SN/T 3746-2013
基本信息
标准号： SN/T 3746-2013
中文名称：百合枯萎病菌检疫鉴定方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3746-2013.Detection and identification of Fusarium oxysporum f.sp.lilii.
1范围
SN/T 3746规定了百合枯萎病菌的检疫鉴定方法。
SN/T 3746适用于百合鳞球茎中携带的百合枯萎病菌的检疫鉴定。
2病菌基本信息
中文名:百合枯菱病菌
英文名:lily fusarium wilt .
学名:Fusarium oxysporum f.sp.lilii Snyd. & hans.
分类地位:无性阶段属于:真菌界(KingdomFungi),半知菌亚门(Deuteromycotina),丝孢纲(Hy-phomycetes) ,瘤座孢目( Tubercularigles),瘤座孢科(T uberculariaceae),镰刀菌属( Fusarium)。未见有性阶段。
3方法原理
本标准根据该病菌在百合鳞茎球上的主要危害症状特征、形态学特征以及PCR反应特性为鉴定百合枯萎病菌的依据。
4仪 器和用具
4.1 主要仪器与用具
超净工作台、生化培养箱、生物显微镜生物体视显微镜PCR仪、凝胶电泳仪、台式冷冻离心机、水浴培养箱、制冰机、旋涡振荡器、电泳仪、恒温水浴锅、紫外透射仪、凝胶成像系统、研钵和研棒、天平(感量0.0001g)、白磁盘和尖头镊子、pH计、塑料袋、离心管等。
4.2主要试剂和培养基
次氯酸钠、TrisHCI、氯化钠、EDTA.三氯甲烷、异戊醇、4种脱氧核苷三磷酸(dNTPs).溴化乙锭(EB)、RNase酶、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、异丙醇、巯基乙醇、溴酚蓝、CTAB、Taq酶等。PSA培养基(马铃薯200g,蔗糖20g,琼脂20g,蒸馏水1000mL)。
1范围
SN/T 3746规定了百合枯萎病菌的检疫鉴定方法。
SN/T 3746适用于百合鳞球茎中携带的百合枯萎病菌的检疫鉴定。
2病菌基本信息
中文名:百合枯菱病菌
英文名:lily fusarium wilt .
学名:Fusarium oxysporum f.sp.lilii Snyd. & hans.
分类地位:无性阶段属于:真菌界(KingdomFungi),半知菌亚门(Deuteromycotina),丝孢纲(Hy-phomycetes) ,瘤座孢目( Tubercularigles),瘤座孢科(T uberculariaceae),镰刀菌属( Fusarium)。未见有性阶段。
3方法原理
本标准根据该病菌在百合鳞茎球上的主要危害症状特征、形态学特征以及PCR反应特性为鉴定百合枯萎病菌的依据。
4仪 器和用具
4.1 主要仪器与用具
超净工作台、生化培养箱、生物显微镜生物体视显微镜PCR仪、凝胶电泳仪、台式冷冻离心机、水浴培养箱、制冰机、旋涡振荡器、电泳仪、恒温水浴锅、紫外透射仪、凝胶成像系统、研钵和研棒、天平(感量0.0001g)、白磁盘和尖头镊子、pH计、塑料袋、离心管等。
4.2主要试剂和培养基
次氯酸钠、TrisHCI、氯化钠、EDTA.三氯甲烷、异戊醇、4种脱氧核苷三磷酸(dNTPs).溴化乙锭(EB)、RNase酶、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、异丙醇、巯基乙醇、溴酚蓝、CTAB、Taq酶等。PSA培养基(马铃薯200g,蔗糖20g,琼脂20g,蒸馏水1000mL)。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3746—2013
百合枯萎病菌检疫鉴定方法
