SN/T 4043-2014.PCR methods for detecting Wuchereria bancrofti and Brugia malayi in mosquitoes.
1范围
SN/T 4043规定了国境口岸蚊类携带班氏丝虫和马来丝虫的PCR检测方法,包括样本检测程序、检测方法、结果判定及报告。
SN/T 4043适用于检验检疫机构对蚊类携带班氏丝虫和马来丝虫的检测
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安全通用要求
WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则
SN/T 1300国境口岸蚊类监测规程
SN/T1553人出境航空器医学媒介生物监测规程
SN/T1560人出境船舶医学媒介生物监测规程
SN/T1596人出境车辆医学媒介生物监测规程
SN/T1876医学媒介生物标本采集、制作及保存规程
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
3.1丝虫Filaria
是由吸血节肢动物传播的一类寄生性线虫。成虫寄生在脊椎动物终宿主的淋巴系统、皮下组织、腹腔、胸腔等处。幼虫在某些吸血节肢动物中间宿主体内进行发育。当这些中间宿主吸血时,成熟的感染
期幼虫即自其喙逸出,经皮肤侵入终宿主体内发育为成虫。寄生于人体的丝虫主要有8种,我国流行的主要以班氏丝虫(Wuchereria bancrofti)和 马来丝虫(Brugia malayi)为主。 二者形态相似,虫体皆为乳白色丝状,体表光滑,雌、雄异体。
3.2蚊类Mosquito
班氏丝虫的主要传播媒介为淡色库蚊(Culexpipienspallens)和致倦库蚊(Cx.pipiensquinque-fasciatus),马来丝虫病的主要媒介为中华按蚊(Anopheles sinensis )和嗜人按蚊(Ananthropophagus)等。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4043—2014
蚊类携带丝虫（班氏丝虫、马来丝虫）的PCR检测方法
PCR methods for detecting Wuchereria bancrofti andBrugiamalayiinmosquitoes
2014-11-19发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-05-01实施
本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4043—2014
本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国甘肃出入境检验检疫局、中华人民共和国四川出入境检验检疫局：本标准主要起草人：田虹、刘丽娟、刘芳、高玉峰、陈肖潇、张红兵1范围
蚊类携带丝虫（班氏丝虫、马来丝虫）的PCR检测方法
SN/T4043—2014
本标准规定了国境口岸蚊类携带班氏丝虫和马来丝虫的PCR检测方法：包括样本检测程序、检测方法、结果判定及报告。
本标准适用于检验检疫机构对蚊类携带班氏丝虫和马来丝虫的检测2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则SN/T1300
国境口岸蚊类监测规程
SN/T1553
SN/T1560
SN/T1596
SN/T1876
3术语和定义
出境航空器医学媒介生物监测规程人出境船舶医学媒介生物监测规程人出境车辆医学媒介生物监
测规程
医学媒介生物标本采集、制作及保存规程下列术语和定义适用于本文件
丝虫Filaria
是由吸血节肢动物传播的一类寄生性线虫。成虫寄生在脊椎动物终宿主的淋巴系统、皮下组织、腹腔、胸腔等处。幼虫在某些吸血节肢动物中间宿主体内进行发育。当这些中间宿主吸血时，成熟的感染期幼虫即自其喙逸出，经皮肤侵入终宿主体内发育为成虫。寄生于人体的丝虫主要有8种，我国流行的主要以班氏丝虫（Wuchereriabancrofti）和马米丝虫（Brugiamalayi）为主。二者形态相似，虫体皆为乳白色丝状，体表光滑，雌、雄异体。3.2
蚊类Mosquito
班氏丝虫的主要传播媒介为淡色库蚊（Culerpipienspallens）和致倦库蚊（Cr.pipiensquinquefasciatus），马来丝虫病的主要媒介为中华按蚊（Anophelessinensis）和人按蚊（An.anthropophagus）等。3.3
