SN/T 3686-2013
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标准简介
SN/T 3686-2013.Detection and identification of Candidatus Phytoplasma fraxini.
1范围
SN/T 3686规定了白蜡树黄化植原体的检疫和鉴定方法。
SN/T 3686适用于进出境白蜡树苗木中白蜡树黄化植原体的检疫鉴定。
2原理
2.1分类地位
白蜡树黄化植原体( Candidatus Phytoplashna fraxini, Ash yellows ph ytoplasma),软壁菌门(Tenericutes) ,柔膜菌纲( Mollicutes),非固醇菌原体目(Acholeplasmatales)，非固醇菌原体科( Achole-plasmataceae) ,植原体属(Phytoplasma),16SrVI植原体组。
2.2 鉴定方法
白蜡树黄化植原体的分子生物学特性作为本标准鉴定方法的主要依据。
本标准应用植原体分类鉴定软件(iPhyClassifier)，得到特异性的植原体核糖体16SrDNA序列限制性内切酶模拟指纹图谱,该软件提供的模拟酶切图谱作为鉴定的依据。
3仪器、用具和试剂
3.1 仪器
PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅制冰机、台式冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统。
3.2 用具
可调移液器(20μL、200μL、1000μL)及相关吸头、研钵、离心管(2mL)、PCR管、量简、烧杯、酒精灯、镊子等。
1范围
SN/T 3686规定了白蜡树黄化植原体的检疫和鉴定方法。
SN/T 3686适用于进出境白蜡树苗木中白蜡树黄化植原体的检疫鉴定。
2原理
2.1分类地位
白蜡树黄化植原体( Candidatus Phytoplashna fraxini, Ash yellows ph ytoplasma),软壁菌门(Tenericutes) ,柔膜菌纲( Mollicutes),非固醇菌原体目(Acholeplasmatales)，非固醇菌原体科( Achole-plasmataceae) ,植原体属(Phytoplasma),16SrVI植原体组。
2.2 鉴定方法
白蜡树黄化植原体的分子生物学特性作为本标准鉴定方法的主要依据。
本标准应用植原体分类鉴定软件(iPhyClassifier)，得到特异性的植原体核糖体16SrDNA序列限制性内切酶模拟指纹图谱,该软件提供的模拟酶切图谱作为鉴定的依据。
3仪器、用具和试剂
3.1 仪器
PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅制冰机、台式冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统。
3.2 用具
可调移液器(20μL、200μL、1000μL)及相关吸头、研钵、离心管(2mL)、PCR管、量简、烧杯、酒精灯、镊子等。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3686—2013
白蜡树黄化植原体检疫鉴定方法Detection and identification of Candidatus Phytoplasma fraxini2013-08-30发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-03-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口SN/T3686-2013
本标准起草单位：中华人民共和国大津出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：刘鹏、赵文军、廖芳、赵卫东、牛春敬、郭京泽、王金成、李鑫、黄国明。1范围
白蜡树黄化植原体检疫鉴定方法本标准规定了白蜡树黄化植原体的检疫和鉴定方法本标准适用于进出境白蜡树苗木中白蜡树黄化植原体的检疫鉴定。2原理
2.1分类地位
SN/T3686-—2013
白蜡树黄化植原体（CandidatusPhytoplasma fraxini.Ashyellowsphytoplasma），软壁菌门（Tenericutes），柔膜菌纲（Mollicutes），非固醇菌原体月（Acholeplasmatales），非固醇菌原体科（Acholeplasmataceae），植原体属（Phytoplasma）16Sr植原体组2.2鉴定方法
白蜡树黄化植原体的分子生物学特性作为本标准鉴定方法的主要依据本标准应用植原体分类鉴定软件（iPhyClassifier）得到特兄性的植原体核糖体16SrDNA序列限制性内切酶模拟指纹图谱，该软件提供的模拟酶切图谱作为鉴定的依据。3仪器、用具和试剂