Detection and identification of Fusarium oxysporum f.sp.lilii2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3746—2013
本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、上海市农业科学院、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：戚龙君、宋绍祎、戴富明、曾蓉、杨翠云、王宏毅。T
1范围
百合委病菌检疫鉴定方法
本标准规定了百合枯萎病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于百合鳞球茎中携带的百合枯菱病菌的检疫鉴定。2病菌基本信息
中文名：百合枯菱病菌
英文名：lilyfusariumwilt
学名：Fusarium oxysporumf.sp.liliiSnyd.&hansSN/T3746—2013
分类地位：无性阶段属于：真菌界（KingdomFungi），半知菌亚门（Deuteromycotina），丝孢纲（Hy-phomycetes），瘤座孢日（Tuberculariales），瘤座孢科（Tuberculariaceae），镰刀菌属（Fusarium）。未见有性阶段。
传播途径：主要有：a）土壤传播，土壤带菌传播是该病原菌传播释的主要途径之一；b）种球传病，带病的种球通过买卖、运输等途径传播病害：e残体带菌，病球的残体存在大量病原菌，在土壤中能长期存活，在再次种植过程中，能传播病菌。百合枯萎病菌的其他信息参见附录A。3方法原理
本标准根据该病菌在百合鳞茎球上的主要危害症状特征形态学特征以及PCR反应特性为鉴定百合枯萎病菌的依据。
4仪器和用具
4.1主要仪器与用具
超净工作台、生化培养箱、生物显微镜、生物体视显微镜、PCR仪、凝胶电泳仪、台式冷冻离心机、水浴培养箱、制冰机、旋涡振荡器、电泳仪、恒温水浴锅、紫外透射仪、凝胶成像系统、研钵和研棒、天平（感量0.0001g）、白磁盘和尖头镊子、pH计、塑料袋、离心管等。4.2主要试剂和培养基
次氯酸钠、Tris-HCI、氯化钠、EDTA、三氟甲烷、异戊醇、4种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）、溴化乙锭(EB)、RNase酶、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、异丙醇、巯基乙醇、溴酚蓝、CTAB、Tag酶等。PSA培养基（马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL）。5病原菌鉴定
症状检查
根据百合枯菱病在百合鳞球茎上的特有症状特点，在光线充足处，对于抽取的样品逐个检查块茎表SN/T3746—2013
面是否有典型的病斑，将有典型病症以及有怀疑症状的鳞球茎做进一步的分离和病原菌检疫鉴定。5.2病菌分离、纯化及形态观察
鳞球茎表面具有典型病斑的：可将块茎在流水下冲洗去除表面的杂物后，表面用1%的次氯酸钠消毒3min~5min，无菌水冲洗2~3次，切下病健交界处的小块组织（3mm厚直径1cm），置于PSA上24℃～26℃下分离培养，3d～7d后在体视显微镜下观察。出现菌落后，将菌落的边缘或分生孢子转移到PSA上继续纯化培养，产孢后进行形态鉴定（病原菌图片参见附录B）。5.3菌丝的PCR检测
在PSA培养基上25C培养获得的菌丝可直接进行PCR检测，检测方法见附录C。5.4鳞球茎上病原菌的PCR和巢式PCR检测对于没有典型病斑的鳞球茎，可直接进行PCR和巢式PCR检测，检测方法见附录D。6鉴定特征
6.1菌落特征和病菌形态
病菌在PSA上气生菌丝绒状，洁白丰厚，培养中后期培养物正面或者背面可见牵牛紫色。产孢细胞短，简单瓶梗。小型分生孢子数量多，卵圆形或者椭圆型，0隔~1隔，但多数无分隔，大小在（4.2um~11.1μm）×（1.5μm~3.6μm）之间。大型分生孢子组型美丽，月芽形，稍弯，向两端比较均勾变尖，一般3隔~5隔，多数3隔，大小为（12.3μm~48.3um）×（2.0μm~6.0μm）。厚垣孢子多为球形，直径为8.0μm～15.0um，间生或顶生。未见有性阶段。6.2PCR和巢式PCR检测
