SN/T 3741.2-2013
基本信息
标准号： SN/T 3741.2-2013
中文名称：国境口岸鼠类携带病原体检测方法第2部分:土拉弗朗西斯菌PCR检测方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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下载大小：448509
相关标签： 国境 口岸 鼠类 携带 病原体 检测 方法 PCR
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3741.2-2013.Detection for pathogens of rodents at frontier ports-Part 2 :Detection for Francisella tularensis.
1范围
SN/T 3741.2规定了国境口岸鼠类样本采集、处理方法、土拉弗朗西斯菌PCR检测的方法和结果判定。
SN/T 3741.2适用于国境口岸鼠类携带病原体检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注8期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安全通 用要求
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1鼠类rodent
与鼠传疾病有关的鼠形动物(包括啮齿目、兔形目和食虫目动物)。
3.2土拉弗朗西斯菌Francisella tularensis
属于弗朗西斯菌属(Francisella),是引起的土拉弗朗西斯菌病<Tularenmia)的病原体。土拉弗朗西斯菌病是一种人兽共患急性传染病,在多种野生动物中流行,人和动物通过接触染疫的动物或感染的水、气溶胶以及吸血昆虫(蜱、蚊、虻)叮咬而感染和传播。野兔是土拉弗朗西斯菌病的主要宿主,人类常因捕猎或接触野兔而受到感染,所以本病又被称为“野兔热”。由于微量土拉弗朗西斯菌即可引起感染，故可以作为生物武器使用,因此备受重视。
4要求
鼠类携带病原体检测应在生物安全2级以上实验室(BSL-2)内进行。实验室应遵循GB 19489对生物安全2级及以上实验室的生物安全要求。
1范围
SN/T 3741.2规定了国境口岸鼠类样本采集、处理方法、土拉弗朗西斯菌PCR检测的方法和结果判定。
SN/T 3741.2适用于国境口岸鼠类携带病原体检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注8期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安全通 用要求
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1鼠类rodent
与鼠传疾病有关的鼠形动物(包括啮齿目、兔形目和食虫目动物)。
3.2土拉弗朗西斯菌Francisella tularensis
属于弗朗西斯菌属(Francisella),是引起的土拉弗朗西斯菌病<Tularenmia)的病原体。土拉弗朗西斯菌病是一种人兽共患急性传染病,在多种野生动物中流行,人和动物通过接触染疫的动物或感染的水、气溶胶以及吸血昆虫(蜱、蚊、虻)叮咬而感染和传播。野兔是土拉弗朗西斯菌病的主要宿主,人类常因捕猎或接触野兔而受到感染,所以本病又被称为“野兔热”。由于微量土拉弗朗西斯菌即可引起感染，故可以作为生物武器使用,因此备受重视。
4要求
鼠类携带病原体检测应在生物安全2级以上实验室(BSL-2)内进行。实验室应遵循GB 19489对生物安全2级及以上实验室的生物安全要求。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3741.2—2013
国境口岸鼠类携带病原体检测方法第2部分：土拉弗朗西斯菌PCR检测方法Detection for pathogens of rodents at frontier ports-Part 2:Detection for Francisella tularensi:2013-11-06 发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
