10mg/mL）
CIAVCUX-1标准株DNA，10×PCR缓冲液，25mmol/L的MgC，10mmol/I.的dNTPs，4.1.10
5U/μL的TaqDNA聚合酶。
4.1.11选择CIAV特另性VPI基因序列作为CIAV检测的靶序列，产物长度582bp上游引物和下游引物序列如下：
上游引物：5-AATGAACGCTCTCCAAGAAG-3”下游引物：5-AGCGGATAGTCATAGTAGAT-34.2仪器与器材
1PCR仪
4.2.2紫外成像仪
1）同类的商品化试剂盒适用。
-iKAONKAca
4.2.3电泳仪。
高速台式冷冻离心机（可控温至4℃、离心速度可达12000r/min以上）。4.2.5水浴锅。
生物安全柜
SN/T4053—2014
微量移液器，0.1μL~2.5μL1μL10μL,10μL-100μL.20uL~200μL，100μL-~1000μL并配备与移液器匹配的无DNA酶和RNA酶的吸头。4.2.81.5mL无DNA酶的离心管、0.2mL无DNA酶的PCR薄壁管、八联管或96孔板。4.3样品的采集和处理
4.3.1取待检鸡的胸腺、骨髓等组织25mg·加人4倍体积的TE，勺浆化：取感染CUX-1标准株的MSB1细胞的DNA为阳性对照，1日龄SPF鸡胸腺勾浆物DNA为阴性对照。4.3.2将匀浆化的组织反复冻融3次，2000r/min离心10min，取上清液。4.4样品DNA的提取
4.4.1取n个灭菌的1.5mL离心管（n为被检样品与阴性、阳性对照之和）。4.4.2每管加入250μL.DNA提取液（配制方法参见附录B），然后分别加人被检样本阴性对照和阳性对照各250μL，一份样本换用一个吸头：再加人10L蛋白酶K（1mg/ml），振荡混勾，56℃消化2h，加入等体积的酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24=1），混勾，12000r/min离心15min。4.4.3取与4.4.1相同数量灭菌的1.5mL离心管，吸取4.4.2各管中的上清液转移至相应的管中，尽量避免吸出中间层，然后再分别加入2倍体积的一20°预冷的无水乙醇，颠倒混匀。4.4.412000r/min离心15min，小心倒去上清液，倒置于手吸水纸上，沾干液体；加人800pl75%乙醇，颠倒洗涤。
4.4.512000r/min离心10min.小心倒去上清液.倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。4.4.64000r/min离心10s，将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清液，用微量加样器将其吸干，室温干燥5min~10min。
4.4.7加入10μL灭菌双蒸水，溶解管壁上的DNA，5000r/min离心5s，4℃保存备用。若需长期保存应放置一70℃冰箱。
4.5PCR扩增检测
4.5.1将下列试剂按要求量加人到PCR管中：灭菌三蒸水36uL10倍浓度的PCR扩增缓冲液5μL；25mmol/L的MgCl3μL，10mmol/L的dNTPs2l;25mmol/L的引物1和引物2各1μL:TaqDNA聚合酶1μL：样品DNA溶液1pL。4.5.2感染CUX-1标准株的MSB1细胞的DNA为阳性对照，SPF鸡组织匀浆物DNA为阴性对照，4.5.3将加有样品和对照DNA的PCR管放人PCR仪中，按下述程序和条件进行PCR扩增：95℃5min；93℃1min，50℃1min，72℃1min，30次循坏；72℃延伸10min，反应结束后将PCR产物置于4℃或-20℃保存。
4.5.4制备1%琼脂糖凝胶板（含溴化乙锭，配制方法见A.5）.将样品及阴阳性对照的PCR产物9uL与1uLPCR上样缓冲液混合后，按编号加人到对应的凝胶孔中，凝胶板的边孔中加人标准分子量(DNA Marker)。