百合枯菱病菌培养菌丝的PCR检测：PCR产物在343bp处有特异性条带；鳞球茎中病菌的巢式PCR检测：在343bp和326bp处有特异性条带。7结果判定
如症状检查、分离物培养性状与6.1相符合，且其菌丝基因组DNA经6.2的PCR检测在343bp有特异性条带，而阳性对照也在343bp有特异性条带、阴性对照在343bp无特异性条带，可判定该菌株为百合枯菱病菌；如阳性对照在343bp处有特异性条带，而待测样本和阴性对照在343bp处无特异性条带，则为非白合枯萎病菌，
对鳞茎球的巢式PCR检测，在343bp和326bp处有特异性条带，而阳性对照也在343bp和326bp有特异性条带，阴性对照在343bp和326bp无特异性条带，可判定样本带有百合枯萎病菌；如阳性对照在343bp和326bp处有特异性条带，而待测样本和阴性对照在343bp和326bp处无特异性条带，则判定样本无百合枯萎病菌。8样品保存与处理
发现带有百合枯萎病菌的样品至少保存6个月，以备复检、谈判和仲裁。保存期满后进行灭活处理。
iiKAoNrkAca
菌种保存与处理
SN/T3746—2013
分离获得的百合枯萎病菌单孢分离培养物，保存在PSA斜面培养基上，4℃冰箱中保存至少6个月，以备复检、谈判和仲裁。保存期满后进行灭活处理。10
实验室记录与保存
实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点，方法和结果等，并要有实验人员和审核人员的签字。
-irKAoNrKAca
SN/T3746—2013
A.1寄主范围
附录A
（资料性附录）
百合枯萎病菌的其他信息
目前已经报道的寄主有：百合、洋葱。A.2地理分布
亚洲：韩国、日本、中国台湾
欧洲：西班牙、荷兰、意大利、波兰。美洲：美国
病害症状
百合枯萎病菌在百合鳞茎球上的主要为害症状特征：病菌从肉质根或鳞茎盘基部伤口侵入，造成肉质根和盘基变褐腐烂，并逐渐向发展，鳞片出现褐色凹陷病斑后期鳞片从盘基散开面剥落。S
iikAoNiKca
附录B
（资料性附录）
百合枯萎病菌的培养特征和形态特征B.1百合枯萎病菌在PSA上菌落形态见图B.1。图B.1
百合枯萎病菌在PSA上菌落形态（A：正面：B：反面）B.2百合枯菱病菌孢子形态见图B.2~图B.4图B.2百合枯萎病菌两种不同类型的分生孢子SN/T3746—2013
irkAoNiKAca
SN/T3746—2013
图B.3百合枯菱病菌小型分生孢子着生方式图B.4百合枯萎病菌的厚垣孢子
KAOMIKAca
C.1试剂
C.1.1提取缓冲液免费标准bzxz.net
附录C
（规范性附录）
百合枯萎病菌丝的PCR检测
SN/T3746—2013
2%TritonX-100,1%SDS,100mmol/LNaCl,10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH 8.0)。
C.1.2电泳缓冲液：TAE缓冲液（50×）Tris
Na,EDTA·2H,O
然后加人800mL的去离子水，充分搅拌溶解。加人57.1mL的冰醋酸，充分混匀。加去离子水定容至1L，室温保存。
C.1.3上样缓冲液
0.25%溴酚蓝，40%（质量分数）蔗糖。C.2菌丝体DNA的提取（改良的BustnGrab法）菌落在PSA培养基上25℃培养5d~7d.刮取10mg~20mg的菌丝加人200μL提取缓冲液中，剧烈混勾后置于75℃下30min，旋涡振荡30s后加人500μL三氯甲烷，旋涡振荡2min，12000r/min离心3min，上层水相转人另一1.5mL的离心管中，加入400uL的预冷的无水乙醇，上下颠倒轻柔混匀，一20℃放置30min。12000r/min离心5min，弃上清液，加0.5mL70%乙醇，12000r/min离心1min弃上清。室温条件下自然干燥后加人20uL～30μLddH,O，加1μLRNaseA（10μg/mL），37℃30min
