SN/T 3754-2013
基本信息
标准号： SN/T 3754-2013
中文名称：松干基褐腐病菌检疫鉴定方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3754-2013.Detection and identification of Phellinus weirii ( Murrill) R. L.Gilbertsons.
1范围
SN/T 3754规定了进出境针叶树中松干基褐腐病菌的分离培养及分子生物学鉴定等方法。
SN/T 3754适用于对来自松干基褐腐病发生国家和地区的苗木、原木、木制品(含木质包装、铺垫材料)等所有寄主植物中松干基褐腐病菌的检疫和鉴定。
2规范性引 用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T1157进出境植物苗木检疫规程
SN/T 1126进出境木材 检疫规程
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1刚毛状菌丝setal hyphae
在菌肉或菌髓中形态像菌丝,但明显比菌丝宽,且具有厚壁,顶端尖锐的结构。
3.2生殖菌丝generative hyphae
担子果中基本的菌丝类型。在刺革菌科( Hymenochaetaceae)种类中,生殖菌丝只形成简单分隔，不形成锁状联合,通常无色、浅黄色或浅黄褐色,薄壁或厚壁,分枝或很少分枝。
3.3囊状体cysttidium
囊状体生在担子间,它们的起源多数如同担子,分布在菌褶的整个表面,因为它着生位置不同,又给以不同名称。生在菌褶两侧的叫囊状体。
3.4次生菌丝secondary hyphae
次生菌丝是一种具有分枝状的菌丝，一般由担子菌中异性的初生菌丝进行体细胞接合而形成的菌丝。
1范围
SN/T 3754规定了进出境针叶树中松干基褐腐病菌的分离培养及分子生物学鉴定等方法。
SN/T 3754适用于对来自松干基褐腐病发生国家和地区的苗木、原木、木制品(含木质包装、铺垫材料)等所有寄主植物中松干基褐腐病菌的检疫和鉴定。
2规范性引 用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T1157进出境植物苗木检疫规程
SN/T 1126进出境木材 检疫规程
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1刚毛状菌丝setal hyphae
在菌肉或菌髓中形态像菌丝,但明显比菌丝宽,且具有厚壁,顶端尖锐的结构。
3.2生殖菌丝generative hyphae
担子果中基本的菌丝类型。在刺革菌科( Hymenochaetaceae)种类中,生殖菌丝只形成简单分隔，不形成锁状联合,通常无色、浅黄色或浅黄褐色,薄壁或厚壁,分枝或很少分枝。
3.3囊状体cysttidium
囊状体生在担子间,它们的起源多数如同担子,分布在菌褶的整个表面,因为它着生位置不同,又给以不同名称。生在菌褶两侧的叫囊状体。
3.4次生菌丝secondary hyphae
次生菌丝是一种具有分枝状的菌丝，一般由担子菌中异性的初生菌丝进行体细胞接合而形成的菌丝。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3754—2013
松干基褐腐病菌检疫鉴定方法
Detection and identification of Phellinus weirii(MurrilD)R.L.Gilbertsons2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T3754—2013
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国苏州出人境检验检疫局、中华人民共和国南京出入境检验检疫局、中华人民共和国湖北出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：吴举萍、焦彬彬、陈云芳、张勇、栗寒、李彬、杨静、王振华、安榆林。1范围
松于基褐腐病菌检疫鉴定方法
SN/T3754—2013
本标准规定了进出境针叶树中松干基褐腐病菌的分离培养及分子生物学鉴定等方法。本标准适用于对来自松干基褐腐病发生国家和地区的苗木、原木、木制品（含木质包装、铺垫材料）等所有寄主植物中松干基褐腐病菌的检疫和鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1157进出境植物苗木检疫规程SN/T1126进出境木材检疫规程
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
刚毛状菌丝setalhyphae
在菌肉或菌髓中形态像菌丝，但明显比菌丝宽，且具有厚壁，顶端尖锐的结构3.2
生殖菌丝generativehyphae