4.5.5凝胶在80V衡定电压下电泳1h，用紫外凝胶成像管理系统内观察结果、照像。4.5.6
对出现日的条带的PCR扩增产物进行测序，并与参考序列进行比对。4.6
结果及判定
当阳性对照出现582bp目的条带（序列见附录C）.阴性对照和空白对照均末出现目的条带时，3
KAONiKAca
SN/T4053—2014
试验成立。
4.6.2当被检样品出现582bp目的条带时，且测序结果与附录C的参考序列符合程度在95%以上判为阳性。
4.6.3当被检样品未出现582bp目的条带，或测序结果与附录C的参考序列符合程度在95%以下均判为阴性。
5荧光聚合酶链式反应（荧光PCR）25.1试剂
5.1.1鸡传染性贫血病毒荧光PCR检测试剂盒，20C保存，组成及使用注意事项参见附录B。5.1.2引物和探针序列：
本标准选择CIAV特异性VP1基因序列作为CIAV检测的靶序列,产物长度91bp。F游引I物：5GCCGATTTTACGCCTTCA3下游引物：5TACCGCTGTCTCCTCCG3TaqMan探针：5'CACCTCAAGCGACTTCGACGAA3，其5端和3端分别标记FAM和BHQ(或Tamra或Eclipse)。
5.1.3其他试剂见4.1.1~~4.1.6。5.2
仪器与器材
荧光PCR仪。
其他仪器与器材见4.2.4~~4.2.85.3
样品的采集和处理
按4.3进行。
5.4样品DNA的提取
按4.4进行。
5.5荧光PCR
扩增试剂配制
在反应混合物配制区进行
取出CIAV荧光PCR反应液（配制方法参见附录B），在空温下融化后，600Or/min离心3s，每个荧光RT-PCRPCR反应按表1用量配制PCR反应混合液（需配制反应液数量=样本个数+阴性对照+阳性对照十1)。
表1荧光PCR反应混合液配制表
CIAVPCR反应液
Tag酶(5U/μL)
将以上PCR反应试剂按使用量吸取到二个离心管中，充分混勾，然后在每个PCR管中分装22uL，2）同类的商品化试剂盒适用。
-TKAONiKAca
转移至样本处理区。
5.5.2加样
SN/T4053—2014
在已分装有PCR反应混合液的PCR管中分别加人已提取好的核酸3uL，盖上管盖，将PCR管放人荧光PCR检测仪内，记录样本放置顺序。5.5.3荧光PCR反应
在扩增检测区进行。反应条件设定：a)50℃2min,95℃5min;
b）95℃5s，60℃45s，40个循环。60℃时设置采集荧光。
5.5.4荧光素设定
报告基团（ReportDye）设定为FAM，流灭基团（QucnchDye）设定为BHQ（或Tamra或Eelipse），Referencedye设定为None。
5.6分析条件设定及结果判定
5.6.1质控标准
CIAV阳性对照和阴性对照质控标准：阳性对照有S型PCR扩增曲线，而且每个反应管内的荧光信号量达到设定的阅值时所经历的循环数（Ct值）小于或等于30；阴性对照无S型PCR扩增曲线，且Ct值为无。否则此次实验结果无效5.6.2结果判定及描述
有S型PCR扩增曲线，且Ct值≤30的样本，判为CIAV核酸阳性：30注意事项
实验室注意事项见附录D。
6间接免疫荧光试验（IFA）
6.1试剂
CIAVCUX-1标准株。
MDCC-MSB1细胞。
丙酮。
乙醇。
0.01mol/LPBS.pH7.2,（配方见A.2）6.1.6
兔抗鸡IgG荧光抗体。
仪器和器材
荧光显微镜。
HriKAoNiiKAca
SN/T4053—2014
生物培养箱。
台式离心机。
496孔细胞培养板。
6.3样品的处理
取待检鸡的血清，将血清以1：10~1：40稀释，标准阳性及阴性血清做同样稀释。6.4抗原的制备
用96孔细胞培养板培养MSB1细胞，在对数生长时接种CUX-1标准毒株感染MSBI细胞，感染72h后，10001/min离心10m弃去上清，用一20C预冷的固定液（40%体积的乙醇，60%体积的内酮）固定5min～10min·弃去固定液，干燥后可置于-20℃长时问保存：未感染病毒的MSB1细跑同法处理作为对照。