C.3PCR扩增
C.3.1百合枯萎病菌特异性引物
上游引物BK-F60：5TGAACATACCACTTGTTGCCTC3下游引物BK-R402：5＇CGCCAATCAATTTGAGGAA3”C.3.2
PCR反应
PCR扩增的反应体系体积20μL，其中包括1μL病样模板DNA，2uL10XPCR反应缓冲液，2μIMgCl（25mmol/L），2μLdNTPs（每种2.5mmol/L），2μL正向引物（10μmol/L），2μL反向引物(10μmol/L),0.4μLTaq酶(1U/μL)。反应条件：95℃变性3min，然后在95℃变性45s.57℃退火30s、53℃退火30s、72℃延伸45s条件下循环重复35次，最后72℃延伸10min。7
SN/T3746—2013
C.3.3对照
阳性对照：以百合枯萎病菌的基因组DNA(10ng)代替待鉴定菌株的基因组DNA，其他条件相同。阴性对照：为1uL.ddH,O代替鉴定病原菌的基因组DNA，其他条件相同。C.3.4产物分析
制备1.0%琼脂糖凝胶，移液器取10=l.扩增产物和2L上样缓冲液混合，点样到凝胶上的样品孔中，用DNAMarker作为分子量标记，1V/cm~5V/cm电压下电泳。电泳结束经EB染色后在凝胶成像系统观察、照相并记录。
C.4结果判断
PCR扩增结果为待测样本和阳性对照在343bp处有特异性条带，而阴性对照在343bp处无特异性条带，则菌株为百合枯菱病菌。PCR扩增结果为阳性对照在343bp处有特异性条带，而待测样本和阴性对照在343bp处无特异性条带，则为非百合枯萎病菌。S
D.1试剂
D.1.1提取缓冲液
附录D
（规范性附录）
鳞球茎中病原菌巢式PCR检测
SN/T3746—2013
STE缓冲液：0.1mol/LNaCl,10mmol/LTris-Cl(pH8.0)1mmol/LEDTA(pH8.0)。CTAB缓冲液（2×）：20g/LCTAB.1.4mol/LNaCl.20mmol/LEDTA（pH8.0），2%巯基乙醇（体积分数）。
D.1.2电泳缓冲液：TAE缓冲液（50×）Tris
Na,EDTA·2H20
然后加人800mL的去离子水，充分搅拌溶解。加人57.1mL的醋酸，充分混匀。加去离子水定容至1L，室温保存。
D.1.3上样缓冲液
0.25%溴酚蓝，40%（质量分数）蔗糖D.2鳞球茎DNA的提取
取百合鳞叶，剪成小碎片，置冷冻的研钵中加10%PVP粉末后速加液氮研成粉末。取50mg粉末，迅速转入至预冷的离心管中，即加0.5mL预冷的STE缓冲液迅速混匀，放置2min后置冷冻离心机中（4℃）3000r/min离心4mm，弃上清液，留沉淀。重复操作1次，沉淀，备用。
往沉淀中加人0.4mlL65℃预热的2×CTAB提取缓冲液，迅速温匀，置65℃中水浴60min，其问不断振摇。
取出放置至冷，吸取上清液至另一离心管中。加人等体积的三氯中烷-异戊醇（241）轻柔倒转完全混勾，静置至分层。于室温，12000r/min离心10min，取上清液。重复以上步骤1次，留上清液。往上清液中加入1/2倍体积5mol/LNaCl后混匀，再往其中加人等体积倍异丙醇颠倒混勺，置20冰箱中放置20min使DNA沉淀。用70%乙醇洗2次，干燥，
往沉淀中加人30μL40μLddHO溶解DNA沉淀，再加入2uLRNase10μg/mL），37C水浴30min
D.3PCR扩增
D.3.1引物
第一轮引物BKF60/BKR402
SN/T3746-—2013
BK-F60：5TGAACATACCACTTGTTGCCTC3”BK-R402：5CGCCAATCAATTTGAGGAA3第二轮引物BKF60/BK-R385
BK-F60：5'TGAACATACCACTTGTTGCCTC3BK-R385：5AACGCGAATTAACGCGAGT3D.3.2
反应体系