SN/T3741\国境「I岸鼠类携带病原体检测方法》共分为2部分；第I部分：致病性钩端螺旋体PCR检测方法；第2部分：上拉弗朗西斯菌PCR检测方法。本部分为 SN/T 3741的第 2部分。本部分按照GB/T1.1—2009给出的规起革。本部分出国家认证认可监督管现委员会提出并［。SN/T 3741.2—2013
本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院，中华人民决和国云南出人境检验检疫局。本部分主要起草人：孙肖红、刘丽娟、侯中生、刘键、罗忠鑫、杨学兵、胡克林.杨宇、胡孔新、干静。上
1范围
国境口岸鼠类携带病原体检测方法第2部分：土拉弗朗西斯菌PCR检测方法SN/T 3741.2--2013
SN/T3741的本部分规定了国境口岸鼠类样本采集，处理方法，上拉弗朗西斯菌PCR检测的方法和结巢判定。
本部分适用于国境口岸戚类携带病源体检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定变
下列术语和定义适用于本文件。3.1
鼠类rodent
与鼠传疾病有关的鼠形动物（包括啮齿耳,兔形目和食虫目动物）。3.2
土拉弗朗西斯菌 Frdncisella tularensis属工弗期洒斯菌属（e是引起的十拉弗朗西斯菌病（的病原体：拉费郎西斯菌病是一种人兽共患急性传染病，在多种野尘动物中流行，人和动物通过接触染疫的动物或感染的水、气溶胶以及吸血昆虫（蜱、蚊、虹)叮咬而感染和传播。断兔是土拉弗朗西斯菌病的主要宿主，人类常捕猎或接触野兔而受到感染，所以本病又被称为“野免热”。由于微量士拉弗朗西斯菌即可引起感染，故可以作为生物武器使用，因此备受重视。4要求
鼠类带病原体检测应在生物安全 2 级以,I:实验室(BSL-2)内进行。实验室应遵循 GB 19489 对生物安全2级反以上实验室的生物安全要求。5实验仪器设套
主要仪器如下：
一高速台式冷冻离心机；
——组织研磨仪；
—生物安全柜；
SN/T3741.2—2013
电泳仪；
凝胶成像系统：
-PCR仪；
微量加样器（10μL、20μL100μ、200μ1000ml）：冰箱（2℃8℃和-20℃～-80℃）。6主要试剂
6.1核酸提取试剂：组织DNA提取试剂使用天根公司TIANampGenomicDNAkit6.2PCR试剂：dNTP、10XPCR
上g酶便
6.3引物：上游引物Fop1序列-32）AGGTTCAGCTACAGCATCTATCGC，下游引物Fop5序列(5*-3\）：TACCCCTCTGCCATTAGCACC，扩增产物为550bP。6.4氧化锆颗粒（直径3mm）。
6.5RPM1640培养液。
7PCR检测
样本DNA的提取
按照附录A进行。
7.2反应体系的配制
在200uL的PCR反应管中，体
dNTP(2.5mmol/L)o.5μL,10μmol/l体积为
酶O.15L.模板DNA2uL.总
应体系瞬时离心，放入PCR仪
7.3反应条件
人下列试剂，灭菌双蒸水14.35L、10×PCR缓冲液2μL、游引物0.5ml10μmol/L
下游引物0.5μL（5U/μL)Taq
设立阴性对照，阳性对照和空白对照。将配制完成的反30s.72℃30s35个循环，72℃10minPCR反应条件为95℃5mm预变性.94C30，567.4结果判定
取5PCR产物进行2%琼脂糖电泳，依下列标准判断在阴性对照、空白对照未出现条带，阳性对照出现550bp的扩增条带条件下，如待测样品未出现相应大小的扩增条带，则可报告该样品未检出土拉弗朗西斯菌基因片段；如待测样品出现550bp扩增条带则可判定该样品检出土拉弗朗西斯菌基因片段。如果阴性对照空白对照出现条带和（或）阳性对照未出现预期大小的扩增条带，本次待测样品的结果无效·应重新检测，并排除污染因素。1）由指定单位提供，给出这一信息是为了本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同效果，则可使用这些等效产品，2
rKAoNiKAca
A,1鼠类标本采集
A.1.1取材范围
附录A
（规范性附录）
鼠类脏器标本采集，处理方法
在口地区本底调套或监测范围内捕获的鼠类或在该范围内收集的自毙鼠类A.1.2取材方法
SN/T 3741.2—2013
A.1.2.1将获得全部应检类分类、编号登记，单只装人鼠袋内，活鼠麻醉或处死后，分探体表寄生虫，并分类鉴定，然后解剖采样。