6.5IFA检测步骤
分别将稀释过的阳性血清，阴性血清以及待检血清样本滴于固定的96孔细胞培养抗原上，每孔6.5.1
100μl。
释)。
于37℃培养箱反应30min
用PBS洗3次，每次5
滴加工作浓度的荧光二抗（FIT标记的兔抗鸡IgG抗体，可根据各公司商品标注的工作浓度稀重复6.5.2。
重复6.5.3。
滴加一滴PIBS甘油，置于倒置荧光显微镜下观察。检测结果的判定
当阳性对照细胞内出现特异性亮绿色荧光阴性对照细胞内末见特异荧光时，试验成立。阴性对照出现荧光，为非特异荧光，试验不成立，应重新试验当待检孔细胞出现与阳性对照相同的亮绿色荧光，判为抗体阳性。当待检孔细胞未见特异性荧6.6.2
光时：判为抗体阴性。
酶联免疫吸附试验（ELISA)3）
7.1试剂
酶标羊抗鸡IgG，
包被液、洗涤液、底物液及样品稀释液（配制方法分别见A.6，A.7，A.8，A.9）。仪器和器材
酶标检测仪。
培养箱。
96孔可拆卸式ELISA微量滴定板。微量移液器，容量2uL～20μ，20m200mL。3）同类的商品化试剂盒适用。
-TKAONiKAca
7.3样品的处理
将待检血清用样品稀释液稀释20倍，阳性及阴性血清进行同样浓度稀释7.4
试验操作步骤
SN/T4053—2014
用基因工程方法体外表达的CIAVVPI蛋白，经纯化后，作为抗原包被ELISA酶标板。取ELISA微量滴定板，以包被液稀释抗原，每孔加人100μL，于4℃过夜。7.4.2
倒掉液体，用洗涤液洗板3次，每次5min。每孔加人样品稀释液100μL，37℃封闭1h重复7.4.3。
每孔加人稀释过的样品100L，37℃作用1h，同时设已知空白、已知阳性及阴性样本各两孔，每孔100μL作对照。
重复7.4.3。
每孔加人稀释至工作浓度（根据各公司商品标注的浓度稀释）的酶标羊抗鸡IgG100μL，37℃作用1h。
重复7.4.3。
加人底物液100μl37C避光反应20min7.4.10
加入终止液（2mol/LHSO.），每孔50μL。酶标仪在492nm读值。
检测结果的判定
质控标准
阴性样本的OD值在0.2以下，空白对照的OD值小于0.1，阳性对照的OD值在0.5或以上时，试验成立。否则，实验应视为无效。结果描述及判定
样本的OD值大于或等于0.5时，判为阳性：否则样品为阴性。当使用不同商品化试剂盒时，应根据所使用的试剂盒说明书的判定方法和标准进行判定。SN/T4053—2014
A.1DMEM（改良）培养液
附录A
（规范性附录）
试剂配制
A.1.1量取去离子水950mL，置于适宜的容器中。A.1.2将DMEM粉剂10g加于30℃的去离子水中，边加边搅拌。A.1.3每1000mL培养液加3.7g碳酸氢钠。A.1.4加去离子水至1000mL，用1mol/L.氢氧化钠或盐酸将培养液pH值调至pH6.9~7.0。在过滤之前应盖紧容器瓶塞。
A.1.5立即用孔径0.2m的微孔滤膜正压过滤除菌，4℃冰箱保存备用。磷酸盐缓冲液（0.01mol/LPBS，pH7.2）A.2
先配制A液、B液：
A液（0.2MNaH：PO,溶液）：
称取一水合磷酸二氢钠（NaH,PO·H,O）27.6g，或二水合磷酸二氢钠（NaH，PO·2H,O）31.2g：溶于蒸馏水中，定容至1000mL。B液（0.2MNaHPO4溶液）：
称取十二水合磷酸氢二钠（NaHPO4·12H.O)71.6g，或二水合磷酸氢二钠（NazHPO。·2HO）35.6g，溶于蒸馏水中，定容至1000mlg称取8.5g氯化钠用适量蒸馏水溶解，量取14mLA液加B液36mL用蒸馏水定容至1L，121℃高压灭菌20min后待用。
3TE缓冲液的制备（pH8.0）
Tris HCl
4TAE缓冲液（50倍）
10mmol/L.