PCR扩增的反应体系体积20ML，其中包括1uL病样模板DNA，2μL.10×PCR反应缓冲液，2μLMgCl2（25mmol/L），2μLdNTPs（每种2.5mmol/L），2μl正向引物（10μmol/L），2μL反向引物(10μmol/L).0.4μLTag酶(1U/μL)。第一轮引物PCR扩增条件：95℃变性3min，然后在95℃变性45s、57℃退火30s、53℃退火30s、72℃延伸45s条件下循环重复35次，最后72℃延伸10min。取1μL第一轮PCR反应产物，用作第二对引物PCR反应的模板，进行第二轮PCR反应，第二轮引物PCR扩增条件：95℃变性3min，然后在95℃变性458.55C退火30s、72℃延伸45s条件下循环重复35次，最后72℃延伸10min。D.3.3对照
阳性对照：以百合枯萎病菌的基因组DNA（1Ong)代替待鉴定菌株的基因组DNA，其他条件相同阴性对照：为1μLddHO代替鉴定病原菌的基因组DNA，其他条件相同D.3.4产物分析
制备1.0%琼脂糖凝胶，移液器取10叫扩增产物和2ul.上样缓冲液混合·点样到凝胶上的样品孔中，用DNAMarker作为分了量标记，1V/cm~5V/cm电压下电泳。电泳结束经EB染色后在凝胶成像系统观察、照相并记录。
D.4结果判断
PCR扩增结果为待测样本和阳性对照在343bp和326bp处有特异性条带.而阴性对照在343bp和326bp处无特异性条带，则判定样本带有百合枯菱病菌。PCR扩增结果为阳性对照在343bp和326bp处有特异性条带，而待测样本和阴性对照在343bp和326bp处无特异性条带，则判定样本无百合枯萎病菌。
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百合枯萎病菌检疫鉴定方法
Detection and identification of Fusarium oxysporum f.sp.lilii2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3746—2013
本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、上海市农业科学院、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：戚龙君、宋绍祎、戴富明、曾蓉、杨翠云、王宏毅。T
1范围
百合委病菌检疫鉴定方法
本标准规定了百合枯萎病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于百合鳞球茎中携带的百合枯菱病菌的检疫鉴定。2病菌基本信息
中文名：百合枯菱病菌
英文名：lilyfusariumwilt
学名：Fusarium oxysporumf.sp.liliiSnyd.&hansSN/T3746—2013
分类地位：无性阶段属于：真菌界（KingdomFungi），半知菌亚门（Deuteromycotina），丝孢纲（Hy-phomycetes），瘤座孢日（Tuberculariales），瘤座孢科（Tuberculariaceae），镰刀菌属（Fusarium）。未见有性阶段。
传播途径：主要有：a）土壤传播，土壤带菌传播是该病原菌传播释的主要途径之一；b）种球传病，带病的种球通过买卖、运输等途径传播病害：e残体带菌，病球的残体存在大量病原菌，在土壤中能长期存活，在再次种植过程中，能传播病菌。百合枯萎病菌的其他信息参见附录A。3方法原理
本标准根据该病菌在百合鳞茎球上的主要危害症状特征形态学特征以及PCR反应特性为鉴定百合枯萎病菌的依据。
4仪器和用具
4.1主要仪器与用具
超净工作台、生化培养箱、生物显微镜、生物体视显微镜、PCR仪、凝胶电泳仪、台式冷冻离心机、水浴培养箱、制冰机、旋涡振荡器、电泳仪、恒温水浴锅、紫外透射仪、凝胶成像系统、研钵和研棒、天平（感量0.0001g）、白磁盘和尖头镊子、pH计、塑料袋、离心管等。4.2主要试剂和培养基