担子果中基本的菌丝类型。在刺革菌科（Hymenochaetaceae）种类中，生殖菌丝只形成简单分隔，不形成锁状联合，通常无色、浅黄色或浅黄褐色，薄壁或厚壁，分枝或很少分枝。3.3
囊状体
cysttidium
囊状体生在担子间，它们的起源多数如同担子，分布在菌褶的整个表面，因为它着生位置不同，又给以不同名称。生在菌褶两侧的叫囊状体。3.4
次生菌丝secondaryhyphae
次生菌丝是一种具有分枝状的菌丝，一般由担子菌中异性的初生菌丝进行体细胞接合而形成的菌丝。
4病菌基本信息
中文名：松干基褐腐病菌
学名：Phellinus weirii(Murrill)R.L.Gilbertsons异名：Inonotus teirii,Poria tveirii,Fomitiporia weirii分类地位：真菌界（Fungi），担子菌门（Basidiomycota），担子菌纲（Basidiomycetes），刺革菌1
SN/T3754—2013
（Hymenochaetales），刺革菌科（Hymenochaetaceae），木层孔菌属（Phellinus）。传播途径：该病菌主要通过原木、苗木、接穗以及各种无性繁殖材料进行远距离传播。该病原菌根据寄主的差异，分为花旗松型（theDouglasfirform）和雪松型（theredcedarform），两型的主要区别在于：花旗松型的了实体为一年生，在培养基上的颜色较浅，寄主范国包含了花旗松等在内的一些针叶树：雪松型的子实体为多年生，在培养基上的颜色较深，寄主范围窄，仅侵染雪松。两者的病原形态没有明显的区别。
5方法原理
根据松干基褐腐病菌在寄主上的症状特征针对病原菌进行分离与培养，根据病原菌DNA通用引物PCP-RFLP和特异性引物PCR检测结果进行综合判定6仪器设备和主要试剂
6.1仪器设备
PCR仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、生物培养箱、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、微量进样器、电热恒温水浴锅、电泳仪、凝胶成像系统。6.2用具
斧头、手持放大镜、灭菌培养血、镊子、手木剪、手术刀、酒梢灯、载玻片、盖玻片等。6.3主要试剂和培养基
PCR缓冲液、dNTPsCdATP
、TTP、dCTP、GTP)、TagDNA聚合酶、DNA提取试剂盒、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、引物（由生物试剂公司合成）7现场检疫
按SN/T1126、SN/T1157结合症状检查进行抽样。挑出可疑症状的样品（参见A.4)，送实验室作进一步检疫鉴定。
8实验室检疫
8.1病原菌的分离培养
将带病木段用自来水冲洗干净并用吸水纸吸干。用消毒的解部剖力片将表面部分去除，放人无菌的密封塑料袋内，袋内以无菌湿棉球保湿，置于22℃~27℃培养箱内12h光暗交替培养，每天取出于解部镜下观察，长出菌丝后将之分割成约3mm×3mm×6mm小块，置于PDA培养基平板上，每个培养皿放置5块，27℃黑暗培养。3d后开始观察。解剖镜下发现有白色菌丝长出，立即挑取菌落边缘菌丝，转人PDA中纯化培养。长满平板后，检查培养性状，在光学显微镜下观察菌落特征及进行PCR检测。
8.2子实体的观察
该病原菌在自然界和培养条件下均不易发现了实体。如果发现病菌了实体，仔细观察是否符合松2
-TTKAONKAca
于基褐腐病子实体的特征并进步做PCR检测8.3PCR检测
8.3.1通用引物PCR凝胶电泳及RFLP检测对经分离培养获得的菌株以及采集的子实体进行PCR扩增检测。通用引物PCR凝胶电泳见B.2。
通用引物PCR产物RFLP检测见B.3。8.3.2特异性引物PCR凝胶电泳检测SN/T3754—2013
对经分离培养获得的菌株以及来集的子实体进行特异性引物PCR凝胶电泳检测，见B.4。9鉴定特征
9.1病害危害症状
在林间立木上，可见被侵染的树表现为顶枝生长减慢，叶片变轻、脱落，球果会比正常的小，树逐渐死亡。多数腐烂的根折断聚集在根颈部周围，形成独特的球根。木质部被破坏，呈黄色、块状、纹孔状腐烂，愈伤组织在根的端部形成。在林间倒木或进境的寄主植物上病原危害症状参见A.4，9.2形态特征
9.2.1无性特征
该病菌在PDA培养基上生长良好
生长温度为21℃-
，平板在1周内覆盖。菌落前缘
菌丝气生至平伏，初始白色至亮淡黄色，渐渐转为黄褐色至褐色（参见附录A中的图A.3）。9.2.2有性特征
菌丝透明到褐色，不产生锁状联合担孢抱子球形或椭圆形·无色，薄壁，（3.6um~4.5um）×（2.7μm~3.5μm）。担子近棍棒状，大小为（10m
（13μm~15μm）×（3.5μm~5μm）。刚毛状菌丝明显量，厚壁并具有
6um）。囊状体棍棒状，大小为
狭内腔，宽5μm~10μm。次
生殖菌丝很少分枝，常见隔膜，宽3μm6μm（参见3um5μm.
