SN/T 3681-2013
基本信息
标准号： SN/T 3681-2013
中文名称：魔芋细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3681-2013.Detection and identification of Acidovorax konjaci (Goto, 1983) Willems,et al.1992.
1范围
SN/T 3681规定了进出境植物及其产品中魔芋细菌性叶斑病菌的检疫鉴定方法。
SN/T 3681适用于进出境魔芋细菌性叶斑病菌寄主植物及其繁殖材料中该病菌的检疫和鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T4789.28-2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂
SN/T1157进出境植物苗木检疫规程
3魔芋细 菌性叶斑病菌基本信息
学名:Acidovorax konjaci (Goto, 1983) Willems, et al.1992.
异名: Pseudomonas avenae subsp. konjaci(Goto， 1983) Hu, et al., 1991; Acidovorax avenae
subsp. konjaci; Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp. konjaci Goto 1983.
分类地位:原核生物界(Procaryotae)、薄壁菌门(Gracilicutes)、暗细菌纲(Scotobacteria)、假单胞杆菌目(Pseudomonadales)、假单胞杆菌科(Pseudomonadaceae)、嗜酸菌属(Acidovorax)。
传播途径:带菌的种芋是远距离传播主要途径。在田间和温室,主要通过灌溉水、雨水、风力、修剪枝等传播,由伤口、气孔和自然裂口侵人寄主组织。魔芋细菌性叶斑病菌的其他信息参见附录A。
4方法原理
根据症状现场采集病样,实验室开展分离培养纯化,及革兰氏染色、生理生化、致病性测定和分子生物学的检测,鉴定特征吻合,检测结果为阳性的,判定为魔芋细菌性叶斑病菌。
1范围
SN/T 3681规定了进出境植物及其产品中魔芋细菌性叶斑病菌的检疫鉴定方法。
SN/T 3681适用于进出境魔芋细菌性叶斑病菌寄主植物及其繁殖材料中该病菌的检疫和鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T4789.28-2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂
SN/T1157进出境植物苗木检疫规程
3魔芋细 菌性叶斑病菌基本信息
学名:Acidovorax konjaci (Goto, 1983) Willems, et al.1992.
异名: Pseudomonas avenae subsp. konjaci(Goto， 1983) Hu, et al., 1991; Acidovorax avenae
subsp. konjaci; Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp. konjaci Goto 1983.
分类地位:原核生物界(Procaryotae)、薄壁菌门(Gracilicutes)、暗细菌纲(Scotobacteria)、假单胞杆菌目(Pseudomonadales)、假单胞杆菌科(Pseudomonadaceae)、嗜酸菌属(Acidovorax)。
传播途径:带菌的种芋是远距离传播主要途径。在田间和温室,主要通过灌溉水、雨水、风力、修剪枝等传播,由伤口、气孔和自然裂口侵人寄主组织。魔芋细菌性叶斑病菌的其他信息参见附录A。
4方法原理
根据症状现场采集病样,实验室开展分离培养纯化,及革兰氏染色、生理生化、致病性测定和分子生物学的检测,鉴定特征吻合,检测结果为阳性的,判定为魔芋细菌性叶斑病菌。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3681—2013
魔芋细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Acidovorax konjaci (Goto,1983) Willems,et al.19922013-08-30发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-03-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T3681—2013