3.1仪器
PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、制冰机、台式冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统3.2用具
可调移液器（20μL、200μL、1000)及相关吸头、研体、离心管（2mL）、PCR管、量筒、烧杯、酒精灯、镊子等。
3.3试剂
3.3.1研磨液
Na2HPO4
NaH,PO
0.03mol/L
10mmol/1(pH8.0)wwW.bzxz.Net
10%（质量浓度）
聚乙烯吡咯烷酮（PVP)-40
调整pH至7.6，然后过滤除菌。
2%（质量浓度）
使用前加入0.15%（质量浓度）牛血清白蛋白（BSA）和1mmol/L维生素C。1
SN/T3686—2013
2CTAB缓冲液
Tris-HCl
PVP-40
3.3.3其他试剂
2%（质量浓度）
1C0 mmol/L(pH8.0)
20mmol/L(pH8.0)
1%（质量浓度）
苯酚、三氯甲烷、异戊醇、异内醇、Z醇琼脂糖、溴化锭、PCR缓冲液、TaoDNA聚合酶、引物等4检测鉴定方法
4.1症状观察
现场对白蜡树苗木进行观察，症状描述参见附录A，挑取可疑症状植株样品带回实验室检测。2植原体DNA提取方法
取0.3g组织（树根韧皮部组织，可选取叶脉和叶柄）放于研钵中，加人3mI.预冷研磨液并研磨，将粗汁液转移至2ml.离心管中，4℃下4500r/min离心5min，将悬浮液转至新的2mL离心管中，4℃下13000r/min离心15min，去掉上清液，在750μL预热（55℃）CTAB缓冲液中悬浮沉淀，55℃下孵育30min，间歇颠倒混勾.离心管在冰上冷却30s，加入750uL三氯甲烷：异戊醇（24：1体积比），涡旋振荡，1℃或室温下130c0r/min离心4min，小心将上面水相转至一个新的1.5mL离心管中，加入1体积预冷异丙醇，涡旋振荡，冰上孵育4min后4℃或室温下13000r/min离心10min，去掉上清液，用500μL70%（体积分数）冷乙醇洗涤DNA沉淀，4℃或空温下13000r/min离心1min，干燥DNA沉淀，用20uL灭菌蒸馏水悬浮沉淀，55℃下孵育离心管10mim有助于DNA再悬浮，一20℃短期贮存或一80℃长期贮存
注：植原体基因组DNA提取方法也可采用商品试剂盒提取。4.3通用引物PCR扩增及序列测定用2对通用引物进行巢式PCR反应及凝胶电泳检测，扩增植原体16SrDNA序列，方法见附录B。4.4序列分析鉴定
将第二轮PCR产物（引物R16ln/R16rn)进行序列测定，序列与Genebank上已知的白蜡树黄化植原体序列进行比对。
4.5RFLP分析
应用软件（iPhyClassifier)对植原体16SrDNA序列进行分析，软件原理为以17种限制性内切酶AluIBamHI,BfaI.BstUl,DraI,EcoRI,Hael,HhaI,HinfI,paI.Hpuall,KpnI.Mbol，Msel，RsaI，SspI，TagI对白蜡树黄化植原体的16SrDNA（R16fn/R16rn）进行模拟酶切图谱分析，标准酶切图谱见附录B。
-TKAONiKAca
5结果判定
SN/T3686-2013
对照结果正常，通用引物R16fn/R16rn经第二轮PCR扩增在1250bp左右处有条带出现，将其扣增产物测序并与Genebank上已知的白蜡树黄化植原体序列进行比对同源性最高；同时进行RFLP图谱分析，图谱分析结果与白蜡树黄化植原体标准图谱一致，则判定该植物样品携带白蜡树黄化植原体。6
样品和资料的保存
6.1样品保存与处理
样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出白蜡树黄化植原体的样品应保存于一20℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满应经高压灭菌后方可处理。6.2结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间、实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签宇。
KAoNiKAca
SN/T3686—2013
A，1白蜡树黄化植原体
A.1.1症状
附录A
（资料性附录）
白蜡树黄化植原体生物学特性
该植原体病害最典型症状为枝档丛枝，叶片变小，边缘卷曲，颜色变浅绿，后期变黄萎蕊，造成白蜡树等寄主植物生长衰退。树木的各生长阶段均可感病且表现症状：以美国白蜡树（whiteash）为例，植原体危害的症状包括：幼苗或小树发育迟缓，韧皮部呈现微黄色，根部坏死，严重的在树术发育早期就会枯黄死亡。在病害晚期，靠近树干基部十有幼嫩枝条生长。随着树龄的增长对植原体病害的抵抗能力会逐渐增强。