次氯酸钠、Tris-HCI、氯化钠、EDTA、三氟甲烷、异戊醇、4种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）、溴化乙锭(EB)、RNase酶、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、异丙醇、巯基乙醇、溴酚蓝、CTAB、Tag酶等。PSA培养基（马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL）。5病原菌鉴定
症状检查
根据百合枯菱病在百合鳞球茎上的特有症状特点，在光线充足处，对于抽取的样品逐个检查块茎表SN/T3746—2013
面是否有典型的病斑，将有典型病症以及有怀疑症状的鳞球茎做进一步的分离和病原菌检疫鉴定。5.2病菌分离、纯化及形态观察
鳞球茎表面具有典型病斑的：可将块茎在流水下冲洗去除表面的杂物后，表面用1%的次氯酸钠消毒3min~5min，无菌水冲洗2~3次，切下病健交界处的小块组织（3mm厚直径1cm），置于PSA上24℃～26℃下分离培养，3d～7d后在体视显微镜下观察。出现菌落后，将菌落的边缘或分生孢子转移到PSA上继续纯化培养，产孢后进行形态鉴定（病原菌图片参见附录B）。5.3菌丝的PCR检测
在PSA培养基上25C培养获得的菌丝可直接进行PCR检测，检测方法见附录C。5.4鳞球茎上病原菌的PCR和巢式PCR检测对于没有典型病斑的鳞球茎，可直接进行PCR和巢式PCR检测，检测方法见附录D。6鉴定特征
6.1菌落特征和病菌形态
病菌在PSA上气生菌丝绒状，洁白丰厚，培养中后期培养物正面或者背面可见牵牛紫色。产孢细胞短，简单瓶梗。小型分生孢子数量多，卵圆形或者椭圆型，0隔~1隔，但多数无分隔，大小在（4.2um~11.1μm）×（1.5μm~3.6μm）之间。大型分生孢子组型美丽，月芽形，稍弯，向两端比较均勾变尖，一般3隔~5隔，多数3隔，大小为（12.3μm~48.3um）×（2.0μm~6.0μm）。厚垣孢子多为球形，直径为8.0μm～15.0um，间生或顶生。未见有性阶段。6.2PCR和巢式PCR检测
百合枯菱病菌培养菌丝的PCR检测：PCR产物在343bp处有特异性条带；鳞球茎中病菌的巢式PCR检测：在343bp和326bp处有特异性条带。7结果判定
如症状检查、分离物培养性状与6.1相符合，且其菌丝基因组DNA经6.2的PCR检测在343bp有特异性条带，而阳性对照也在343bp有特异性条带、阴性对照在343bp无特异性条带，可判定该菌株为百合枯菱病菌；如阳性对照在343bp处有特异性条带，而待测样本和阴性对照在343bp处无特异性条带，则为非白合枯萎病菌，
对鳞茎球的巢式PCR检测，在343bp和326bp处有特异性条带，而阳性对照也在343bp和326bp有特异性条带，阴性对照在343bp和326bp无特异性条带，可判定样本带有百合枯萎病菌；如阳性对照在343bp和326bp处有特异性条带，而待测样本和阴性对照在343bp和326bp处无特异性条带，则判定样本无百合枯萎病菌。8样品保存与处理
发现带有百合枯萎病菌的样品至少保存6个月，以备复检、谈判和仲裁。保存期满后进行灭活处理。
iiKAoNrkAca
菌种保存与处理
SN/T3746—2013
分离获得的百合枯萎病菌单孢分离培养物，保存在PSA斜面培养基上，4℃冰箱中保存至少6个月，以备复检、谈判和仲裁。保存期满后进行灭活处理。10
实验室记录与保存
实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点，方法和结果等，并要有实验人员和审核人员的签字。
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SN/T3746—2013
A.1寄主范围
附录A
（资料性附录）
百合枯萎病菌的其他信息
目前已经报道的寄主有：百合、洋葱。A.2地理分布
亚洲：韩国、日本、中国台湾