A.1.2.2自毙、染病萎鼠类，按照常规方法解剖后，取肝脏、脾脏，装人2mL细胞冻存管中，尽快送检或低温保存。
A,2检测用鼠脏器的处理方法
A,2.1土拉弗朗西斯菌检测的样品处理A,2.1.1组织样品的研磨
分别取 10 mg脾脏,30 mg肝脏,用生理盐水洗--次,置 2 mL 的圆底离心管中,加,人 3 颗直径mm的氧化题粒.再加人们.5mL的RM1640培养液，别维织研磨蘑假4000次/min振荡605，直至无肉眼可见的组织块，即为组织句浆液。4.2.1.2组织 DNA 提取方法-
使用天根牛物公司血液/细胞/组织基因组IDNA提取试剂盒(离心杜型)\。A,2,1.2.1将组织浆液4℃1000g高心1min,奔尽上清液。A,2.1,2,2加 200 μL GA 缓冲液,充分振荡 15 s,室温放置 10 min，A.2.1.2.3加人40μLRNaseA(10mg/ml），振荡15s，室温放置min。A.2.1.2.4加 20 μl. Pruease K,频倒混匀,55 C水浴 3 h。A.2.1.2.5加200μLCR缓冲液，颠倒混匀.70℃水浴10mim。A.2.1.2.6加200 μL无冰乙醇.充分振荡 15 s,将全部液移人柱子巾,12 000g，短暂离心30s。A.2.1.2.7充废液，加500μLGD缓冲液，12000g离心30s。弃废液，加700μLPW缓冲液，12000g离心305。A.2.1.2.8
A.2.1.2.9弃发液加 500 μL PW缓冲液,12 000g 离心30 s。萃废液，12 000g 离心2 min
A.2.1.2.103
A,2.1.2.11
将离心杜放人新套管,室温放置5minA,2.1,2.12向吸附膜的中间部位悬空滴明 50 μ1.洗脱缓冲液,室温效置 2 min。2）山指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标流的使归者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品其有相同的效果，则可使用这些等效产品。KAoNiKAcabzxZ.net
SN/T3741.2—2013
A.2.1.2.1312000g离心2min，收集液即为DNAA.2. 1,3 组织 1NA 提取方法二使用Qiagen公司的DNeasyBlood&TissueKit。A,2.1.3.1将质不超过25mg的组织剪成碎块，督于.5ml.离心管中，加180LATL。A.2.1.3.2加20uL蛋白酶K，旋涡振荡混匀.56℃孵育（孵育过程中不时振荡以分敏样品）至组织完全裂解
A.2.1.3.3旋祸振荡159加20CpL缓冲液AL旋涡振荡混匀.加200gL.乙醇（96%~100）.旋涡振荡混勾。
A.2.1.3.4将得到的混合物转移至DNeusyMinispincolumn（置于2mLculiectionlube巾），6Co0g离心、lmin.弃掉滤液和collection tube.A.2.1.3.5 将 DNeilsy Mini spin column 置于另一新 collcction tube 中,加 500 μL缓冲液 AW1,6 000g 离心Imin.弃掉滤液和collection[ube.A.2.1.3.6将 DNeasy Mini spin column置于男一新collection tube中,加 5co μl.级冲液 AW2,20 c00g 离心3min.弃掉滤液和collection tubceA.2.1.3.7 将 DNeasy Mini spin column 置于另--于净的 1.5 mL 或 2 mL 离心管,取 200 μl. 缀冲液AE直接加到 DNeasy membrane 中，室漏下孵育1 min,6 Coog 离心1 min 以洗脱 DNA.3）由指定单位提供，给出这：信息是为了方便本准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效尽，则可使用这些等效产品。
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国境口岸鼠类携带病原体检测方法第2部分：土拉弗朗西斯菌PCR检测方法Detection for pathogens of rodents at frontier ports-Part 2:Detection for Francisella tularensi:2013-11-06 发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