PCR技术polymerase chainreactionPCR技术是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等1
SN/T 4043—2014
特点。
本文件中采用PCR技术，参考KirtiMishra等的文献（CombineddetectionofBrugiamalayiandWuchereriabancroftiusingsinglePCR），分别合成马来丝虫和班氏丝虫的特异引物Hha1和SspI，扩增月标DNA片段为322bp和188bp的方法。4缩略语
下列缩略语适合于本文件。
dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate）PCR：聚合酶链反应（polymerascchainrcaction）SDS：十二烷基磺酸钠（sodiumdodecvlsulfate）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymcrse）5检测对象
出入境交通工具、集装箱、货物以及口岸等场所捕获的媒介蚊虫，主要以淡色库蚊（Culerpipienspallens），致倦库蚊（Cr.pipiensquinquefasciatus），中华按蚊（Anophelessinensis）及嗜人按蚊（An.anthropophagus）为主。
生物安全要求
实验过程中生物安全要求如下：检测工作中的个人防护参照GB19489实验室应遵循GB19489和WS233对生物安全2级（BSI-2）实验室的生物安全要求：一使用过的实验用品应遵循GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理。7主要试剂
主要试剂如下：
样本处理液：在新鲜配制的97mLMEM中加人56℃热灭活30min的胎牛血清2mL、1mL的青链霉素（青霉素G10000U/ml、链霉素10000μg/mL），用7.5%碳酸氢钠溶液调至pH7.2；
-Hank's液：配方见附录A；
基因组DNA提取试剂：用TIANamP基因组DNA提取试剂盒，详见说明书，内含GA，GB、GD、PW、TE、蛋白酶K、吸附柱CB3等；ddH.O:
马来丝虫的PCR扩增引物（目标片段为322bp）：HhalF:5*-GCGCATAAATTCATCAGC-3\;HhalR:5-GCGCAAAACTTAATTACAAAAGC-3，班氏丝虫的PCR扩增引物（日标片段为188bp）：1）DVA提取试剂盒是由天根生化科技（北京）有限公司提供，是适合市售产品的实例。给出这一信息是为了方便标准的使用者，并不表示对该产品的认可，如果其他等效产品具有同样的效果，则可使用这些等效产品。2
-TTKAONrKAca
SspIF.5-CGTGATGGCATCAAAGTAGCG-3SSPIR.5-CCCTCACTTACCATAAGACAAC-3。样本的采集与处理
样本的采集
SN/T 4043—2014
根据监测任务等实际工作需要采集所需数量的蚊虫样本，样本的采集样品的采集参照SN/T1300SN/T1553.SN/T1560.SN/T1596.SN/T1876执行8.2样本的处理
8.2.1样本分栋、分装
将捕获的蚊虫置于一20℃，30min冷冻处死后进行分栋。若条件允许，分抹过程应在简易低温装置上进行。分栋后按类别装人适当的容器（如：冻存管、离心管、塑料平血等），加贴标签，放人液氮或干冰内（-70℃以下）运输或保存
标签内容至少包括以下信息：编号、种类、采集时间、采集地点、采集人等。8.2.2样本的处理
样本处理过程应在冰上进行。取出低温保存样本，置于研磨器中，加人Hanks液1mL吹洗，弃去液体后加人1mL样本处理液，反复研磨至组织碎片基本消失，将研磨液吸入1.5mL离心管中，平衡后置预冷4℃的离心机上，12000r/min离心10min。取上清液用于基因组DNA提取。剩余的样本研磨液置于一70℃以下冰箱内以备复查。9检验程序
9.1基因组DNA提取
9.1.1吸取蚊样本研磨液上清200μL置于1.5mL离心管中，加人20uL蛋白酶K溶液，混勾。9.1.2加人200μL缓冲液GB，充分颠倒混勾，70℃放置10min，简短离心除去管盖内壁的水珠9.1.3加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心除去管盖内壁残留液体。