生菌丝丰富，无色，薄壁，常分枝，宽图A.4)。
10结果判定
表型症状与9.1描述基本一致，在8.1、8.2的检测中结果与9.2.1、9.2.2吻合，可初步判定该样品可能携带松干基褐腐病，但需通过8.3进一步确认。在8.3.1的检测中，若PCR产物凝胶电泳检测结果为阳性，RFLP的分析片段大小与描述相符，并且样品DNA经8.3.2方法扩增后PCR产物凝胶电泳检测结果为阳性，则可以确定该样品携带雪松型松干基褐腐病菌。
在8.3.1的检测中，若PCR产物凝胶电泳检测结果为阳性，而且RFLP的分析片段大小与描述相符，且PCR产物的序列与Genebank中Phellinusweiri的花旗松型基因组序列一致，则可以判定为该样品携带花旗松型松干基褐腐病菌。3
-TTKAONTKAca
SN/T3754-—2013
11样品保存与处理
样品经登记和经手人签字后要善保存。对检出松干基褐腐病菌的样品应保存于4C冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。12
菌株保存与处理
分离并最终鉴定为松干基褐腐病菌的菌株应转入PDA培养基斜面上，存活后经登记和经手人签字，置于4℃～8℃黑暗条件下保存，以备复核。样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。实验记录与保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测应有电泳结果照片。-TTKAoNiKAca
A1名称
中文名称：松干基褐腐病菌
英文名称：laminatedrootrot
A.2寄主范围
附录A
（资料性附录）
松干基褐腐病菌其他相关信息
北美地区已报道的松干基褐腐病的寄主：SN/T3754—2013
花旗松型主要寄主：花旗松（Pseudotsugamenziesii）（主要寄主）、太平洋冷杉（Ahiesamabilis）北美冷杉（A.grandis）、洛杉矶冷杉（A.lasiocarpa）、西部落叶松（Lariaoccidentalis），阿拉斯加云杉（Piceasitchensis）、小干松（Pinuscontorta）、西部白松（P.monticola）、黄松（P.ponderosa）、异叶铁杉（Tsugaheterophylla）大果铁杉（T.mertensiana）。雪松型主要寄主：红雪松（美国红侧柏、北美香柏）（Thujaplicate）。除上述寄主外，在日本还发现松十基褐腐病菌间以侵染以下寄主：马氏冷杉（A.mariesii）、库页冷杉（A.sachalinensis）、美国扁柏（Chamaecyparissp.）、鱼鳞云杉（Piceajezoensis），异叶铁杉（T.diversifolia）。A.3分布
北美洲：加拿大（BC省南部花旗松分布地区）、美国西北部（阿拉斯加州、加利福尼亚州、爱达荷州、蒙大拿州、俄勒冈州、华盛顿州、威斯康星州）。亚洲：日本（本州、北海道中部）、中国（吉林）。A,4病原为害症状及形态特征
该病菌能够为害幼树和成年树，病原菌主要通过根部侵染。病原菌与根部接触后，菌丝首先在表皮外生长，伸人土壤内1cm~5cm。然后通过树皮到达木质部，在木质部内扩展，造成木质部腐烂。被侵染的树表现为顶枝生长减慢，球果会比正常的小，叶片发黄或发红，脱落，树逐渐死亡。多数腐烂的根折断，聚集在根颈部周围，形成独特的“球根”被侵染的外部心材在刚开始腐烂时为新月形至球形，红褐色，病斑可扩展到树干通常可达2m～4m。受害原木的基部横切面变色，病症常沿年轮呈环状、新月状或不规则状（图A.1中图片A、B)，纵切面呈条纹状分布（图A.1中图片C）。发病较轻的寄主木质部为浅棕褐色或棕褐色（图A.1中图片A、B），发病严重的寄主干基部的木质部横切面上沿年轮分离呈片层状（图A.1中图片D、E）。变色部位常常出现蜂窝状小孔（图A.1中图片F)。利用手持显微镜观察到在片状腐朽层之间常形成棕褐色的刚毛菌丝（长度一般为3mm，直径5μm~10μm，细胞壁115m~215um）是该病菌最典型的症状（图A.2中图片A、B）。该病菌的子实体，薄，新鲜时如皮革质，干后较脆，呈黄色至肉佳色，表面有小孔（图A.2中图片B)；但在受侵染的寄主上子实体并不容易被观察到。5