SN/T3741\国境「I岸鼠类携带病原体检测方法》共分为2部分；第I部分：致病性钩端螺旋体PCR检测方法；第2部分：上拉弗朗西斯菌PCR检测方法。本部分为 SN/T 3741的第 2部分。本部分按照GB/T1.1—2009给出的规起革。本部分出国家认证认可监督管现委员会提出并［。SN/T 3741.2—2013
本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院，中华人民决和国云南出人境检验检疫局。本部分主要起草人：孙肖红、刘丽娟、侯中生、刘键、罗忠鑫、杨学兵、胡克林.杨宇、胡孔新、干静。上
1范围
国境口岸鼠类携带病原体检测方法第2部分：土拉弗朗西斯菌PCR检测方法SN/T 3741.2--2013
SN/T3741的本部分规定了国境口岸鼠类样本采集，处理方法，上拉弗朗西斯菌PCR检测的方法和结巢判定。
本部分适用于国境口岸戚类携带病源体检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定变
下列术语和定义适用于本文件。3.1
鼠类rodent
与鼠传疾病有关的鼠形动物（包括啮齿耳,兔形目和食虫目动物）。3.2
土拉弗朗西斯菌 Frdncisella tularensis属工弗期洒斯菌属（e是引起的十拉弗朗西斯菌病（的病原体：拉费郎西斯菌病是一种人兽共患急性传染病，在多种野尘动物中流行，人和动物通过接触染疫的动物或感染的水、气溶胶以及吸血昆虫（蜱、蚊、虹)叮咬而感染和传播。断兔是土拉弗朗西斯菌病的主要宿主，人类常捕猎或接触野兔而受到感染，所以本病又被称为“野免热”。由于微量士拉弗朗西斯菌即可引起感染，故可以作为生物武器使用，因此备受重视。4要求
鼠类带病原体检测应在生物安全 2 级以,I:实验室(BSL-2)内进行。实验室应遵循 GB 19489 对生物安全2级反以上实验室的生物安全要求。5实验仪器设套
主要仪器如下：
一高速台式冷冻离心机；
——组织研磨仪；
—生物安全柜；
SN/T3741.2—2013
电泳仪；
凝胶成像系统：
-PCR仪；
微量加样器（10μL、20μL100μ、200μ1000ml）：冰箱（2℃8℃和-20℃～-80℃）。6主要试剂
6.1核酸提取试剂：组织DNA提取试剂使用天根公司TIANampGenomicDNAkit6.2PCR试剂：dNTP、10XPCR
上g酶便
6.3引物：上游引物Fop1序列-32）AGGTTCAGCTACAGCATCTATCGC，下游引物Fop5序列(5*-3\）：TACCCCTCTGCCATTAGCACC，扩增产物为550bP。6.4氧化锆颗粒（直径3mm）。
6.5RPM1640培养液。
7PCR检测
样本DNA的提取
按照附录A进行。
7.2反应体系的配制
在200uL的PCR反应管中，体
dNTP(2.5mmol/L)o.5μL,10μmol/l体积为
酶O.15L.模板DNA2uL.总
应体系瞬时离心，放入PCR仪
7.3反应条件
人下列试剂，灭菌双蒸水14.35L、10×PCR缓冲液2μL、游引物0.5ml10μmol/L
下游引物0.5μL（5U/μL)Taq
设立阴性对照，阳性对照和空白对照。将配制完成的反30s.72℃30s35个循环，72℃10minPCR反应条件为95℃5mm预变性.94C30，567.4结果判定
取5PCR产物进行2%琼脂糖电泳，依下列标准判断在阴性对照、空白对照未出现条带，阳性对照出现550bp的扩增条带条件下，如待测样品未出现相应大小的扩增条带，则可报告该样品未检出土拉弗朗西斯菌基因片段；如待测样品出现550bp扩增条带则可判定该样品检出土拉弗朗西斯菌基因片段。如果阴性对照空白对照出现条带和（或）阳性对照未出现预期大小的扩增条带，本次待测样品的结果无效·应重新检测，并排除污染因素。1）由指定单位提供，给出这一信息是为了本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同效果，则可使用这些等效产品，2
rKAoNiKAca
A,1鼠类标本采集
A.1.1取材范围
附录A
（规范性附录）
鼠类脏器标本采集，处理方法