A.1.2寄主范围
白蜡树是主要寄主：包括白蜡树属（Fracin）的约12个种，其中以美国白蜡树（whitcash）和downyash较易感病。在自然条件下，部分丁香属（syringae）的植物也是白蜡树植原休的寄主，包括Syringa josikaea（hungarian lilac)Syringajulianae,Syringaoblata，Syringapersica（lilac),Syringauillosa（latelilac），Syringauuigariclilae）等。接种寄主包括胡萝卜，红三叶草，长春花等。A.1.3传播途径
据文献记载，日前认为白蜡树黄化植原体最早在北美中部地区被发现并传播。近距离传播主要山取食植株韧皮部的介体昆虫传播，如叶蝉（Fieberiellaflorii）等：白蜡树属和丁香属苗木的移裁调运可以使植原体病原远距离传播。
据研究，该植原体不随种子或幼苗传播A.1.4地理分布
美国（科罗拉多州、康涅狄格州、伊利伊诺州、印地安那州、爱荷华州，堪萨斯州，肯塔基州，马萨诸塞州、密歇根州，明尼苏达州.密苏里州蒙大拿州·内布拉斯加州，新军布什尔州，新泽西州、纽约州，北达科他州，俄亥俄州·宾夕法尼亚州·南达科他州，犹他州，佛蒙特州·西弗古尼亚州，威斯康星州，怀俄明州）、加拿大（阿尔伯塔省，曼尼托巴省，安大略省，魁北克省萨斯喀彻温省）。A.1.5分子生物学特性
植原体基因组包括染色体与染色体外（质粒）两部分，遗传物质为dsDNA，分子量约为5×10°道尔顿。此外，植原体基因组DNA中，G+C含量较低，为23%29.5%，A+T含量较丰富。16SrDNA基因是原核生物的高度保守序列，在植原体及其他支原体原核生物的分类研究中，它常作为系统分类比较的主要特征。
-TrKAoNrKAca
引物序列
引物序列见表B.1。
通用引物
附录B
（规范性附录）
通用引物PCR扩增和RFLP指纹图谱表B.1引物序列表
引物名称
PCR反应体系及参数
PCR反应体系见表B.2。
试剂名称
10×PCR缓冲液
10mmol/LdNTP
5pmol/L上游引物
5μmol/L下游引物
5U/μLTaqDNA聚合酶
10ng/μL模板DNA
双蒸水
CATGCA
SN/T3686—2013
引物序列5°3
AGT CGA ACG GA
AACCCCAATCATCAAC
ACAGTTGCTAAGACTGG
GCGGTGTGTACAAACCCCG
POR反应体系表
加样量/ul
注：DNA模板的取量应根据DNA的提取浓度、纯度而调节；根据DNA模板的取量补充双蒸水至30.0μL。B.2.2阴性对照、阳性对照和空白对照的设置阴性对照：以健康的叶片DNA为模板。阳性对照：以携带有白蜡树黄化植原体16SrDNA序列的质粒或DNA为模板。PCR反应的空白对照：以无菌蒸馏水代替DNA模板。B.2.3PCR的反应条件
应用引物R16mF/R16mR进行第1轮PCR。反应条件为：94℃/5min；94℃/30s，53℃/30s，72℃/1min，35个循环；72℃/10min。反应体系见表B.2。第1轮PCR产物用灭菌双蒸水1：50（体积比）稀释，取1μL为模板应用通用引物R16fn/R16rn5
iiKAoNrKAca
SN/T3686—2013
进行第2轮PCR反应。R16fn/R16rm反应条件为：94℃/5min：94C/30s，60℃/30s，72℃/1min，35个循环；72℃/10min。反应体系见表B.2。不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。B.3琼脂糖凝胶电泳
制备1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳分析，电泳结束后在凝胶成像仪观察并记录结果。B.4白蜡树黄化植原体RFLP指纹图谱白蜡树黄化植原体RFLP指纹图谱见图B。图B白蜡树黄化植原体RFLP指纹图谱
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白蜡树黄化植原体检疫鉴定方法Detection and identification of Candidatus Phytoplasma fraxini2013-08-30发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-03-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口SN/T3686-2013
本标准起草单位：中华人民共和国大津出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：刘鹏、赵文军、廖芳、赵卫东、牛春敬、郭京泽、王金成、李鑫、黄国明。1范围