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国湖北出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：甘琴华、历艳、邵秀玲、封立平、刘彩霞、王英超、赵晖、李凤新、纪璞。1
1范围
魔芋细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法本标准规定了进出境植物及其产品中魔芋细菌性叶斑病菌的检疫鉴定方法SN/T3681-2013
本标准适用于进出境魔芋细菌性叶斑病菌寄主植物及其繁殖材料中该病菌的检疫和鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注且期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T4789.282003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂SN/T1157进出境植物苗木检疫规程3魔芋细菌性叶斑病菌基本信息
学名：Acidovorarkonjaci（Goto1983）Willems，etal.1992.异名：Pseudomonasavenaesubsp.konjaci（Goto，1983）Hu，etal.，199l；Acidovoraravenaesubsp.honjaci;Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp.konjaci Goto 1983.分类地位：原核生物界（Procaryotae），薄壁菌门（Gracilicutes），暗细菌纲（Scotobacteria）、假单胞杆菌目（Pseudomonadales）、假单胞杆菌科（Pseudomonadaceae）嗜酸菌属（Acidovorar）。传播途径：带菌的种芋是远距离传播主要途径。在田间和温室，主要通过灌溉水、雨水、风力、修剪枝等传播，由伤口、气孔和自然裂口侵人寄主组织。魔芋细菌性叶斑病菌的其他信息参见附录A。4方法原理
根据症状现场采集病样，实验室开展分离培养纯化，及革兰氏染色、生理生化、致病性测定和分子生物学的检测，鉴定特征吻合，检测结果为阳性的，判定为魔芋细菌性叶斑病菌。5仪器用具和主要试剂
5.1仪器及用具
生物显微镜、具透射光源的体视显微镜、超净工作台、电子天平、光照恒温培养箱、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、高压火菌器、酒精灯、培养Ⅲ（直径：7.0和9.0cm）、医用注射器（10mL）、针头（18号）、医用手术剪、镊子、解剖刀、烧杯（500mL），试管（直径12mm）、载玻片、盖玻片、量筒(500mL)
5.2主要试剂
除另有规定外，所有试剂均为分析纯。蒸馏水、蛋白陈、0.1%次氯酸钠或75%乙醇、PPSM培养基、SV/T3681--2013
YP培养基、金氏B(KB)培养基。培养基配制方法见附录B。现场检测
6.1抽样
块茎或植株按SN/T1157中的规定进行抽样。6.2症状检查
首先应查看植株是否类瓮，检查植株的根茎叶等各个部位叶片是否有斑点、下垂，根、或块是否腐烂。如果发现上述任何一种症状，切取或将整棵植株取回实验室检验。7
实验室检测
病原菌的分离培养
7.1.1病原菌的分离
用灭菌剪刀（或解剖刀）剪取可疑症状的植物组织，取表层组织切成约2mm小块，先用75%的乙装有2mL1%蛋白水溶液的无
醇浸泡305表面消毒，捞出后用无菌水洗8次，最后把病组织置放在菌离心管中，用无菌的玻碎，用无菌接种环蘸取汁液在PPSM平板上划线，28℃恒温培养2d～3d后，检查是否有菌落产生。
7.1.2菌种纯化
采用平板划线法，即用无菌的接种环蘸取窝隆状、全缘、中央部淡紫桃色、周边透明的菌落后，在YP或KB平板上多次划线纯化，28℃恒温培养2d-3d移出单个菌落后进步扩大繁殖。7.2革兰氏染色反应
按GB/T4789.28—2003中的2.2
7.3生理生化测定
进行实
分离菌的生理生化测定，可结合实验室条件，选用以下任
送进行
应用生化管或微量发酵管进行分离菌的生理生化测定。A.koniaci标推菌株革兰氏反应阴性，氧化酶反应阳性，能分解丙二酸，不能利用D半乳糖、2-氨基乙醇。若上述特征符合则选取可疑菌落作进一步鉴定。
应用BIOLOG全自动微生物鉴定系统鉴定分离菌。按BIOLOG规定的操作方法进行，如果24h鉴定结果为A.konjaci，则判定该分离菌BIOLOG鉴定结果为阳性，选取可疑菌落作进一步鉴定。