欧洲：西班牙、荷兰、意大利、波兰。美洲：美国
病害症状
百合枯萎病菌在百合鳞茎球上的主要为害症状特征：病菌从肉质根或鳞茎盘基部伤口侵入，造成肉质根和盘基变褐腐烂，并逐渐向发展，鳞片出现褐色凹陷病斑后期鳞片从盘基散开面剥落。S
iikAoNiKca
附录B
（资料性附录）
百合枯萎病菌的培养特征和形态特征B.1百合枯萎病菌在PSA上菌落形态见图B.1。图B.1
百合枯萎病菌在PSA上菌落形态（A：正面：B：反面）B.2百合枯菱病菌孢子形态见图B.2~图B.4图B.2百合枯萎病菌两种不同类型的分生孢子SN/T3746—2013
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SN/T3746—2013
图B.3百合枯菱病菌小型分生孢子着生方式图B.4百合枯萎病菌的厚垣孢子
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C.1试剂
C.1.1提取缓冲液免费标准bzxz.net
附录C
（规范性附录）
百合枯萎病菌丝的PCR检测
SN/T3746—2013
2%TritonX-100,1%SDS,100mmol/LNaCl,10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH 8.0)。
C.1.2电泳缓冲液：TAE缓冲液（50×）Tris
Na,EDTA·2H,O
然后加人800mL的去离子水，充分搅拌溶解。加人57.1mL的冰醋酸，充分混匀。加去离子水定容至1L，室温保存。
C.1.3上样缓冲液
0.25%溴酚蓝，40%（质量分数）蔗糖。C.2菌丝体DNA的提取（改良的BustnGrab法）菌落在PSA培养基上25℃培养5d~7d.刮取10mg~20mg的菌丝加人200μL提取缓冲液中，剧烈混勾后置于75℃下30min，旋涡振荡30s后加人500μL三氯甲烷，旋涡振荡2min，12000r/min离心3min，上层水相转人另一1.5mL的离心管中，加入400uL的预冷的无水乙醇，上下颠倒轻柔混匀，一20℃放置30min。12000r/min离心5min，弃上清液，加0.5mL70%乙醇，12000r/min离心1min弃上清。室温条件下自然干燥后加人20uL～30μLddH,O，加1μLRNaseA（10μg/mL），37℃30min
C.3PCR扩增
C.3.1百合枯萎病菌特异性引物
上游引物BK-F60：5TGAACATACCACTTGTTGCCTC3下游引物BK-R402：5＇CGCCAATCAATTTGAGGAA3”C.3.2
PCR反应
PCR扩增的反应体系体积20μL，其中包括1μL病样模板DNA，2uL10XPCR反应缓冲液，2μIMgCl（25mmol/L），2μLdNTPs（每种2.5mmol/L），2μL正向引物（10μmol/L），2μL反向引物(10μmol/L),0.4μLTaq酶(1U/μL)。反应条件：95℃变性3min，然后在95℃变性45s.57℃退火30s、53℃退火30s、72℃延伸45s条件下循环重复35次，最后72℃延伸10min。7
SN/T3746—2013
C.3.3对照
阳性对照：以百合枯萎病菌的基因组DNA(10ng)代替待鉴定菌株的基因组DNA，其他条件相同。阴性对照：为1uL.ddH,O代替鉴定病原菌的基因组DNA，其他条件相同。C.3.4产物分析
制备1.0%琼脂糖凝胶，移液器取10=l.扩增产物和2L上样缓冲液混合，点样到凝胶上的样品孔中，用DNAMarker作为分子量标记，1V/cm~5V/cm电压下电泳。电泳结束经EB染色后在凝胶成像系统观察、照相并记录。
C.4结果判断
PCR扩增结果为待测样本和阳性对照在343bp处有特异性条带，而阴性对照在343bp处无特异性条带，则菌株为百合枯菱病菌。PCR扩增结果为阳性对照在343bp处有特异性条带，而待测样本和阴性对照在343bp处无特异性条带，则为非百合枯萎病菌。S
D.1试剂
