SN/T 3675-2013.Detection and identification of Rhizoctonia fragariae Husain et W.E. McKeen.
1范围
SN/T 3675规定了草莓花枯病菌检疫鉴定方法。
SN/T 3675适用于草莓种子、种苗及果实上的草莓花枯病菌的检疫和鉴定。
2规范性引用文件.
下列文件对于本文件的应用是必不可少的,凡是注明日期的引用文件,仅注8期的版本适用于本文件。凡是不注明日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3病菌基本信息
中文名:草莓花枯病菌
学名:Rhizoctonia fragariae Husain et W.E. Mckeen
分类地位:草莓花枯病菌无性态Rhizoctonia fragariae 属于真菌界Fungi,半知菌门Basidiomycota,丝孢纲Hyphomycetes,无孢目Agonomycetales, 无孢科Agonomycetaceae, 丝核菌属Rhizoctonia。有性态Ceratobasidium cornigerum,属于担子亚门Basidiomycota ,伞菌纲Agaricomyce-tes,鸡油菌目Cantharellales, 角担子菌科Ceratobasidiaceae,角担菌属Ceratobasidium 。
传播途径:带菌的草莓、根系、花蕾、土壤是远距离传播主要途径。
其他信息参见附录A。
4方法原理
根据草莓花枯病菌在寄主上的为害症状、形态特征、培养性状等特征进行结果判定。
5仪器设备和主要试剂
5.1仪器设备
PCR仪、超净工作台、高压灭菌器、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、恒温水浴锅、微量进样器、电泳仪、凝胶电泳设备、凝胶成像系统、体视显微镜、生物显微镜(带显微照相装置)、天平(感量0.1 g) 、测微尺、光照培养箱等。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3675—2013
草莓花枯病菌检疫鉴定方法
Detection and identification of Rhizoctonia fragariae Husain et W.E.McKeen2013-08-30发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-03-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3675-—2013
本标准起草单位：中华人民共和国湖北出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民其和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局。本标准主要起草人：王振华、冯汉利、张剑锋、李凤新、王宏毅、叶芸、吴品珊、吴举萍、李彬、王英超、罗加风。
草莓花枯病菌检疫鉴定方法
本标准规定了草莓花枯病菌检疫鉴定方法。本标准适用于草莓种子、种苗及果实上的草荐花枯病菌的检疫和鉴定。2规范性引用文件
SN/T3675—2013
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验空用水规格和试验方法3病菌基本信息
中文名：草莓花枯病菌
学名：RhizoctoniafragariaeHusainetW.E.Mckeen分类地位：草莓花枯病菌无性态Rhizoctoniafragariae属于真菌界Fungi，半知菌门Basidiomycota，丝孢纲Hyphomycetes，无孢目Agonomycetales，无孢科Agonomycetaceae，丝核菌属Rhizoctonia。有性态Ceratobasidiumcornigerum，属于担子亚门Basidiomycota，伞菌纲Agaricomycetes，鸡油菌目Cantharellales，角担子菌科Ceratobasidiaceae，角担菌属Ceratobasidium。传播途径：带菌的草莓、根系、花凿、土壤是远距离传播主要途径。其他信息参见附录A。
2方法原理
根据草莓花枯病菌在寄主上的为害症状、形态特征、培养性状等特征进行结果判定，仪器设备和主要试剂
E.1仪器设备
PCR仪、超净工作台、高压灭菌器、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、恒温水浴锅、微量进样器、电泳仪、凝胶电泳设备、凝胶成像系统、体视显微镜、生物显微镜（带显微照相装置）)、天平（感量0.1g)、测微尺、光照培养箱等。E.2主要试剂和培养基