7.4致病性测定
将培养24h~48h的分离菌用灭菌水配成浓度为10°CFU/mL10=CFU/mL的菌悬液，用注射法接种到具2~3片真叶的健康魔芋苗叶片上，分别设置阴性对照和空白对照。接种后植株在27℃~30℃保湿培养，24h后开始观察发病症状，每隔24h观察一次。A.konjaci标准菌株在接种48h后接种部位开始出现小的水浸状病斑，5d7d后非接种部位出现病斑，随着时间的延长，病斑迅速扩展蔓延，1周后病斑达到(10mm~20mm）×（2mm~4mm）的大小。2
-TrKAONTKAca
7.5分子生物学检测
SN/T3681—2013
分子生物学检测见附录C。通过电泳观察，若有872bp大小的产物带出现，且扩增产物与魔芋细菌性叶斑病菌（GenBank：AY572033.1）同源性达到99%以上，则判定结果为阳性，否则判定结果为阴性。
8结果判定
凡培养特征、生理生化特征与A.konjaci吻合，且采用致病性测定或分子生物学检测其中之一结果为阳性的，判定为检测样品中带有魔芋细菌性叶斑病菌：否则判定为检测样品中不带有魔芋细菌性叶斑病菌。
9样品保存
9.1样品保存与处理
保存样品经登记和经手人签字后置于阴凉干燥、防虫防鼠处妥善保存3个月。对检出魔芋细菌性叶斑病菌的样品应至少保存6个月，以备复检、谈判和仲裁，该类样品保存期满后，需经灭菌后方可处理。
9.2菌株保存与处理
从检测样品中分离到并鉴定为魔芋细菌性叶斑病菌的菌株，应妥善保存。将菌株转接到试管斜面上，28℃恒温培养48h。然后置于4℃冰箱中保存定期（30d~60）转接，防止病菌死亡；或在菌悬液中加人15%~30%的甘油于-80℃下保存必要时将菌株用真空冷冻干燥机制成冻干粉，-80℃下长期保存。
9.3结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点，方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。
iKAoNiKAca
SN/T3681—2013
A.1名称
附录A
（资料性附录）下载标准就来标准下载网
魔芋细菌性叶斑病菌其他信息
中文名称：魔芋细菌性叶斑病菌异名：类产碱假单胞菌魔芋亚种、燕麦假单胞菌魔芋亚种、燕麦食酸菌麟芋亚种英文名称：Bacterial leafblightofthekonjacplant;leafspotand leafblight.A.2
症状特征
在潮湿的自然条件下，魔芋叶柄伤口处被感染，感染处迅速扩大，叶斑出现。叶片产生斑点、下垂腐烂，块茎腐烂，挤压病部有污白色菌脓溢出。人工接种，48h后接种部位开始出现小的水浸状病斑，5d～7d后非接种部位出现病斑，随着时间的延长，病斑迅速扩展蔓延，一周后病斑达到（10mm~20mm）×（2mm~4mm）大小。
寄主范围
魔芋（Amorphophalluskonjac）。A.4分布
日本。
A.5病原菌培养性状及形态特征
在YP培养基上生长白色、圆形、透明、表面光滑、略微突起，28℃培养5d后菌落直径2mm~3mm。在KB培养基上产生棕褐色水溶物该病菌菌体杆状，0.5μm×（1.8μm~~2.3μm），好氧型，极生单根鞭毛，无荧光，革兰氏反应阴性。(G+C)mol%占66%~68%
A.6近似种生理生化特征
见表A,1。
表A.1近似种生理生化特征表
氧化酶
明胶液化
A.komnjaci
Acidovmorar cattteyae
Acidovorarcitrulli
TTKAONIKAca
精氨酸双水解酶
葡萄糖产酸
丙二酸
D半乳糖
2-氨基乙醇
A.konjaci
注：“土”表示阳性反应；“二”表示阴性反应。表A.1（续）
Acidovorarcattleyae
SN/T3681—2013
Acidowrar citrulli
KANiKAca
SN/T3681-—2013
选择性培养基（PPSM）
B.1.1成分
磷酸二氢钾
Na,HPO, .12H,O
酒石酸钠
硫酸胺
L-白氨酸
MgSO,.7H,0
CaCl,.2H,O
Na,Mo0,.2H,0
甲基紫
氨芒青霉素钠
放线菌酮
双硫胺甲酰苯菌灭粉剂
琼脂粉
配制方法
附录B
（规范性附录）
魔芋细菌性叶斑病菌常用的培养基配方0.5g
10 μg
将除氨芋青霉素钠、放线菌酮、双硫胺甲酰苯菌灵粉剂以外的成分充分溶解，加蒸馆水至1000.0mL.121℃湿热火菌15min~20min。使用前再添加已过滤除菌的三种溶液，YP培养基
酵母膏
蛋白陈
加蒸馏水至1000.0ml
调整pH至7.4.121℃湿热灭菌15min20min。B.3
金氏B培养基（KB）
蛋白陈
TKAoNRAca
磷酸氢二钾
MgSO4·7H0
加蒸馏水至1000.0ml.