白蜡树黄化植原体检疫鉴定方法本标准规定了白蜡树黄化植原体的检疫和鉴定方法本标准适用于进出境白蜡树苗木中白蜡树黄化植原体的检疫鉴定。2原理
2.1分类地位
SN/T3686-—2013
白蜡树黄化植原体（CandidatusPhytoplasma fraxini.Ashyellowsphytoplasma），软壁菌门（Tenericutes），柔膜菌纲（Mollicutes），非固醇菌原体月（Acholeplasmatales），非固醇菌原体科（Acholeplasmataceae），植原体属（Phytoplasma）16Sr植原体组2.2鉴定方法
白蜡树黄化植原体的分子生物学特性作为本标准鉴定方法的主要依据本标准应用植原体分类鉴定软件（iPhyClassifier）得到特兄性的植原体核糖体16SrDNA序列限制性内切酶模拟指纹图谱，该软件提供的模拟酶切图谱作为鉴定的依据。3仪器、用具和试剂
3.1仪器
PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、制冰机、台式冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统3.2用具
可调移液器（20μL、200μL、1000)及相关吸头、研体、离心管（2mL）、PCR管、量筒、烧杯、酒精灯、镊子等。
3.3试剂
3.3.1研磨液
Na2HPO4
NaH,PO
0.03mol/L
10mmol/1(pH8.0)wwW.bzxz.Net
10%（质量浓度）
聚乙烯吡咯烷酮（PVP)-40
调整pH至7.6，然后过滤除菌。
2%（质量浓度）
使用前加入0.15%（质量浓度）牛血清白蛋白（BSA）和1mmol/L维生素C。1
SN/T3686—2013
2CTAB缓冲液
Tris-HCl
PVP-40
3.3.3其他试剂
2%（质量浓度）
1C0 mmol/L(pH8.0)
20mmol/L(pH8.0)
1%（质量浓度）
苯酚、三氯甲烷、异戊醇、异内醇、Z醇琼脂糖、溴化锭、PCR缓冲液、TaoDNA聚合酶、引物等4检测鉴定方法
4.1症状观察
现场对白蜡树苗木进行观察，症状描述参见附录A，挑取可疑症状植株样品带回实验室检测。2植原体DNA提取方法
取0.3g组织（树根韧皮部组织，可选取叶脉和叶柄）放于研钵中，加人3mI.预冷研磨液并研磨，将粗汁液转移至2ml.离心管中，4℃下4500r/min离心5min，将悬浮液转至新的2mL离心管中，4℃下13000r/min离心15min，去掉上清液，在750μL预热（55℃）CTAB缓冲液中悬浮沉淀，55℃下孵育30min，间歇颠倒混勾.离心管在冰上冷却30s，加入750uL三氯甲烷：异戊醇（24：1体积比），涡旋振荡，1℃或室温下130c0r/min离心4min，小心将上面水相转至一个新的1.5mL离心管中，加入1体积预冷异丙醇，涡旋振荡，冰上孵育4min后4℃或室温下13000r/min离心10min，去掉上清液，用500μL70%（体积分数）冷乙醇洗涤DNA沉淀，4℃或空温下13000r/min离心1min，干燥DNA沉淀，用20uL灭菌蒸馏水悬浮沉淀，55℃下孵育离心管10mim有助于DNA再悬浮，一20℃短期贮存或一80℃长期贮存
注：植原体基因组DNA提取方法也可采用商品试剂盒提取。4.3通用引物PCR扩增及序列测定用2对通用引物进行巢式PCR反应及凝胶电泳检测，扩增植原体16SrDNA序列，方法见附录B。4.4序列分析鉴定
将第二轮PCR产物（引物R16ln/R16rn)进行序列测定，序列与Genebank上已知的白蜡树黄化植原体序列进行比对。
4.5RFLP分析
应用软件（iPhyClassifier)对植原体16SrDNA序列进行分析，软件原理为以17种限制性内切酶AluIBamHI,BfaI.BstUl,DraI,EcoRI,Hael,HhaI,HinfI,paI.Hpuall,KpnI.Mbol，Msel，RsaI，SspI，TagI对白蜡树黄化植原体的16SrDNA（R16fn/R16rn）进行模拟酶切图谱分析，标准酶切图谱见附录B。
-TKAONiKAca
5结果判定
SN/T3686-2013
对照结果正常，通用引物R16fn/R16rn经第二轮PCR扩增在1250bp左右处有条带出现，将其扣增产物测序并与Genebank上已知的白蜡树黄化植原体序列进行比对同源性最高；同时进行RFLP图谱分析，图谱分析结果与白蜡树黄化植原体标准图谱一致，则判定该植物样品携带白蜡树黄化植原体。6
样品和资料的保存
6.1样品保存与处理
样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出白蜡树黄化植原体的样品应保存于一20℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满应经高压灭菌后方可处理。6.2结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间、实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签宇。