1mmol/L
三羟甲基氨基甲烷碱（Tris base)）冰乙酸
乙-胺四乙酸（EDTA)(0.5mol/LpH8.0)蒸馏水
待上述混合物完全溶解后，加蒸馏水至1000mL，至4℃冰箱中备用，如配制1%的琼脂糖凝胶和用作电泳缓冲液则用蒸馏水稀释50倍成TAF缓冲液。51%琼脂糖凝胶板制备
取0.5g琼脂糖加入50mLTAE缓冲液中，在微波炉中充分溶解后，用TAE定容至50mL，冷却8
SN/T4053—2014
至60℃后，加入3μI.的溴化乙锭，倒入凝胶板中，插入梳子，待凝胶完全凝固后拔去梳子，备用。A.6
包被液：碳酸盐缓冲液
碳酸钠
碳酸氢钠
加蒸馏水至
调pH至
洗涤液（PBST)pH7.4
即PBS+吐温-20
KH,PO4
NaHPO+12H,0
吐温-20
加水至
样品稀释液
1000mL
1000mL
于PBST中加入BSA至终浓度为0.1%。底物液
2%无水柠檬酸液
磷酸氢二钠液（0.2mol/L)
邻苯二氮（OPD)
加蒸馏水至
SN/T4053—2014
试剂盒组成
附录B
（资料性附录）
荧光PCR试剂盒的组成及使用说明每个试剂盒可做48个检测，包括以下成分：CIAVPCR反应液
Taq酶bzxZ.net
阴性对照
阳性对照
双蒸水
DNA提取液
1.1mLXI管
1.0mLX1管
1.0mLX1管
1.0mLX1管
12.5mLX1管
CIAVPCR反应液（下列试剂为终浓度）：含50mmol/LKCl,10mmol/LTrisHCIpH8.3），2.5mmol/LMgClz，0.2mmol/LdNTPmix（脱氧核苷三磷酸），上，下游引物各20nmol/mL，探针10nmol/mL，1UTag酶，5%甘油
阳性对照：CIAV靶基因DNA。
DNA提取液主要成分：20mmol/LTris-HCl(pH7.4).200mmol/LEDTA，1%SDS。使用时的注意事项
在检测过程中，应严防不同样品间的交叉污染。反应液分装时应避免产生气泡，上机前检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。
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鸡传染性贫血检疫技术规范
Quarantineprotocol for chicken infectious anemia2014-11-19发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-05-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准出国家认证认可监督委员会提出并归口。SN/T4053—2014
本标准起草单位：中华人民共和国珠海出人境检验检疫局、中华人民共和国东莞出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：沙才华、杨素、陈轩、许彩芸、梁玉英、王岚、陈进会、徐海聂、罗宝正、廖秀云。1范围
鸡传染性贫血检疫技术规范
SN/T 4053—2014
本标准规定了鸡传染性贫血（CIA)病毒分离与鉴定、聚合酶链式反应（PCR）、荧光聚合酶链式反应（荧光PCR）、间接免疫荧光（IFA）以及酶联免疫吸附试验（ELISA)的技术要求。本标准适用于鸡传染性贫血的检疫。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3病毒分离与鉴定
改良最低要素营养液（DMEM)培养基，配制方法见A.1马立克氏病病毒转化的淋巴细胞系MDCC-MSB1细胞。标准阳性血清：用CIAV抗原免疫SPF鸡获得的血清，3.1.3
标准阴性血清：无CIAV感染的SPF鸡血清。新生牛血清、青霉素、链霉素。仪器与器材
二氧化碳培养箱。
水浴锅。
普通冰箱及低温冰箱。
4离心机。
倒置显微镜。
微量移液器，容量2μ20m，20m~200μ。3.2.7
细胞培养瓶、吸管、离心管、研磨器械、0.2um微孔滤膜。样品的采集及处理