调整pH至7.2，121℃湿热灭菌15min~20minSN/T3681—2013
SN/T3681-2013
C.1病原细菌DNA的提取
附录C
（规范性附录）
分子生物学检测
C.1.1将供试菌株在斜面培养基上28℃培养48h。C.1.2
将细菌悬浮液转移至一干净的10mL离心管中，10000g离心10min，弃上清液，加人TE缓冲液5mL10%SDS溶液300μL.20mg/mL蛋白酶K30μL，混匀，37℃水浴孵育1h加入等体积的三氯甲烷/兄戊醇（24：1）混匀，12000g离心10min，取上清液。C.1.3
加人等体积三氯甲烷/异戊醇（24：1)混匀，12000g离心10min。将上清液转移至一离心管，加入0.6倍体积的异丙醇，混勾，12000g离心10min，弃上清液，70%乙醇洗涤沉淀，室温干燥后，用100L灭菌双蒸水溶解。注：也可用细菌DNA提取试剂盒。病原菌DNA提取也可省略，直接用培养的菌株稀释悬浊液作为模板进行PCR度应。
引物序列
采用如下引物：PF：5-TGYACACACCGCCCGT-3”，PR：5\-GGGTTBCCCCATTCRG-3。其中，YC/T.B=G/T/C.R=A/G
PCR反应体系及参数
PCR反应体系
PCR反应体系见表C.1。
试剂名称
10XPCR反应缓冲液
MgCl。
Tag plusDNA聚合酶
DNA模板
PCR反应体系
终浓度
2.5mmol/L
0.2mmol/L
0.2μmol/L
0.2μmol/1.
20ng~100ng
补ddH0至50μL
阴性对照、阳性对照和空自对照的设置阴性对照、阳性对照和空口对照的设置；阳性对照：采用魔芋细菌性叶斑病菌或含有待测基因序列8
SN/T3681—2013
的质粒；空白对照：设两个，一是提取DNA时设置的提取空白对照（以H.O代替样品），二是PCR反应的空白对照（以水代替DNA模板）。C.3.3PCR的反应参数
95℃/1min；94℃/30S，57℃/40S72℃/2min.35个循环；最后72℃延伸10min注：不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整C.4琼脂糖凝胶电泳
制备1%的琼脂糖凝胶，按比例混勾电泳上样缓冲液和PCR扩增产物，用DNAMarker作为分了量标记，进行电泳分析，电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的DNA条带，并拍摄记录。
BLAST同源性比较
将扩增产物纯化后进行测序，测序结果在GenBank中进行BLAST比对，比较PCR产物与魔芋细菌性叶斑病菌的同源性。
结果判断
通过电泳观察，若有872bp大小的产物带出现，且扩增产物与魔芋细菌性叶斑病菌（GenBankAY572033.1)同源性达到99%以上，则判定结果为阳性.否则判定结果为阴性9
SN/T3681—2013
参考文献
L1]回文广，赵廷吕，SchaadNW等.哈密瓜细菌性果斑病菌快速检测方法的建立，中国农业科学，2007，40：24952501.
[2]Willems A,GoorM,Thiclemans S, et al.Transfer of several phytopathogenic pseudomnnas Species to Acidovorar as Acidororar avenae subsp. avenae subsp. nov., comb. nov. Aci-dovorar avenae subsp.citrulli,Acidovorar avenae subsp.cattleyae,and Acidovorar konjaci.International Journal of Systematic Bacteriology,1992.1:107119.[3PostnikovaE,Baldwin
gens using multilocus polymerasethology,2008,98.1156-1164.
[4]HuFP.,YoungJM..
hain reaction/electrosprayioniRelatonsk
pathogenic Acidovorax species and suhspecies,albicans by sequence analysis of 16SrDNALeeuwenhoek.2001.80.201-214.5Goto M.Pseudomonas
wrthoideria
fication of bacterial plant patho-on-massspectrometry.Phvtopa
within the Proteobacteria of plantperies,and Herbaspirillum rubrisubnalysis and deterninative lests. Antonie vannumerical ar
seudoalcalig
subsp:nov.,the causal agent ofbacterial leaf blight of konjac (Amorphophalus konjaeKoch.),International Journal of SystematicBacteriology,1983.33:539-545.[6]
Hayashi N. Selective mee
Konjaci, the causal agent of bacterial leaf blight of1opath.Soc:Japan,1987,53:48949L7Schaad N M., Postnikova E.omonas pseudoalcaligenes subsp.(Amorphophalluskonjac).Ann.Phy-Sechler A.. et al.Reclassification of subspecies of Aci-omend..