-riikAoNirkAca
SN/T3754—2013
病原菌在培养基上一般很难产生子实体，也不形成刚毛状菌丝，营养菌丝体发达呈絮状（图A.3）。病原菌有性阶段子实体仅在寄主上产生，其显微特征见图A.4。说明：
A.B—受害原木基部横切面：
一受害原木纵切面：
一受害严重的寄主木质部呈片层状腐烂；D、E
色部位蜂窝状小孔
注：图片来源：ThiesandSturrock，l995，http：//foretryimages.org/
图A.1松干基褐腐病菌（Phellinusweirii）侵染引起的典型症状-TTKAONTKAca
说明：
一松干基褐腐病原菌（Phelinusueirz）刚毛菌丝：A图的局部放大：
松干基褐腐病原菌（Phellinusweiri）子实体。注：图片来源：ThiesandSturrock，1995.http：//forestryimages.org/图A.2松干基褐腐病原菌（Phellinusweirii）形态注：PDA上黑暗培养7d。
图A.3松干基褐腐病菌（Phellinusweiri）的培养性状SN/T3754—2013
SN/T3754—2013
说明：
担孢子，
一担子，
囊状体：
刚毛状菌丝；
次生菌丝：
生殖菌丝。
注，DaiYC,2010。
QQ0Q00o
图A.4松干基褐腐病菌（Phellinusweiri）子实体显微结构B.1
DNA提取
（规范性附录）
PCR检测
SN/T3754—2013
子实体及菌丝DNA提取可选择商业DNA提取试剂盒，提取的DNA在一80的条件下保存。B.2
通用引物扩增
通用引物序列
LROR:5'-ACCCGCTGAACTTAAGC-3
LR3:5-CCGTGTTTCAAGACGGG-3*
PCR反应体系及参数
PCR反应体系
PCR反应体系见表B,1。
表B.1PCR反应体系
试剂名称
10×PCR缓冲液
上游引物
下游引物
TagDNA聚合酶（Takara）
DNA模板
补ddH0至25μL
阴性对照、阳性对照和空白对照的设置阴性对照：健康的木块的DNA模板，阳性对照：松干基褐腐病菌菌丝的DNA模板。PCR反应的空白对照：ddH，O。
PCR反应参数
2.5mmol/L
0.1mmol/L
终浓度
0.5μmmol/L~1.0μmmol/L
0.5μmmol/L~1.0gmmol/l
1.25U~2.5U
1.0μg~3.0μgbzxz.net
94℃/2min；94℃/1min，60℃/30s，72℃/3min，35个循环72℃/4min。注：不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整B.2.4琼脂凝胶电泳
用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳，EB染色，凝胶成像系统观察、拍照。9
SN/T3754—2013
B.3RFLP分析
反应体系
RFIP酶切反应体系见表B.2。
试剂名称
10XPCR缓冲液
限制性内切酶（AgeINciT）
PCR产物
补ddH0至20μ
反应参数
37℃温育，至少2h或过夜
琼脂凝胶电泳
电泳同B.2.4，琼脂糖凝胶浓度改特异性引物扩增
特异性引物序列
表B.2RFLP酶切反应体系
PW164:5-GCTTCCATTTTTCI
PW659.5-TCAAAAGGGCGTATTAATC