CIAV存在于病鸡肝脏、皮肤、牌脏、胸腺、法氏囊、肾脏和骨髓等组织器官中。无菌采集上述组织，用无血清DMEM制成20%组织悬液，3000r/min离心30min，取上清于70℃处理5min后，加等量10%三氯甲烷室温处理15min，10000r/min离心20min.取上清用于CIAV病毒分离。1
SN/T4053—2014
3.4操作方法
细胞培养
用含15新生牛血清的DMEM培养基在39℃和5%一氧化碳环境下培养MDCC-MSB1细胞每2d～~3d传代一次，待细胞长至2×105个/mL5×105个/mL时，用于CIAV病毒分离3.4.2病料接种
将0.1mL处理好的组织恩液接种MDCC-MSBI细胞，在39℃和5%二氧化碳环境下培养48h.观察结果。
3.4.3结果观察
CIAV感染细胞后，细胞体积增大，随后溶解。若第一次接种未出现细胞病变，将细胞培养物冻融后盲传三代。如仍无细胞病变.则判为CIAV阴性。3.5
5CIAV的鉴定
出现细胞病变的细胞培养物，用PCR和荧光PCR方法进行鉴定4聚合酶链式反应（PCR）1)
4.1试剂
除特别说明以外，本标准所用水应符合GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法的要求，所4.1.1
用试剂均为分析纯。
DNA提取液（配制方法参见附录B)。三氯甲烷（常温保存）。
异内醇（使用前预冷至一20℃）75%乙醇，采用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，使用前预冷至一20℃。0.01mol/LPBS.pH7.2(配方见A.2)。TE缓冲液（配制方法见A.3)。
电泳缓冲液（配制方法见A.4)。4.1.8
溴化乙锭溶液（10mg/mL）
CIAVCUX-1标准株DNA，10×PCR缓冲液，25mmol/L的MgC，10mmol/I.的dNTPs，4.1.10
5U/μL的TaqDNA聚合酶。
4.1.11选择CIAV特另性VPI基因序列作为CIAV检测的靶序列，产物长度582bp上游引物和下游引物序列如下：
上游引物：5-AATGAACGCTCTCCAAGAAG-3”下游引物：5-AGCGGATAGTCATAGTAGAT-34.2仪器与器材
1PCR仪
4.2.2紫外成像仪
1）同类的商品化试剂盒适用。
-iKAONKAca
4.2.3电泳仪。
高速台式冷冻离心机（可控温至4℃、离心速度可达12000r/min以上）。4.2.5水浴锅。
生物安全柜
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微量移液器，0.1μL~2.5μL1μL10μL,10μL-100μL.20uL~200μL，100μL-~1000μL并配备与移液器匹配的无DNA酶和RNA酶的吸头。4.2.81.5mL无DNA酶的离心管、0.2mL无DNA酶的PCR薄壁管、八联管或96孔板。4.3样品的采集和处理
4.3.1取待检鸡的胸腺、骨髓等组织25mg·加人4倍体积的TE，勺浆化：取感染CUX-1标准株的MSB1细胞的DNA为阳性对照，1日龄SPF鸡胸腺勾浆物DNA为阴性对照。4.3.2将匀浆化的组织反复冻融3次，2000r/min离心10min，取上清液。4.4样品DNA的提取
4.4.1取n个灭菌的1.5mL离心管（n为被检样品与阴性、阳性对照之和）。4.4.2每管加入250μL.DNA提取液（配制方法参见附录B），然后分别加人被检样本阴性对照和阳性对照各250μL，一份样本换用一个吸头：再加人10L蛋白酶K（1mg/ml），振荡混勾，56℃消化2h，加入等体积的酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24=1），混勾，12000r/min离心15min。4.4.3取与4.4.1相同数量灭菌的1.5mL离心管，吸取4.4.2各管中的上清液转移至相应的管中，尽量避免吸出中间层，然后再分别加入2倍体积的一20°预冷的无水乙醇，颠倒混匀。4.4.412000r/min离心15min，小心倒去上清液，倒置于手吸水纸上，沾干液体；加人800pl75%乙醇，颠倒洗涤。