dovorar avenaeasA,Avenae(Manns1905)citrulli Schaad el al.,1978)comb.novcrobiolagy,2008,31:434-446
(Pavarino,19ll)comb.nov..A.
cattlevae
endproposalof
A.oryzaesp.nuv.SystematicandAppliedMi
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魔芋细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Acidovorax konjaci (Goto,1983) Willems,et al.19922013-08-30发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-03-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T3681—2013
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国湖北出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：甘琴华、历艳、邵秀玲、封立平、刘彩霞、王英超、赵晖、李凤新、纪璞。1
1范围
魔芋细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法本标准规定了进出境植物及其产品中魔芋细菌性叶斑病菌的检疫鉴定方法SN/T3681-2013
本标准适用于进出境魔芋细菌性叶斑病菌寄主植物及其繁殖材料中该病菌的检疫和鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注且期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T4789.282003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂SN/T1157进出境植物苗木检疫规程3魔芋细菌性叶斑病菌基本信息
学名：Acidovorarkonjaci（Goto1983）Willems，etal.1992.异名：Pseudomonasavenaesubsp.konjaci（Goto，1983）Hu，etal.，199l；Acidovoraravenaesubsp.honjaci;Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp.konjaci Goto 1983.分类地位：原核生物界（Procaryotae），薄壁菌门（Gracilicutes），暗细菌纲（Scotobacteria）、假单胞杆菌目（Pseudomonadales）、假单胞杆菌科（Pseudomonadaceae）嗜酸菌属（Acidovorar）。传播途径：带菌的种芋是远距离传播主要途径。在田间和温室，主要通过灌溉水、雨水、风力、修剪枝等传播，由伤口、气孔和自然裂口侵人寄主组织。魔芋细菌性叶斑病菌的其他信息参见附录A。4方法原理
根据症状现场采集病样，实验室开展分离培养纯化，及革兰氏染色、生理生化、致病性测定和分子生物学的检测，鉴定特征吻合，检测结果为阳性的，判定为魔芋细菌性叶斑病菌。5仪器用具和主要试剂
5.1仪器及用具
生物显微镜、具透射光源的体视显微镜、超净工作台、电子天平、光照恒温培养箱、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、高压火菌器、酒精灯、培养Ⅲ（直径：7.0和9.0cm）、医用注射器（10mL）、针头（18号）、医用手术剪、镊子、解剖刀、烧杯（500mL），试管（直径12mm）、载玻片、盖玻片、量筒(500mL)
5.2主要试剂
除另有规定外，所有试剂均为分析纯。蒸馏水、蛋白陈、0.1%次氯酸钠或75%乙醇、PPSM培养基、SV/T3681--2013
YP培养基、金氏B(KB)培养基。培养基配制方法见附录B。现场检测
6.1抽样
块茎或植株按SN/T1157中的规定进行抽样。6.2症状检查
首先应查看植株是否类瓮，检查植株的根茎叶等各个部位叶片是否有斑点、下垂，根、或块是否腐烂。如果发现上述任何一种症状，切取或将整棵植株取回实验室检验。7
实验室检测
病原菌的分离培养
7.1.1病原菌的分离
用灭菌剪刀（或解剖刀）剪取可疑症状的植物组织，取表层组织切成约2mm小块，先用75%的乙装有2mL1%蛋白水溶液的无
醇浸泡305表面消毒，捞出后用无菌水洗8次，最后把病组织置放在菌离心管中，用无菌的玻碎，用无菌接种环蘸取汁液在PPSM平板上划线，28℃恒温培养2d～3d后，检查是否有菌落产生。
7.1.2菌种纯化
采用平板划线法，即用无菌的接种环蘸取窝隆状、全缘、中央部淡紫桃色、周边透明的菌落后，在YP或KB平板上多次划线纯化，28℃恒温培养2d-3d移出单个菌落后进步扩大繁殖。7.2革兰氏染色反应
按GB/T4789.28—2003中的2.2
7.3生理生化测定
进行实
分离菌的生理生化测定，可结合实验室条件，选用以下任
送进行