琼脂糖粉、次氯酸钠（NaCIO）、氯霉素、引物、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）、乙二胺四乙酸（EDTA）、无水乙醇、蛋白酶K、苯酚、三氯甲烷、异戊醇、乙酸铵（NH4Ac）、氯化镁（MgCI）、PCR缓冲液、dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）、TaqDNA聚合酶、溴化乙锭（EB）、液氢、3.5%甲醛、二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）、硝酸钾（KNO）、水琼脂和马铃薯葡萄糖培养基（PDA）。实1
SN/T3675—2013
验用水应符合GB/T6682中的规定。6现场检疫
检查根是否根腐，颜色棕色或黑色，植株是否矮小、菱蕉，似冻害状。花开时，花粉囊是否黑色，花梗正常，花心黑色。果实的组织是否变褐，变硬，成熟果实是否变软，表面是否有白色稀疏菌丝体（参见附录B）。7实验室检疫
7.1直接镜检
将有明显病症的根系、花蕾或果实材料置于体视显微镜下检查，或直接挑取病部子实体制成玻片：置于生物显微镜下镜检，观察记录菌丝，担子果、担子的形态特征和着生方式，并测量其大小。7.2保湿培养
如根系、花蕾或病果上只有可疑病状而无明显病症，则将病根（截成5cr）或繁殖材料置于样品袋中，于20℃25℃下保湿培养，每天观察症状的变化，开进行显微镜检或分离培养。7.3病原菌的分离培养
取具有疑似发病症状的根或繁殖材料，用自来水冲洗并用吸水纸吸干表面水分。用1%NaCIO表面消毒1min~2min，用无菌水冲洗3次，用无菌吸水纸吸干表面水分后，放人水琼脂（含250pg/ml.氯霉素）表面，当组织表面长出菌丝后，将菌丝转移至PDA平板（含250ug/mL氯霉素）上，继续培养2d～3d。小心挑取新长出的菌丝，转接到新的PDA平板上进行真菌的纯化培养。连续转接3次，获得真菌的纯培养物。
7.4菌丝和菌核的形态观察
将纯培养物接种在含有1mm厚PDA的平板上培养3d5d，在菌丝生长最旺盛的边缘取出带有菌丝的琼脂碟片，在3.5%的甲醛固定用无菌水冲洗，然后在二氨基-2-苯基吲哚（DAPI)染色4min，再用无菌水褪色3min。
7.5分子生物学鉴定
在生物显微镜的紫外光下观察菌丝的形态及菌核的数量。DNA提取方法、引物、PCR扩增及产物测序分析等参见附录C。8鉴定特征
在生物显微镜下观察，菌丝细胞有双核，菌丝初无色，宽3um~9um，无锁状连接，老熟后呈褐色，在分枝处缢缩。在培养基上，很少产生菌核，菌核表面粗糙，褐色至黑色，表牛颜色相同，菌核之间有丝状体相连，不产生无性孢子，可产生大量的念珠形孢子链。担子果（子实体）平展、薄、白色。担子为椭球状至近似棒状，（9μm~14um）×（8μm12μm），有4个孢子梗。扭孢子为椭球状和近似纺锤状，(6um~1lμm)×（4μm~6μm)(参见附录D）。9结果判定
根据草莓花枯病菌的鉴定特征对分离物进行综合判定，如病菌的形态学特征与第8章中描述的鉴2
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SN/T3675--2013
指标相符，则可鉴定为草莓花枯病菌。7.5中描述的分子生物学鉴定作为病菌形态学鉴定的辅助判短特征。
样品保存与处理
样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出草莓花枯病菌的样品保存于一20℃冰箱中6个月，以备复核。该类样品保存期满后须经高压灭菌后方可处理。11
菌株保存与处理
从检测样品中分离并鉴定为莓花枯病菌的菌株，纯分离物要标注菌株来源、寄主、分离时间、鉴定人；菌林在含30%甘油的冻存管中于一80℃保存，或将菌株转接在PDA斜面上培养，待菌丝体长满斜面后，置于4℃下保存，并定期（180d）转管。病菌基因组DNA样品于
俱存的菌株应及时高压灭菌处理。12
实验记录与保存
20℃下保存。对不需要长期
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点方法和结果等，并要有实验人员利审核人员签。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片S
KAoNiKAca
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A.1症状特征
A.1.1 根系症状
附录A
（资料性附录）
草莓花枯病菌其他相关信息