4.4.512000r/min离心10min.小心倒去上清液.倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。4.4.64000r/min离心10s，将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清液，用微量加样器将其吸干，室温干燥5min~10min。
4.4.7加入10μL灭菌双蒸水，溶解管壁上的DNA，5000r/min离心5s，4℃保存备用。若需长期保存应放置一70℃冰箱。
4.5PCR扩增检测
4.5.1将下列试剂按要求量加人到PCR管中：灭菌三蒸水36uL10倍浓度的PCR扩增缓冲液5μL；25mmol/L的MgCl3μL，10mmol/L的dNTPs2l;25mmol/L的引物1和引物2各1μL:TaqDNA聚合酶1μL：样品DNA溶液1pL。4.5.2感染CUX-1标准株的MSB1细胞的DNA为阳性对照，SPF鸡组织匀浆物DNA为阴性对照，4.5.3将加有样品和对照DNA的PCR管放人PCR仪中，按下述程序和条件进行PCR扩增：95℃5min；93℃1min，50℃1min，72℃1min，30次循坏；72℃延伸10min，反应结束后将PCR产物置于4℃或-20℃保存。
4.5.4制备1%琼脂糖凝胶板（含溴化乙锭，配制方法见A.5）.将样品及阴阳性对照的PCR产物9uL与1uLPCR上样缓冲液混合后，按编号加人到对应的凝胶孔中，凝胶板的边孔中加人标准分子量(DNA Marker)。
4.5.5凝胶在80V衡定电压下电泳1h，用紫外凝胶成像管理系统内观察结果、照像。4.5.6
对出现日的条带的PCR扩增产物进行测序，并与参考序列进行比对。4.6
结果及判定
当阳性对照出现582bp目的条带（序列见附录C）.阴性对照和空白对照均末出现目的条带时，3
KAONiKAca
SN/T4053—2014
试验成立。
4.6.2当被检样品出现582bp目的条带时，且测序结果与附录C的参考序列符合程度在95%以上判为阳性。
4.6.3当被检样品未出现582bp目的条带，或测序结果与附录C的参考序列符合程度在95%以下均判为阴性。
5荧光聚合酶链式反应（荧光PCR）25.1试剂
5.1.1鸡传染性贫血病毒荧光PCR检测试剂盒，20C保存，组成及使用注意事项参见附录B。5.1.2引物和探针序列：
本标准选择CIAV特异性VP1基因序列作为CIAV检测的靶序列,产物长度91bp。F游引I物：5GCCGATTTTACGCCTTCA3下游引物：5TACCGCTGTCTCCTCCG3TaqMan探针：5'CACCTCAAGCGACTTCGACGAA3，其5端和3端分别标记FAM和BHQ(或Tamra或Eclipse)。
5.1.3其他试剂见4.1.1~~4.1.6。5.2
仪器与器材
荧光PCR仪。
其他仪器与器材见4.2.4~~4.2.85.3
样品的采集和处理
按4.3进行。
5.4样品DNA的提取
按4.4进行。
5.5荧光PCR
扩增试剂配制
在反应混合物配制区进行
取出CIAV荧光PCR反应液（配制方法参见附录B），在空温下融化后，600Or/min离心3s，每个荧光RT-PCRPCR反应按表1用量配制PCR反应混合液（需配制反应液数量=样本个数+阴性对照+阳性对照十1)。
表1荧光PCR反应混合液配制表
CIAVPCR反应液
Tag酶(5U/μL)
将以上PCR反应试剂按使用量吸取到二个离心管中，充分混勾，然后在每个PCR管中分装22uL，2）同类的商品化试剂盒适用。
-TKAONiKAca
转移至样本处理区。
5.5.2加样
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在已分装有PCR反应混合液的PCR管中分别加人已提取好的核酸3uL，盖上管盖，将PCR管放人荧光PCR检测仪内，记录样本放置顺序。5.5.3荧光PCR反应