KAoNiKAca
SN/T3686—2013
A，1白蜡树黄化植原体
A.1.1症状
附录A
（资料性附录）
白蜡树黄化植原体生物学特性
该植原体病害最典型症状为枝档丛枝，叶片变小，边缘卷曲，颜色变浅绿，后期变黄萎蕊，造成白蜡树等寄主植物生长衰退。树木的各生长阶段均可感病且表现症状：以美国白蜡树（whiteash）为例，植原体危害的症状包括：幼苗或小树发育迟缓，韧皮部呈现微黄色，根部坏死，严重的在树术发育早期就会枯黄死亡。在病害晚期，靠近树干基部十有幼嫩枝条生长。随着树龄的增长对植原体病害的抵抗能力会逐渐增强。
A.1.2寄主范围
白蜡树是主要寄主：包括白蜡树属（Fracin）的约12个种，其中以美国白蜡树（whitcash）和downyash较易感病。在自然条件下，部分丁香属（syringae）的植物也是白蜡树植原休的寄主，包括Syringa josikaea（hungarian lilac)Syringajulianae,Syringaoblata，Syringapersica（lilac),Syringauillosa（latelilac），Syringauuigariclilae）等。接种寄主包括胡萝卜，红三叶草，长春花等。A.1.3传播途径
据文献记载，日前认为白蜡树黄化植原体最早在北美中部地区被发现并传播。近距离传播主要山取食植株韧皮部的介体昆虫传播，如叶蝉（Fieberiellaflorii）等：白蜡树属和丁香属苗木的移裁调运可以使植原体病原远距离传播。
据研究，该植原体不随种子或幼苗传播A.1.4地理分布
美国（科罗拉多州、康涅狄格州、伊利伊诺州、印地安那州、爱荷华州，堪萨斯州，肯塔基州，马萨诸塞州、密歇根州，明尼苏达州.密苏里州蒙大拿州·内布拉斯加州，新军布什尔州，新泽西州、纽约州，北达科他州，俄亥俄州·宾夕法尼亚州·南达科他州，犹他州，佛蒙特州·西弗古尼亚州，威斯康星州，怀俄明州）、加拿大（阿尔伯塔省，曼尼托巴省，安大略省，魁北克省萨斯喀彻温省）。A.1.5分子生物学特性
植原体基因组包括染色体与染色体外（质粒）两部分，遗传物质为dsDNA，分子量约为5×10°道尔顿。此外，植原体基因组DNA中，G+C含量较低，为23%29.5%，A+T含量较丰富。16SrDNA基因是原核生物的高度保守序列，在植原体及其他支原体原核生物的分类研究中，它常作为系统分类比较的主要特征。
-TrKAoNrKAca
引物序列
引物序列见表B.1。
通用引物
附录B
（规范性附录）
通用引物PCR扩增和RFLP指纹图谱表B.1引物序列表
引物名称
PCR反应体系及参数
PCR反应体系见表B.2。
试剂名称
10×PCR缓冲液
10mmol/LdNTP
5pmol/L上游引物
5μmol/L下游引物
5U/μLTaqDNA聚合酶
10ng/μL模板DNA
双蒸水
CATGCA
SN/T3686—2013
引物序列5°3
AGT CGA ACG GA
AACCCCAATCATCAAC
ACAGTTGCTAAGACTGG
GCGGTGTGTACAAACCCCG
POR反应体系表
加样量/ul
注：DNA模板的取量应根据DNA的提取浓度、纯度而调节；根据DNA模板的取量补充双蒸水至30.0μL。B.2.2阴性对照、阳性对照和空白对照的设置阴性对照：以健康的叶片DNA为模板。阳性对照：以携带有白蜡树黄化植原体16SrDNA序列的质粒或DNA为模板。PCR反应的空白对照：以无菌蒸馏水代替DNA模板。B.2.3PCR的反应条件
应用引物R16mF/R16mR进行第1轮PCR。反应条件为：94℃/5min；94℃/30s，53℃/30s，72℃/1min，35个循环；72℃/10min。反应体系见表B.2。第1轮PCR产物用灭菌双蒸水1：50（体积比）稀释，取1μL为模板应用通用引物R16fn/R16rn5
iiKAoNrKAca
SN/T3686—2013
进行第2轮PCR反应。R16fn/R16rm反应条件为：94℃/5min：94C/30s，60℃/30s，72℃/1min，35个循环；72℃/10min。反应体系见表B.2。不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。B.3琼脂糖凝胶电泳
制备1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳分析，电泳结束后在凝胶成像仪观察并记录结果。B.4白蜡树黄化植原体RFLP指纹图谱白蜡树黄化植原体RFLP指纹图谱见图B。图B白蜡树黄化植原体RFLP指纹图谱
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