SN/T 3756-2013.Detection and identification of Pantoea stewartii (Smith) Mergaert et al.-PCR method.
1范围
SN/T 3756规定了进境玉米检疫中玉米细菌性枯萎病菌的常规PCR鉴定方法。
SN/T 3756适用于进境种用及其他用途玉米中玉米细菌性枯菱病菌的检疫和鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
SN/T1375玉米细菌性枯萎病菌检疫鉴定方法
3玉米细菌性枯萎病菌分类地位
学名:Pantoea stewartii(Smith) Mergaert et al.
异名:Pantoea stewartii subsp.tewartirxanthomonas steuwarti ;Apanobacter stewartii ; Bacillus stew-arii; Bacterium stewarti; Phytomonas stewurtii; Pseudobacterium stewartii; Pseudomonas sterwarti;Erwinia sterwartii
分类地位:原核生物界( Procaryotae),薄壁菌门(Gracihcutes)，肠杆菌科( Enterobacteriaceae),泛菌属(Pantoea )。
4方法原理
PCR方法的原理:提取细菌基因组DNA后，利用特异性引物，通过PCR扩增得到特异性目的基因片段,所得产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，依据检测结果判定是否是目的细菌。
5仪器设备
5.1小型粉碎机。
5.2 恒温培养箱:30℃±1℃。
5.3 高压灭菌锅。
5.4 PCR扩增仪。
5.5 PCR超净工作台。
5.6 电泳仪。
5.7 核酸/蛋白分析仪。
5.8凝胶成像系 统。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3756—2013
玉米细菌性萎病菌检疫鉴定方法PCR方法
Detection and identification of Pantoea stewartii(Smith) Mergaert et al.-PCRmethod
2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草SN/T3756—2013
本标准参考了EPPOPM7/6o（1）DiagnosticprotocolforPantoeasteuartiisubsp,steuartiPCRtest。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、大连市产品质量监督检验院。本标准主要起草人：王金玲、王有福、贾东、张莹、李俊环、李成铺、贾金生、李炎、刘文博、侯天亮。1
1范围
玉米细菌性枯萎病菌检疫鉴定方法PCR方法
本标准规定了进境玉米检疫中玉米细菌性枯萎病菌的常规PCR鉴定方法，本标准适用于进境种用及其他用途玉米中玉米细菌性枯萎病菌的检疫和鉴定。规范性引用文件
SN/T3756—2013
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T1375玉米细菌性枯菱病菌检疫鉴定方法3玉米细菌性枯菱病菌分类地位
学名：Pantoea sterwartii(Smith）Mergaert ct al.异名：Pantoea stewartiisubsp.steuxrtiartii;BacteriumstereartiiPhytomonaErwinia steuartii
anthomon
rtii：
panobacter steuxrtii;Bacillus ste-stearti.A
eudobacterium
分类地位：原核生物界（Procaryotae），薄壁菌门（Grag
菌属（Pantoea）。
4方法原理
wartii，Pseudomomassteuxrtii;Hcutes）肠杆菊科（Enterobacteriaceae），泛PCR方法的原理：提取细菌基因组DNA后，利用特异性引物，通PCR扩增得到特异性目的基因
片段，所得产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，依据检测结果判定是否是自的细菌。仪器设备
5.1小型粉碎机。
5.2恒温培养箱：30℃±1℃。
5.3高压灭菌锅。
5.4PCR扩增仪。
5.5PCR超净工作台。
5.6电泳仪。
核酸/蛋白分析仪。
凝胶成像系统。
台式冷冻离心机（最高转速15000r/min）。SN/T3756—2013
5.10电子天平（感量0.01g）。
5.11微量加样器（2.5μL、10μL、20μL、200μL、1000μL）。5.12无菌涂布棒。
5.13无菌培养皿：直径90mm
6试剂
实验用水（应符合GB/T6682中一级水的规格）。改良W氏培养基：见附录A中A.1。TaqDNA聚合酶。
6.4dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP。6.510×PCR缓冲液：100mmol/1.Tris-HCl(pH8.4),500mmol/LKCl,15mmol/LMgCle。0.01mol/1磷酸盐缓冲液（PBS）（pH值7.2）：见A.2。6.6
TE缓冲液（pH值8.0）：见A.3。6.8
细菌基因组DNA提取试剂盒
50×TAE缓冲液（pH值8.5）：见A.4。6.10
琼脂糖。
溴化乙锭。
DNA分子量标记：100bpDNAladder。7
PCR凝胶电泳检测
样品处理