在扩增检测区进行。反应条件设定：a)50℃2min,95℃5min;
b）95℃5s，60℃45s，40个循环。60℃时设置采集荧光。
5.5.4荧光素设定
报告基团（ReportDye）设定为FAM，流灭基团（QucnchDye）设定为BHQ（或Tamra或Eelipse），Referencedye设定为None。
5.6分析条件设定及结果判定
5.6.1质控标准
CIAV阳性对照和阴性对照质控标准：阳性对照有S型PCR扩增曲线，而且每个反应管内的荧光信号量达到设定的阅值时所经历的循环数（Ct值）小于或等于30；阴性对照无S型PCR扩增曲线，且Ct值为无。否则此次实验结果无效5.6.2结果判定及描述
有S型PCR扩增曲线，且Ct值≤30的样本，判为CIAV核酸阳性：30
实验室注意事项见附录D。
6间接免疫荧光试验（IFA）
6.1试剂
CIAVCUX-1标准株。
MDCC-MSB1细胞。
丙酮。
乙醇。
0.01mol/LPBS.pH7.2,（配方见A.2）6.1.6
兔抗鸡IgG荧光抗体。
仪器和器材
荧光显微镜。
HriKAoNiiKAca
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生物培养箱。
台式离心机。
496孔细胞培养板。
6.3样品的处理
取待检鸡的血清，将血清以1：10~1：40稀释，标准阳性及阴性血清做同样稀释。6.4抗原的制备
用96孔细胞培养板培养MSB1细胞，在对数生长时接种CUX-1标准毒株感染MSBI细胞，感染72h后，10001/min离心10m弃去上清，用一20C预冷的固定液（40%体积的乙醇，60%体积的内酮）固定5min～10min·弃去固定液，干燥后可置于-20℃长时问保存：未感染病毒的MSB1细跑同法处理作为对照。
6.5IFA检测步骤
分别将稀释过的阳性血清，阴性血清以及待检血清样本滴于固定的96孔细胞培养抗原上，每孔6.5.1
100μl。
释)。
于37℃培养箱反应30min
用PBS洗3次，每次5
滴加工作浓度的荧光二抗（FIT标记的兔抗鸡IgG抗体，可根据各公司商品标注的工作浓度稀重复6.5.2。
重复6.5.3。
滴加一滴PIBS甘油，置于倒置荧光显微镜下观察。检测结果的判定
当阳性对照细胞内出现特异性亮绿色荧光阴性对照细胞内末见特异荧光时，试验成立。阴性对照出现荧光，为非特异荧光，试验不成立，应重新试验当待检孔细胞出现与阳性对照相同的亮绿色荧光，判为抗体阳性。当待检孔细胞未见特异性荧6.6.2
光时：判为抗体阴性。
酶联免疫吸附试验（ELISA)3）
7.1试剂
酶标羊抗鸡IgG，
包被液、洗涤液、底物液及样品稀释液（配制方法分别见A.6，A.7，A.8，A.9）。仪器和器材
酶标检测仪。
培养箱。
96孔可拆卸式ELISA微量滴定板。微量移液器，容量2uL～20μ，20m200mL。3）同类的商品化试剂盒适用。
-TKAONiKAca
7.3样品的处理
将待检血清用样品稀释液稀释20倍，阳性及阴性血清进行同样浓度稀释7.4
试验操作步骤
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用基因工程方法体外表达的CIAVVPI蛋白，经纯化后，作为抗原包被ELISA酶标板。取ELISA微量滴定板，以包被液稀释抗原，每孔加人100μL，于4℃过夜。7.4.2
倒掉液体，用洗涤液洗板3次，每次5min。每孔加人样品稀释液100μL，37℃封闭1h重复7.4.3。
每孔加人稀释过的样品100L，37℃作用1h，同时设已知空白、已知阳性及阴性样本各两孔，每孔100μL作对照。
重复7.4.3。
每孔加人稀释至工作浓度（根据各公司商品标注的浓度稀释）的酶标羊抗鸡IgG100μL，37℃作用1h。
重复7.4.3。
加人底物液100μl37C避光反应20min7.4.10
加入终止液（2mol/LHSO.），每孔50μL。酶标仪在492nm读值。
检测结果的判定
质控标准