B.4.2PCR反应体系及参数
同B.2.2，
琼脂凝胶电泳
同B.2.4。
结果判断
终浓度
B.5.1在B.3.3的检测中，若PCR产物凝胶电泳检测结果为阳性，大小为661bp;AgeI酶切PCR产物后的片段为175bp和468bp:NeiT酶切PCR产物后的片段为71bp、218bp、372bp，可初步判定该样品携带雪松型松干基褐腐病菌。并且样品经B.4扩增后PCR产物凝胶电泳检测结果为阳性，大小为495bp，则可以确定该样品携带雪松型松干基褐腐病菌。B.5.2在B.3.3的检测中，若PCR产物凝胶电泳检测结果为661bp:AgeI不能对PCR产物进行剪切；Nci酶切PCR产物后的片段为71bP和590bp。可初步判定该样品携带花旗松型松干基褐腐病。进一步肯定需通过对大小约为661bp的PCR产物进行测序比对，若得到的序列与Genebank中Phell-inusueirii的花旗松型基因组序列一致，则可以确定为该样品携带花旗松型松干基褐腐病菌。10
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松干基褐腐病菌检疫鉴定方法
Detection and identification of Phellinus weirii(MurrilD)R.L.Gilbertsons2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T3754—2013
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国苏州出人境检验检疫局、中华人民共和国南京出入境检验检疫局、中华人民共和国湖北出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：吴举萍、焦彬彬、陈云芳、张勇、栗寒、李彬、杨静、王振华、安榆林。1范围
松于基褐腐病菌检疫鉴定方法
SN/T3754—2013
本标准规定了进出境针叶树中松干基褐腐病菌的分离培养及分子生物学鉴定等方法。本标准适用于对来自松干基褐腐病发生国家和地区的苗木、原木、木制品（含木质包装、铺垫材料）等所有寄主植物中松干基褐腐病菌的检疫和鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1157进出境植物苗木检疫规程SN/T1126进出境木材检疫规程
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
刚毛状菌丝setalhyphae
在菌肉或菌髓中形态像菌丝，但明显比菌丝宽，且具有厚壁，顶端尖锐的结构3.2
生殖菌丝generativehyphae
担子果中基本的菌丝类型。在刺革菌科（Hymenochaetaceae）种类中，生殖菌丝只形成简单分隔，不形成锁状联合，通常无色、浅黄色或浅黄褐色，薄壁或厚壁，分枝或很少分枝。3.3
囊状体
cysttidium
囊状体生在担子间，它们的起源多数如同担子，分布在菌褶的整个表面，因为它着生位置不同，又给以不同名称。生在菌褶两侧的叫囊状体。3.4
次生菌丝secondaryhyphae
次生菌丝是一种具有分枝状的菌丝，一般由担子菌中异性的初生菌丝进行体细胞接合而形成的菌丝。
4病菌基本信息
中文名：松干基褐腐病菌
学名：Phellinus weirii(Murrill)R.L.Gilbertsons异名：Inonotus teirii,Poria tveirii,Fomitiporia weirii分类地位：真菌界（Fungi），担子菌门（Basidiomycota），担子菌纲（Basidiomycetes），刺革菌1
SN/T3754—2013