应用生化管或微量发酵管进行分离菌的生理生化测定。A.koniaci标推菌株革兰氏反应阴性，氧化酶反应阳性，能分解丙二酸，不能利用D半乳糖、2-氨基乙醇。若上述特征符合则选取可疑菌落作进一步鉴定。
应用BIOLOG全自动微生物鉴定系统鉴定分离菌。按BIOLOG规定的操作方法进行，如果24h鉴定结果为A.konjaci，则判定该分离菌BIOLOG鉴定结果为阳性，选取可疑菌落作进一步鉴定。
7.4致病性测定
将培养24h~48h的分离菌用灭菌水配成浓度为10°CFU/mL10=CFU/mL的菌悬液，用注射法接种到具2~3片真叶的健康魔芋苗叶片上，分别设置阴性对照和空白对照。接种后植株在27℃~30℃保湿培养，24h后开始观察发病症状，每隔24h观察一次。A.konjaci标准菌株在接种48h后接种部位开始出现小的水浸状病斑，5d7d后非接种部位出现病斑，随着时间的延长，病斑迅速扩展蔓延，1周后病斑达到(10mm~20mm）×（2mm~4mm）的大小。2
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7.5分子生物学检测
SN/T3681—2013
分子生物学检测见附录C。通过电泳观察，若有872bp大小的产物带出现，且扩增产物与魔芋细菌性叶斑病菌（GenBank：AY572033.1）同源性达到99%以上，则判定结果为阳性，否则判定结果为阴性。
8结果判定
凡培养特征、生理生化特征与A.konjaci吻合，且采用致病性测定或分子生物学检测其中之一结果为阳性的，判定为检测样品中带有魔芋细菌性叶斑病菌：否则判定为检测样品中不带有魔芋细菌性叶斑病菌。
9样品保存
9.1样品保存与处理
保存样品经登记和经手人签字后置于阴凉干燥、防虫防鼠处妥善保存3个月。对检出魔芋细菌性叶斑病菌的样品应至少保存6个月，以备复检、谈判和仲裁，该类样品保存期满后，需经灭菌后方可处理。
9.2菌株保存与处理
从检测样品中分离到并鉴定为魔芋细菌性叶斑病菌的菌株，应妥善保存。将菌株转接到试管斜面上，28℃恒温培养48h。然后置于4℃冰箱中保存定期（30d~60）转接，防止病菌死亡；或在菌悬液中加人15%~30%的甘油于-80℃下保存必要时将菌株用真空冷冻干燥机制成冻干粉，-80℃下长期保存。
9.3结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点，方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。
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SN/T3681—2013
A.1名称
附录A
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魔芋细菌性叶斑病菌其他信息
中文名称：魔芋细菌性叶斑病菌异名：类产碱假单胞菌魔芋亚种、燕麦假单胞菌魔芋亚种、燕麦食酸菌麟芋亚种英文名称：Bacterial leafblightofthekonjacplant;leafspotand leafblight.A.2
症状特征
在潮湿的自然条件下，魔芋叶柄伤口处被感染，感染处迅速扩大，叶斑出现。叶片产生斑点、下垂腐烂，块茎腐烂，挤压病部有污白色菌脓溢出。人工接种，48h后接种部位开始出现小的水浸状病斑，5d～7d后非接种部位出现病斑，随着时间的延长，病斑迅速扩展蔓延，一周后病斑达到（10mm~20mm）×（2mm~4mm）大小。
寄主范围
魔芋（Amorphophalluskonjac）。A.4分布
日本。
A.5病原菌培养性状及形态特征
在YP培养基上生长白色、圆形、透明、表面光滑、略微突起，28℃培养5d后菌落直径2mm~3mm。在KB培养基上产生棕褐色水溶物该病菌菌体杆状，0.5μm×（1.8μm~~2.3μm），好氧型，极生单根鞭毛，无荧光，革兰氏反应阴性。(G+C)mol%占66%~68%
A.6近似种生理生化特征
见表A,1。
表A.1近似种生理生化特征表
氧化酶
明胶液化
A.komnjaci
Acidovmorar cattteyae
Acidovorarcitrulli
TTKAONIKAca
精氨酸双水解酶
葡萄糖产酸
丙二酸
D半乳糖
2-氨基乙醇
A.konjaci
注：“土”表示阳性反应；“二”表示阴性反应。表A.1（续）
Acidovorarcattleyae
SN/T3681—2013
Acidowrar citrulli
KANiKAca
SN/T3681-—2013
选择性培养基（PPSM）
B.1.1成分
磷酸二氢钾
Na,HPO, .12H,O
酒石酸钠
硫酸胺
L-白氨酸
MgSO,.7H,0
CaCl,.2H,O
Na,Mo0,.2H,0
甲基紫
氨芒青霉素钠
放线菌酮
双硫胺甲酰苯菌灭粉剂
琼脂粉
配制方法
附录B
（规范性附录）
魔芋细菌性叶斑病菌常用的培养基配方0.5g
10 μg
将除氨芋青霉素钠、放线菌酮、双硫胺甲酰苯菌灵粉剂以外的成分充分溶解，加蒸馆水至1000.0mL.121℃湿热火菌15min~20min。使用前再添加已过滤除菌的三种溶液，YP培养基
酵母膏
蛋白陈
加蒸馏水至1000.0ml
调整pH至7.4.121℃湿热灭菌15min20min。B.3
金氏B培养基（KB）
蛋白陈
TKAoNRAca
磷酸氢二钾
MgSO4·7H0
加蒸馏水至1000.0ml.