从待检样品中挑选不成熟、皱缩、有穗轴及色泽较深的籽粒作为检验样品。每份检验样品应不少于0.25kg。待检样品在0.25kg以上、1kg以下的，检验样品可适当减少，但不得低于0.125kg。样品用0.1%升汞（HgCl)溶液表面消毒处理1min~2min，或3%~5%的次氯酸钠（NaOCI)表面消毒处理5min~15min，然后用无菌水冲洗3次，无菌条件下晾干。对于药剂拌种的样品，可用95%乙醇洗去表面药剂后，再用无菌水冲洗3次，无菌条件下晾干。消毒后的种子样品用粉碎机粉碎，称取20g，加人40mLPBS缓冲液（pH7.2）混勾，4℃过夜。7.2病菌分离
在无菌条件下取悬浊液1mL，用无菌生理盐水以十倍系列稀释法稀释到1：10000。取每个浓度的稀释液100μL于改良W氏培养基上，用灭菌L形玻璃棒均勾涂布于整个琼脂表面，共接种5～10个改良W氏培养基平板。将平板置于30℃土1℃培养48h～72h，观察菌落的出现情况。从中选取淡黄色或黄色的、稍隆起、油质状、边缘整齐、生长迅速，半透明且有较大黏性的菌落。将剩下的浸泡液收集起米放入灭菌的容器中，将其保存在4℃或放在冰上，当出现疑似结果时，以使进一步分离鉴定。对于有病症的样品，应该在浸泡后立即进行病菌分离试验。7.3模板DNA提取
收集具有7.2中典型特征的菌落，按照细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明书提取模板DNA，所提取的模板DNA溶于50μLTE中。剩余菌保存在4℃条件下，以备确证试验使用。DNA提取和纯化过程应设置核酸提取空白对照。2
-iiKAoNiKAca
7.4DNA质量检测
SN/T3756—2013
将提取的DNA用1.0%含溴化乙锭（或等效染料）的琼脂糖凝胶进行检测。然后用核酸/蛋白分析仪分别在260nm和280nm下测定OD值，用于PCR反应的DNA纯度一般为1.6≤OD260/OD280≤2.0。7.5PCR扩增
7.5.1引物序列
引物序列及扩增片段长度见表1。表1引物序列及扩增片段长度
PCR扩增
常规PCR
反应体系
引物来源
16S-23S
反应体系见表2。
试剂名称
10XPCR缓冲液（含Mg2+）
dNTP(2.5mmol/L)
TagDNA聚合酶（5U/μL）
正向引物和反向引物（25pmol/μL）DNA模板（50ng~200ng）
双蒸水
引物序列（5*-3\）
5°-GCGAAC TTGGCA GAGAT-32
5°-GCGCTTGCGTGTTATGAG-3
表2PCR反应体系
PCR反应体系
补至25μL
注1：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。注2：每个反应体系应设置两个平行反应。7.5.3反应条件
扩增片段大小bzxz.net
94℃预变性1min；94℃变性15s55℃退火158，72℃延伸30s，进行25个循环，72℃延伸使用不同PCR仪，可对参数作适当调整。5min。
7.5.4阴性对照、阳性对照和空白对照的设置阴性对照：非玉米细菌性枯萎病菌DNA为模板。阳性对照：已知玉米细菌性枯萎病菌的DNA或含有待测基因序列的质粒为模板。空白对照：设两个，一是提取DNA时设置的提取空白对照（以HzO代替样品）：二是PCR反应的空白对照（以水代替DNA模板）。3
-TrKAoNrKAca
SN/T3756—2013
7.5.5PCR扩增产物的电泳检测
用电泳缓冲液1×TAE制备1.5%琼脂糖凝胶（55℃～60℃时加入溴化乙锭或等效染料至终浓度为0.5μg/ml，也可在电泳后进行染色）。取5μLPCR扩增产物，和1μuL上样缓冲液混合，进行点样，用DNA分子量标记物做参照。1.5V/cm恒压电泳，电泳30min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。
8结果判定和报告
对照结果
阳性对照：出现920bp的扩增条带阴性对照：未出现特征条带：
空白对照：未出现特征条带。
8.2检测结果
8.2.1对照实验结果正常，待测样品未出现920bp扩增条带，则可判定该样品结果为阴性，报告未检出玉米细菌性枯萎病菌。
品出现920bp扩增条带，则可初步判8.2.2对照实验结果正常，待测样品定该样品结果为阳性，可依据
SN/T1375对该病菌进行进一步确认，最终结果以后者的检疫结果为准，报告检出（或未检出）玉米细菌性枯萎病菌。
8.2.3对照实验结果异常，本次待测样品的结果无效，应重新做实验，并排除污染因素。9样品的保存
按舱别层次、品种、等级分别存放；种用玉米米样品的保存应
保存样品应不少于1kg，船运
样品的保存按批号或品种分别存放保存样品经登记和经手人签字后置丁低温于爆、防虫防鼠处妥善
有样品室少要保存6个月，已备复验、谈判和仲裁。保存期满保存2个月。检出玉米细菌性枯萎病菌的后，需经灭菌处理。
TKAONiKAca
改良W氏培养基
A.1.1成分
蔗糖（C1H22Ou）
蛋白陈
磷酸氢二钾（K,HPO）
硫酸镁（MgSO.：7H.0)
抗坏血酸
蒸馏水
A.1.2制法
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂
将以上成分混合加热溶化，调节pH至7.2~7.4.120℃高压灭菌20min。A.20.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS)（pH7.2）A.2.1成分
氯化钠(NaCI）
氯化钾（KCI)
磷酸氢二钠（NazHPO,）
磷酸二氢钾（KH,PO,）
蒸馏水
A.2.2制法
SN/T3756—2013
将以上成分混合加热溶化，调节pH至7.2.用蒸馏水定容到1L，分装后121℃高压灭菌15min，保存于室温或4℃冰箱中。
3TE缓冲液（pH8.0）
A.3.1成分
1mol/LTris-盐酸(pH8.0)
500mmol/LEDTA(pH8.0)
蒸馏水
A.3.2制法
分装后121℃高压灭菌15min。
-rKNKca
SN/T3756—2013
50×TAE缓冲液（pH8.5）
2 mol/L Tris
100mmol/L的Na?EDTA·2HO
蒸馏水
A.4.2制法
充分搅拌溶解，加入57.1mL的醋酸，充分搅拌，用水定容到1L后，室温保存6
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