（Hymenochaetales），刺革菌科（Hymenochaetaceae），木层孔菌属（Phellinus）。传播途径：该病菌主要通过原木、苗木、接穗以及各种无性繁殖材料进行远距离传播。该病原菌根据寄主的差异，分为花旗松型（theDouglasfirform）和雪松型（theredcedarform），两型的主要区别在于：花旗松型的了实体为一年生，在培养基上的颜色较浅，寄主范国包含了花旗松等在内的一些针叶树：雪松型的子实体为多年生，在培养基上的颜色较深，寄主范围窄，仅侵染雪松。两者的病原形态没有明显的区别。
5方法原理
根据松干基褐腐病菌在寄主上的症状特征针对病原菌进行分离与培养，根据病原菌DNA通用引物PCP-RFLP和特异性引物PCR检测结果进行综合判定6仪器设备和主要试剂
6.1仪器设备
PCR仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、生物培养箱、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、微量进样器、电热恒温水浴锅、电泳仪、凝胶成像系统。6.2用具
斧头、手持放大镜、灭菌培养血、镊子、手木剪、手术刀、酒梢灯、载玻片、盖玻片等。6.3主要试剂和培养基
PCR缓冲液、dNTPsCdATP
、TTP、dCTP、GTP)、TagDNA聚合酶、DNA提取试剂盒、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、引物（由生物试剂公司合成）7现场检疫
按SN/T1126、SN/T1157结合症状检查进行抽样。挑出可疑症状的样品（参见A.4)，送实验室作进一步检疫鉴定。
8实验室检疫
8.1病原菌的分离培养
将带病木段用自来水冲洗干净并用吸水纸吸干。用消毒的解部剖力片将表面部分去除，放人无菌的密封塑料袋内，袋内以无菌湿棉球保湿，置于22℃~27℃培养箱内12h光暗交替培养，每天取出于解部镜下观察，长出菌丝后将之分割成约3mm×3mm×6mm小块，置于PDA培养基平板上，每个培养皿放置5块，27℃黑暗培养。3d后开始观察。解剖镜下发现有白色菌丝长出，立即挑取菌落边缘菌丝，转人PDA中纯化培养。长满平板后，检查培养性状，在光学显微镜下观察菌落特征及进行PCR检测。
8.2子实体的观察
该病原菌在自然界和培养条件下均不易发现了实体。如果发现病菌了实体，仔细观察是否符合松2
-TTKAONKAca
于基褐腐病子实体的特征并进步做PCR检测8.3PCR检测
8.3.1通用引物PCR凝胶电泳及RFLP检测对经分离培养获得的菌株以及采集的子实体进行PCR扩增检测。通用引物PCR凝胶电泳见B.2。
通用引物PCR产物RFLP检测见B.3。8.3.2特异性引物PCR凝胶电泳检测SN/T3754—2013
对经分离培养获得的菌株以及来集的子实体进行特异性引物PCR凝胶电泳检测，见B.4。9鉴定特征
9.1病害危害症状
在林间立木上，可见被侵染的树表现为顶枝生长减慢，叶片变轻、脱落，球果会比正常的小，树逐渐死亡。多数腐烂的根折断聚集在根颈部周围，形成独特的球根。木质部被破坏，呈黄色、块状、纹孔状腐烂，愈伤组织在根的端部形成。在林间倒木或进境的寄主植物上病原危害症状参见A.4，9.2形态特征
9.2.1无性特征
该病菌在PDA培养基上生长良好
生长温度为21℃-
，平板在1周内覆盖。菌落前缘
菌丝气生至平伏，初始白色至亮淡黄色，渐渐转为黄褐色至褐色（参见附录A中的图A.3）。9.2.2有性特征
菌丝透明到褐色，不产生锁状联合担孢抱子球形或椭圆形·无色，薄壁，（3.6um~4.5um）×（2.7μm~3.5μm）。担子近棍棒状，大小为（10m
（13μm~15μm）×（3.5μm~5μm）。刚毛状菌丝明显量，厚壁并具有
6um）。囊状体棍棒状，大小为
狭内腔，宽5μm~10μm。次
生殖菌丝很少分枝，常见隔膜，宽3μm6μm（参见3um5μm.