在口地区本底调套或监测范围内捕获的鼠类或在该范围内收集的自毙鼠类A.1.2取材方法
SN/T 3741.2—2013
A.1.2.1将获得全部应检类分类、编号登记，单只装人鼠袋内，活鼠麻醉或处死后，分探体表寄生虫，并分类鉴定，然后解剖采样。
A.1.2.2自毙、染病萎鼠类，按照常规方法解剖后，取肝脏、脾脏，装人2mL细胞冻存管中，尽快送检或低温保存。
A,2检测用鼠脏器的处理方法
A,2.1土拉弗朗西斯菌检测的样品处理A,2.1.1组织样品的研磨
分别取 10 mg脾脏,30 mg肝脏,用生理盐水洗--次,置 2 mL 的圆底离心管中,加,人 3 颗直径mm的氧化题粒.再加人们.5mL的RM1640培养液，别维织研磨蘑假4000次/min振荡605，直至无肉眼可见的组织块，即为组织句浆液。4.2.1.2组织 DNA 提取方法-
使用天根牛物公司血液/细胞/组织基因组IDNA提取试剂盒(离心杜型)\。A,2,1.2.1将组织浆液4℃1000g高心1min,奔尽上清液。A,2.1,2,2加 200 μL GA 缓冲液,充分振荡 15 s,室温放置 10 min，A.2.1.2.3加人40μLRNaseA(10mg/ml），振荡15s，室温放置min。A.2.1.2.4加 20 μl. Pruease K,频倒混匀,55 C水浴 3 h。A.2.1.2.5加200μLCR缓冲液，颠倒混匀.70℃水浴10mim。A.2.1.2.6加200 μL无冰乙醇.充分振荡 15 s,将全部液移人柱子巾,12 000g，短暂离心30s。A.2.1.2.7充废液，加500μLGD缓冲液，12000g离心30s。弃废液，加700μLPW缓冲液，12000g离心305。A.2.1.2.8
A.2.1.2.9弃发液加 500 μL PW缓冲液,12 000g 离心30 s。萃废液，12 000g 离心2 min
A.2.1.2.103
A,2.1.2.11
将离心杜放人新套管,室温放置5minA,2.1,2.12向吸附膜的中间部位悬空滴明 50 μ1.洗脱缓冲液,室温效置 2 min。2）山指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标流的使归者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品其有相同的效果，则可使用这些等效产品。KAoNiKAcabzxZ.net
SN/T3741.2—2013
A.2.1.2.1312000g离心2min，收集液即为DNAA.2. 1,3 组织 1NA 提取方法二使用Qiagen公司的DNeasyBlood&TissueKit。A,2.1.3.1将质不超过25mg的组织剪成碎块，督于.5ml.离心管中，加180LATL。A.2.1.3.2加20uL蛋白酶K，旋涡振荡混匀.56℃孵育（孵育过程中不时振荡以分敏样品）至组织完全裂解
A.2.1.3.3旋祸振荡159加20CpL缓冲液AL旋涡振荡混匀.加200gL.乙醇（96%~100）.旋涡振荡混勾。
A.2.1.3.4将得到的混合物转移至DNeusyMinispincolumn（置于2mLculiectionlube巾），6Co0g离心、lmin.弃掉滤液和collection tube.A.2.1.3.5 将 DNeilsy Mini spin column 置于另一新 collcction tube 中,加 500 μL缓冲液 AW1,6 000g 离心Imin.弃掉滤液和collection[ube.A.2.1.3.6将 DNeasy Mini spin column置于男一新collection tube中,加 5co μl.级冲液 AW2,20 c00g 离心3min.弃掉滤液和collection tubceA.2.1.3.7 将 DNeasy Mini spin column 置于另--于净的 1.5 mL 或 2 mL 离心管,取 200 μl. 缀冲液AE直接加到 DNeasy membrane 中，室漏下孵育1 min,6 Coog 离心1 min 以洗脱 DNA.3）由指定单位提供，给出这：信息是为了方便本准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效尽，则可使用这些等效产品。
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