D.1.1提取缓冲液
附录D
（规范性附录）
鳞球茎中病原菌巢式PCR检测
SN/T3746—2013
STE缓冲液：0.1mol/LNaCl,10mmol/LTris-Cl(pH8.0)1mmol/LEDTA(pH8.0)。CTAB缓冲液（2×）：20g/LCTAB.1.4mol/LNaCl.20mmol/LEDTA（pH8.0），2%巯基乙醇（体积分数）。
D.1.2电泳缓冲液：TAE缓冲液（50×）Tris
Na,EDTA·2H20
然后加人800mL的去离子水，充分搅拌溶解。加人57.1mL的醋酸，充分混匀。加去离子水定容至1L，室温保存。
D.1.3上样缓冲液
0.25%溴酚蓝，40%（质量分数）蔗糖D.2鳞球茎DNA的提取
取百合鳞叶，剪成小碎片，置冷冻的研钵中加10%PVP粉末后速加液氮研成粉末。取50mg粉末，迅速转入至预冷的离心管中，即加0.5mL预冷的STE缓冲液迅速混匀，放置2min后置冷冻离心机中（4℃）3000r/min离心4mm，弃上清液，留沉淀。重复操作1次，沉淀，备用。
往沉淀中加人0.4mlL65℃预热的2×CTAB提取缓冲液，迅速温匀，置65℃中水浴60min，其问不断振摇。
取出放置至冷，吸取上清液至另一离心管中。加人等体积的三氯中烷-异戊醇（241）轻柔倒转完全混勾，静置至分层。于室温，12000r/min离心10min，取上清液。重复以上步骤1次，留上清液。往上清液中加入1/2倍体积5mol/LNaCl后混匀，再往其中加人等体积倍异丙醇颠倒混勺，置20冰箱中放置20min使DNA沉淀。用70%乙醇洗2次，干燥，
往沉淀中加人30μL40μLddHO溶解DNA沉淀，再加入2uLRNase10μg/mL），37C水浴30min
D.3PCR扩增
D.3.1引物
第一轮引物BKF60/BKR402
SN/T3746-—2013
BK-F60：5TGAACATACCACTTGTTGCCTC3”BK-R402：5CGCCAATCAATTTGAGGAA3第二轮引物BKF60/BK-R385
BK-F60：5'TGAACATACCACTTGTTGCCTC3BK-R385：5AACGCGAATTAACGCGAGT3D.3.2
反应体系
PCR扩增的反应体系体积20ML，其中包括1uL病样模板DNA，2μL.10×PCR反应缓冲液，2μLMgCl2（25mmol/L），2μLdNTPs（每种2.5mmol/L），2μl正向引物（10μmol/L），2μL反向引物(10μmol/L).0.4μLTag酶(1U/μL)。第一轮引物PCR扩增条件：95℃变性3min，然后在95℃变性45s、57℃退火30s、53℃退火30s、72℃延伸45s条件下循环重复35次，最后72℃延伸10min。取1μL第一轮PCR反应产物，用作第二对引物PCR反应的模板，进行第二轮PCR反应，第二轮引物PCR扩增条件：95℃变性3min，然后在95℃变性458.55C退火30s、72℃延伸45s条件下循环重复35次，最后72℃延伸10min。D.3.3对照
阳性对照：以百合枯萎病菌的基因组DNA（1Ong)代替待鉴定菌株的基因组DNA，其他条件相同阴性对照：为1μLddHO代替鉴定病原菌的基因组DNA，其他条件相同D.3.4产物分析
制备1.0%琼脂糖凝胶，移液器取10叫扩增产物和2ul.上样缓冲液混合·点样到凝胶上的样品孔中，用DNAMarker作为分了量标记，1V/cm~5V/cm电压下电泳。电泳结束经EB染色后在凝胶成像系统观察、照相并记录。
D.4结果判断
PCR扩增结果为待测样本和阳性对照在343bp和326bp处有特异性条带.而阴性对照在343bp和326bp处无特异性条带，则判定样本带有百合枯菱病菌。PCR扩增结果为阳性对照在343bp和326bp处有特异性条带，而待测样本和阴性对照在343bp和326bp处无特异性条带，则判定样本无百合枯萎病菌。
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