9.1.4将上一步所得溶液和絮状沉淀均加人到吸附柱CB3中，12000r/min离心305，弃滤液。9.1.5向吸附柱CB3中加人500μL缓冲液GD,12000/min离心30s，弃滤液。9.1.6向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW.12000r/min离心30s，弃滤液。9.1.7向吸附柱CB3中加人500μL洗漂液PW，12000r/min离心2min，弃滤液。将吸附柱CB3置于室温数分钟，以彻底去除吸附材料中残余的漂洗液9.1.8将吸附柱CB3置于新的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μL~200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2min~5min，12000r/min离心2min洗脱DNA，置于冰上待用或一20℃冰箱保存。9.2PCR检测方法
9.2.1反应液的准备
反应体系为25μL，每个待检样本反应液的组成为：10XPCRBuffer
-TrKAoNrKAca
SN/T4043—2014
Taq 酶(5 U/μL)
2mmol/LdNTPs
10μmol/L上游引物
10μmol/L下游引物
DNA模板
9.2.2扩增程序
反应条件为：于94℃预变性10min；然后94℃变性15s，55℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环：最后72℃延伸10min。PCR反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整。9.3PCR扩增产物的电泳检测
用1×TAE电泳缓冲液制备1.5%琼脂糖凝胶（55℃~60)C时加入Goldview至终浓度为0.5μg/μuL）。取9uLPCR扩增产物与1μL上样缓冲液混勾后上样同时以DNA分于量标记物做参照。电泳时，电压大小控制在3V/cm5V/cm，电泳时间根据PCR扩增片段长度及Goldvicw的移动位置来确定，用胶成像分析系统记录并保存
10结果判断及报告
10.1质量控制
有效实验结果应同时符合以下2个条件，否则应重做实验，并排除污染因素：阴性对照未出现特异性核酸条带阳性对照在预期位置（马来丝虫为322bp、班氏丝虫为188bp）出现特异性核酸条带。10.2结果分析与报告
10.2.1阳性结果
待检样本如在某预期位置上（马米丝虫为322bp、班氏丝虫为188bp出现特异性扩增条带，可初步判断待检样本马来丝虫或班氏丝虫PCR检测阳性步确认。
初步判断为阳性结果的样本可通过核酸序列测定序列比对进一10.2.2阴性结果
如果待检样本在某预期位置上未出现特异性扩增条带，则可报告待检样本马来丝虫或班氏丝虫PCR检测阴性。
-rikAoNikAca
A.1试剂和材料
附录A
（规范性附录）
试剂、材料和仪器设备
SN/T4043—2014
除另有规定外，所有试剂均采用分析纯。水应符合GB/T6682中一级水的规格。用于PCR的水要使用超纯水。
A.1.110XPCR缓冲液：氯化钾（KCl）：500mmol/L.TisHCl:100mmol/L，明胶：0.1%。A.1.2PCR反应液：含氟化镁（MgCl）的PCR缓冲液、dNTP、Tag酶。A.1.350×TAE缓冲液：称取484gTris，量取114.2mL冰乙酸，200mL0.5mol/LEDTA（pH8.0)，溶于超纯水中，定容至21。分装后高压灭菌备用A1.40.5mol/LEDTA（pH8.0)：在800mL超纯水中加人186.1g溴化乙锭，至完全溶解，转移至棕色瓶中，保存至室温。
A.1.5TE级冲液（pH7.4):0.1mel/LTris-HCL(pH7.2)20mL加入0.5mol/LEDTA(pH8.0)40mL用超纯水定容至200mL，高压灭菌后4℃保存。A.1.6DNA分子标记物（DL2000)
A.1.7PCR引物：应为色谱纯。
A.1.8Hanks液：磷酸二氢钾0.06g，氯化钠8.0g，氯化钾0.4g，葡葡糖1.0g，磷酸氢二碳酸氢钠0.35
钠0.06g，加水至1000mLHanks液可以高压灭菌分装于4仪器设备此内容来自标准下载网
保存。
PCR仪电泳装置，紫外检测仪或凝胶分析成像系统，生物安全柜，高速台式离心机（最高离心力在12000g以上），台式离心机（最高离心力在2000g以上），微量可调移液器（2μL、10μL、100uL、1000L），三套和相应吸头。
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