调整pH至7.2，121℃湿热灭菌15min~20minSN/T3681—2013
SN/T3681-2013
C.1病原细菌DNA的提取
附录C
（规范性附录）
分子生物学检测
C.1.1将供试菌株在斜面培养基上28℃培养48h。C.1.2
将细菌悬浮液转移至一干净的10mL离心管中，10000g离心10min，弃上清液，加人TE缓冲液5mL10%SDS溶液300μL.20mg/mL蛋白酶K30μL，混匀，37℃水浴孵育1h加入等体积的三氯甲烷/兄戊醇（24：1）混匀，12000g离心10min，取上清液。C.1.3
加人等体积三氯甲烷/异戊醇（24：1)混匀，12000g离心10min。将上清液转移至一离心管，加入0.6倍体积的异丙醇，混勾，12000g离心10min，弃上清液，70%乙醇洗涤沉淀，室温干燥后，用100L灭菌双蒸水溶解。注：也可用细菌DNA提取试剂盒。病原菌DNA提取也可省略，直接用培养的菌株稀释悬浊液作为模板进行PCR度应。
引物序列
采用如下引物：PF：5-TGYACACACCGCCCGT-3”，PR：5\-GGGTTBCCCCATTCRG-3。其中，YC/T.B=G/T/C.R=A/G
PCR反应体系及参数
PCR反应体系
PCR反应体系见表C.1。
试剂名称
10XPCR反应缓冲液
MgCl。
Tag plusDNA聚合酶
DNA模板
PCR反应体系
终浓度
2.5mmol/L
0.2mmol/L
0.2μmol/L
0.2μmol/1.
20ng~100ng
补ddH0至50μL
阴性对照、阳性对照和空自对照的设置阴性对照、阳性对照和空口对照的设置；阳性对照：采用魔芋细菌性叶斑病菌或含有待测基因序列8
SN/T3681—2013
的质粒；空白对照：设两个，一是提取DNA时设置的提取空白对照（以H.O代替样品），二是PCR反应的空白对照（以水代替DNA模板）。C.3.3PCR的反应参数
95℃/1min；94℃/30S，57℃/40S72℃/2min.35个循环；最后72℃延伸10min注：不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整C.4琼脂糖凝胶电泳
制备1%的琼脂糖凝胶，按比例混勾电泳上样缓冲液和PCR扩增产物，用DNAMarker作为分了量标记，进行电泳分析，电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的DNA条带，并拍摄记录。
BLAST同源性比较
将扩增产物纯化后进行测序，测序结果在GenBank中进行BLAST比对，比较PCR产物与魔芋细菌性叶斑病菌的同源性。
结果判断
通过电泳观察，若有872bp大小的产物带出现，且扩增产物与魔芋细菌性叶斑病菌（GenBankAY572033.1)同源性达到99%以上，则判定结果为阳性.否则判定结果为阴性9
SN/T3681—2013
参考文献
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(Pavarino,19ll)comb.nov..A.
cattlevae
endproposalof
A.oryzaesp.nuv.SystematicandAppliedMi
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