感染病害的根系症状最为明显。整个根系比健康植株的明显小，侧根数量减少，白色肉质根上分布有不规则的黑色块状，根内为黄色到白色。严重感染时，这些黑色区域连成片，使整个白色肉质根变黑。感染的木质根初期外部变为黑色，后来根内也完全变黑，横切木质根时根内先全变黑，主根全部或部分（特别是根尖部分）死亡。
花症状
病菌主要侵染未开放的花蕾。花初开时，花药暗褐色，雌蕊区域光滑，雌蕊缺失。侵染发生在花冠出现之前，或者之后的短时间内，在花董开放后很快结束。被严重侵染的花，在开花前花药和雌您都被破坏，当花蕾隆起花瓣可见时，花瓣外可见褐色的损伤，花瓣区域呈粉红色。颜色逐渐变深为黑色，花心变黑，类似于冻害症状。果实表现不同程度的畸形。A.1.3果实症状
侵染初期发病果实病部变褐，变硬。成熟果实变软，表面有白色稀疏菌丝体。A,1.4植株症状
植株长势较差、矮化，产果小且少。叶片面积变小，单片或多片叶可能菱焉、褪色甚至死亡。严重时，整个植株死亡。
寄主范围
在自然条件下，只侵染蔷薇科草莓属Fragaria植物。A.3分布
主要分布在美洲、欧洲、亚洲。美洲：美国、加拿大、海地、牙买加、墨西哥、巴西。欧洲：法国、意大利、波兰、西班牙、荷兰、比利时、俄罗斯、罗马尼亚、英国。亚洲：日本。
TKAoNIKAca
附录B
（资料性附录）
草莓花枯病菌病害症状特征图
草莓叶片症状
侵染植株症状
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图B.2草莓果实症状
侵染植株后期症状
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图B.5侵染根系症状
注：图片来自http：//omafra+gov.on.ca/图B.6
侵染根系后期症状
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C.1DNA提取-
CTAB提取法
附录C
（资料性附录）
草莓花枯病菌分子生物学鉴定
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在PDA培养基中接种活化的供试分离物，在25℃条件下培养3d～5d.应用滤纸过滤收集菌丝，于一20℃下储存备用。菌丝采取C集培差的菌丝于研钵中，加人液氮和少许石英砂研磨成菌丝粉，取0.2g菌丝粉于2mL离心管内.加人细胞裂解缓冲液（1%CTAB：50mmol/LTris-CL，pH8.010mmol/LEDTApH8.0）1mL.20mg/mL蛋白酶K5μL，于涡旋器上充分混合后.55℃水浴1h~3h；将离心管于12000r/min离心10min，取上清液800μL，加入等体积的苯酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1）.轻轻颠倒混勾.1200r/min.离心10min：取上层水相600uL，加人等体积的三氯甲烷：戊醇（24：1），轻轻颠倒混勺12000r/min，离心10min：取上层水相400μl，加人2倍本积的冰无水乙醇和1/10体积的3mol/L乙酸钠，置于=20℃沉淀1h3h；将离心管于12000r/min，离心10min，弃上清液，沉淀用70%醇洗涤一次工燥后.用100uL双蒸水溶解，加入RNasc于37℃消解1h后.一20℃下保存备用。
C.2PCR扩增及PCR产物检测分析
应用通用引物对ITS4（5-T
ICCGCT
TATTGATATGC-3）和ITS5（5-GGAAGTA核糖体ITSI、ITS2
AAAGTCGTAACAAGG-3)对rDNA-ITS片段和5.8S基因）进行PCR扩增。
mmol/LKCl
PCR反应总体积为25L，含有50
Tris-HC1(pH 8.4),2 mmol/L
20mmol/L
MgCl、200μmol/LdNTPs、0.2gmol/L同源引物和互补引物、2UTag酶和1叫LDNA模板。
PCR反应程序：95℃预变性5min.95℃变性30s,50℃退火305，72℃延伸45s，共40循环，最后补时延伸10min。
扩增产物在1.2%的琼脂糖凝胶上电冰，经溴化乙锭染色后，在紫外灯下观察扩增结果。670bpDNA片段经纯化后测序，应用BLAST与GenBank内同源序列进行比对分析。7
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附录D
（资料性附录）
草莓花枯病菌菌落和菌丝形态特征图图D.1菌落生长初期形态特征
图D.3菌丝在分枝处继缩
图D.2菌落生长后期形态特征
图D.4念珠形孢子链下载标准就来标准下载网
参考文献
SN/T3675-—2013
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