生菌丝丰富，无色，薄壁，常分枝，宽图A.4)。
10结果判定
表型症状与9.1描述基本一致，在8.1、8.2的检测中结果与9.2.1、9.2.2吻合，可初步判定该样品可能携带松干基褐腐病，但需通过8.3进一步确认。在8.3.1的检测中，若PCR产物凝胶电泳检测结果为阳性，RFLP的分析片段大小与描述相符，并且样品DNA经8.3.2方法扩增后PCR产物凝胶电泳检测结果为阳性，则可以确定该样品携带雪松型松干基褐腐病菌。
在8.3.1的检测中，若PCR产物凝胶电泳检测结果为阳性，而且RFLP的分析片段大小与描述相符，且PCR产物的序列与Genebank中Phellinusweiri的花旗松型基因组序列一致，则可以判定为该样品携带花旗松型松干基褐腐病菌。3
-TTKAONTKAca
SN/T3754-—2013
11样品保存与处理
样品经登记和经手人签字后要善保存。对检出松干基褐腐病菌的样品应保存于4C冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。12
菌株保存与处理
分离并最终鉴定为松干基褐腐病菌的菌株应转入PDA培养基斜面上，存活后经登记和经手人签字，置于4℃～8℃黑暗条件下保存，以备复核。样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。实验记录与保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测应有电泳结果照片。-TTKAoNiKAca
A1名称
中文名称：松干基褐腐病菌
英文名称：laminatedrootrot
A.2寄主范围
附录A
（资料性附录）
松干基褐腐病菌其他相关信息
北美地区已报道的松干基褐腐病的寄主：SN/T3754—2013
花旗松型主要寄主：花旗松（Pseudotsugamenziesii）（主要寄主）、太平洋冷杉（Ahiesamabilis）北美冷杉（A.grandis）、洛杉矶冷杉（A.lasiocarpa）、西部落叶松（Lariaoccidentalis），阿拉斯加云杉（Piceasitchensis）、小干松（Pinuscontorta）、西部白松（P.monticola）、黄松（P.ponderosa）、异叶铁杉（Tsugaheterophylla）大果铁杉（T.mertensiana）。雪松型主要寄主：红雪松（美国红侧柏、北美香柏）（Thujaplicate）。除上述寄主外，在日本还发现松十基褐腐病菌间以侵染以下寄主：马氏冷杉（A.mariesii）、库页冷杉（A.sachalinensis）、美国扁柏（Chamaecyparissp.）、鱼鳞云杉（Piceajezoensis），异叶铁杉（T.diversifolia）。A.3分布
北美洲：加拿大（BC省南部花旗松分布地区）、美国西北部（阿拉斯加州、加利福尼亚州、爱达荷州、蒙大拿州、俄勒冈州、华盛顿州、威斯康星州）。亚洲：日本（本州、北海道中部）、中国（吉林）。A,4病原为害症状及形态特征
该病菌能够为害幼树和成年树，病原菌主要通过根部侵染。病原菌与根部接触后，菌丝首先在表皮外生长，伸人土壤内1cm~5cm。然后通过树皮到达木质部，在木质部内扩展，造成木质部腐烂。被侵染的树表现为顶枝生长减慢，球果会比正常的小，叶片发黄或发红，脱落，树逐渐死亡。多数腐烂的根折断，聚集在根颈部周围，形成独特的“球根”被侵染的外部心材在刚开始腐烂时为新月形至球形，红褐色，病斑可扩展到树干通常可达2m～4m。受害原木的基部横切面变色，病症常沿年轮呈环状、新月状或不规则状（图A.1中图片A、B)，纵切面呈条纹状分布（图A.1中图片C）。发病较轻的寄主木质部为浅棕褐色或棕褐色（图A.1中图片A、B），发病严重的寄主干基部的木质部横切面上沿年轮分离呈片层状（图A.1中图片D、E）。变色部位常常出现蜂窝状小孔（图A.1中图片F)。利用手持显微镜观察到在片状腐朽层之间常形成棕褐色的刚毛菌丝（长度一般为3mm，直径5μm~10μm，细胞壁115m~215um）是该病菌最典型的症状（图A.2中图片A、B）。该病菌的子实体，薄，新鲜时如皮革质，干后较脆，呈黄色至肉佳色，表面有小孔（图A.2中图片B)；但在受侵染的寄主上子实体并不容易被观察到。5
-riikAoNirkAca
SN/T3754—2013