阴性样本的OD值在0.2以下，空白对照的OD值小于0.1，阳性对照的OD值在0.5或以上时，试验成立。否则，实验应视为无效。结果描述及判定
样本的OD值大于或等于0.5时，判为阳性：否则样品为阴性。当使用不同商品化试剂盒时，应根据所使用的试剂盒说明书的判定方法和标准进行判定。SN/T4053—2014
A.1DMEM（改良）培养液
附录A
（规范性附录）
试剂配制
A.1.1量取去离子水950mL，置于适宜的容器中。A.1.2将DMEM粉剂10g加于30℃的去离子水中，边加边搅拌。A.1.3每1000mL培养液加3.7g碳酸氢钠。A.1.4加去离子水至1000mL，用1mol/L.氢氧化钠或盐酸将培养液pH值调至pH6.9~7.0。在过滤之前应盖紧容器瓶塞。
A.1.5立即用孔径0.2m的微孔滤膜正压过滤除菌，4℃冰箱保存备用。磷酸盐缓冲液（0.01mol/LPBS，pH7.2）A.2
先配制A液、B液：
A液（0.2MNaH：PO,溶液）：
称取一水合磷酸二氢钠（NaH,PO·H,O）27.6g，或二水合磷酸二氢钠（NaH，PO·2H,O）31.2g：溶于蒸馏水中，定容至1000mL。B液（0.2MNaHPO4溶液）：
称取十二水合磷酸氢二钠（NaHPO4·12H.O)71.6g，或二水合磷酸氢二钠（NazHPO。·2HO）35.6g，溶于蒸馏水中，定容至1000mlg称取8.5g氯化钠用适量蒸馏水溶解，量取14mLA液加B液36mL用蒸馏水定容至1L，121℃高压灭菌20min后待用。
3TE缓冲液的制备（pH8.0）
Tris HCl
4TAE缓冲液（50倍）
10mmol/L.
1mmol/L
三羟甲基氨基甲烷碱（Tris base)）冰乙酸
乙-胺四乙酸（EDTA)(0.5mol/LpH8.0)蒸馏水
待上述混合物完全溶解后，加蒸馏水至1000mL，至4℃冰箱中备用，如配制1%的琼脂糖凝胶和用作电泳缓冲液则用蒸馏水稀释50倍成TAF缓冲液。51%琼脂糖凝胶板制备
取0.5g琼脂糖加入50mLTAE缓冲液中，在微波炉中充分溶解后，用TAE定容至50mL，冷却8
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至60℃后，加入3μI.的溴化乙锭，倒入凝胶板中，插入梳子，待凝胶完全凝固后拔去梳子，备用。A.6
包被液：碳酸盐缓冲液
碳酸钠
碳酸氢钠
加蒸馏水至
调pH至
洗涤液（PBST)pH7.4
即PBS+吐温-20
KH,PO4
NaHPO+12H,0
吐温-20
加水至
样品稀释液
1000mL
1000mL
于PBST中加入BSA至终浓度为0.1%。底物液
2%无水柠檬酸液
磷酸氢二钠液（0.2mol/L)
邻苯二氮（OPD)
加蒸馏水至
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试剂盒组成
附录B
（资料性附录）
荧光PCR试剂盒的组成及使用说明每个试剂盒可做48个检测，包括以下成分：CIAVPCR反应液
Taq酶bzxZ.net
阴性对照
阳性对照
双蒸水
DNA提取液
1.1mLXI管
1.0mLX1管
1.0mLX1管
1.0mLX1管
12.5mLX1管
CIAVPCR反应液（下列试剂为终浓度）：含50mmol/LKCl,10mmol/LTrisHCIpH8.3），2.5mmol/LMgClz，0.2mmol/LdNTPmix（脱氧核苷三磷酸），上，下游引物各20nmol/mL，探针10nmol/mL，1UTag酶，5%甘油
阳性对照：CIAV靶基因DNA。
DNA提取液主要成分：20mmol/LTris-HCl(pH7.4).200mmol/LEDTA，1%SDS。使用时的注意事项
在检测过程中，应严防不同样品间的交叉污染。反应液分装时应避免产生气泡，上机前检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。
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