病原菌在培养基上一般很难产生子实体，也不形成刚毛状菌丝，营养菌丝体发达呈絮状（图A.3）。病原菌有性阶段子实体仅在寄主上产生，其显微特征见图A.4。说明：
A.B—受害原木基部横切面：
一受害原木纵切面：
一受害严重的寄主木质部呈片层状腐烂；D、E
色部位蜂窝状小孔
注：图片来源：ThiesandSturrock，l995，http：//foretryimages.org/
图A.1松干基褐腐病菌（Phellinusweirii）侵染引起的典型症状-TTKAONTKAca
说明：
一松干基褐腐病原菌（Phelinusueirz）刚毛菌丝：A图的局部放大：
松干基褐腐病原菌（Phellinusweiri）子实体。注：图片来源：ThiesandSturrock，1995.http：//forestryimages.org/图A.2松干基褐腐病原菌（Phellinusweirii）形态注：PDA上黑暗培养7d。
图A.3松干基褐腐病菌（Phellinusweiri）的培养性状SN/T3754—2013
SN/T3754—2013
说明：
担孢子，
一担子，
囊状体：
刚毛状菌丝；
次生菌丝：
生殖菌丝。
注，DaiYC,2010。
QQ0Q00o
图A.4松干基褐腐病菌（Phellinusweiri）子实体显微结构B.1
DNA提取
（规范性附录）
PCR检测
SN/T3754—2013
子实体及菌丝DNA提取可选择商业DNA提取试剂盒，提取的DNA在一80的条件下保存。B.2
通用引物扩增
通用引物序列
LROR:5'-ACCCGCTGAACTTAAGC-3
LR3:5-CCGTGTTTCAAGACGGG-3*
PCR反应体系及参数
PCR反应体系
PCR反应体系见表B,1。
表B.1PCR反应体系
试剂名称
10×PCR缓冲液
上游引物
下游引物
TagDNA聚合酶（Takara）
DNA模板
补ddH0至25μL
阴性对照、阳性对照和空白对照的设置阴性对照：健康的木块的DNA模板，阳性对照：松干基褐腐病菌菌丝的DNA模板。PCR反应的空白对照：ddH，O。
PCR反应参数
2.5mmol/L
0.1mmol/L
终浓度
0.5μmmol/L~1.0μmmol/L
0.5μmmol/L~1.0gmmol/l
1.25U~2.5U
1.0μg~3.0μgbzxz.net
94℃/2min；94℃/1min，60℃/30s，72℃/3min，35个循环72℃/4min。注：不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整B.2.4琼脂凝胶电泳
用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳，EB染色，凝胶成像系统观察、拍照。9
SN/T3754—2013
B.3RFLP分析
反应体系
RFIP酶切反应体系见表B.2。
试剂名称
10XPCR缓冲液
限制性内切酶（AgeINciT）
PCR产物
补ddH0至20μ
反应参数
37℃温育，至少2h或过夜
琼脂凝胶电泳
电泳同B.2.4，琼脂糖凝胶浓度改特异性引物扩增
特异性引物序列
表B.2RFLP酶切反应体系
PW164:5-GCTTCCATTTTTCI
PW659.5-TCAAAAGGGCGTATTAATC
B.4.2PCR反应体系及参数
同B.2.2，
琼脂凝胶电泳
同B.2.4。
结果判断
终浓度
B.5.1在B.3.3的检测中，若PCR产物凝胶电泳检测结果为阳性，大小为661bp;AgeI酶切PCR产物后的片段为175bp和468bp:NeiT酶切PCR产物后的片段为71bp、218bp、372bp，可初步判定该样品携带雪松型松干基褐腐病菌。并且样品经B.4扩增后PCR产物凝胶电泳检测结果为阳性，大小为495bp，则可以确定该样品携带雪松型松干基褐腐病菌。B.5.2在B.3.3的检测中，若PCR产物凝胶电泳检测结果为661bp:AgeI不能对PCR产物进行剪切；Nci酶切PCR产物后的片段为71bP和590bp。可初步判定该样品携带花旗松型松干基褐腐病。进一步肯定需通过对大小约为661bp的PCR产物进行测序比对，若得到的序列与Genebank中Phell-inusueirii的花旗松型基因组序列一致，则可以确定为该样品携带花旗松型松干基褐腐病菌。10
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