SN/T 3752-2013
基本信息
标准号： SN/T 3752-2013
中文名称：苹果星裂壳孢果腐病菌检疫鉴定方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3752-2013.Detection and identification of Phacidiopycnis washingtonensis Xiao & J.D Rogers.
1范围
SN/T 3752规定了植物检疫中苹果星裂壳孢果腐病菌的检疫鉴定方法。
SN/T 3752适用于进境苹果和梨植株及其果实中苹果星裂壳孢果腐病菌的检疫鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T2455进出境水果检验检疫规程
3检疫鉴定原理
苹果星裂壳孢果腐病菌在寄主上的症状病菌形态学特征与培养性状及分子生物学特征是制定本标准的主要依据。该病菌的分类地位、寄主范围、分布和为害症状等背景资料参见附录A.
4仪器及用具
4.1 仪器
体视显微镜、生物显微镜、超净工作台，高压灭菌器、生物培养箱、台式高速离心机、PCR扩增仪、凝胶成像仪、电子天平(感量0.01g)、水浴箱、pH计。
4.2 用具
样品袋、标签、放大镜、镊子、解剖力酒精灯、接种针、培养皿(直径9 cm)、烧杯、三角瓶、试管、量筒、载玻片、盖玻片、研钵及研杵、微量移液器(可调式范围:2.5 L 1000 μL)、离心管。
5试剂和培养基
5.1 试剂
1% NaCIO溶液、无水乙醇、70%乙醇、无菌双蒸水、2% CTAB提取缓冲液、10%SDS溶液、3 mol/L醋酸钠溶液、PCR试剂(包括Taq聚合酶、dNTP、Buffer)、苯酚、三氯甲烷、异戊醇、Tris-HCl、EDTA、琼脂糖、DNA分子量标准、TBE电泳缓冲液。
1范围
SN/T 3752规定了植物检疫中苹果星裂壳孢果腐病菌的检疫鉴定方法。
SN/T 3752适用于进境苹果和梨植株及其果实中苹果星裂壳孢果腐病菌的检疫鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T2455进出境水果检验检疫规程
3检疫鉴定原理
苹果星裂壳孢果腐病菌在寄主上的症状病菌形态学特征与培养性状及分子生物学特征是制定本标准的主要依据。该病菌的分类地位、寄主范围、分布和为害症状等背景资料参见附录A.
4仪器及用具
4.1 仪器
体视显微镜、生物显微镜、超净工作台，高压灭菌器、生物培养箱、台式高速离心机、PCR扩增仪、凝胶成像仪、电子天平(感量0.01g)、水浴箱、pH计。
4.2 用具
样品袋、标签、放大镜、镊子、解剖力酒精灯、接种针、培养皿(直径9 cm)、烧杯、三角瓶、试管、量筒、载玻片、盖玻片、研钵及研杵、微量移液器(可调式范围:2.5 L 1000 μL)、离心管。
5试剂和培养基
5.1 试剂
1% NaCIO溶液、无水乙醇、70%乙醇、无菌双蒸水、2% CTAB提取缓冲液、10%SDS溶液、3 mol/L醋酸钠溶液、PCR试剂(包括Taq聚合酶、dNTP、Buffer)、苯酚、三氯甲烷、异戊醇、Tris-HCl、EDTA、琼脂糖、DNA分子量标准、TBE电泳缓冲液。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3752--2013
苹果星裂壳孢果腐病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Phacidiopycnis washingtonensis Xiao & J.D Rogers2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民其和国广东出人境检验检疫局本标准主要起草人：工卫芳、冯黎霞、胡佳、章性、华丽，SN/T3752—2013
1范围
苹果星裂壳孢果腐病菌检疫鉴定方法本标准规定了植物检疫中苹果星裂壳孢果腐病菌的检疫鉴定方法。SN/T3752—2013
本标准适用于进境苹果和梨植株及其果实中苹果星裂壳孢果腐病菌的检疫鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2455进出境水果检验检疫规程3检疫鉴定原理
苹果星裂壳孢果腐病菌在寄主上的症状、病菌形态学特征与培养性状及分子生物学特征是制定本标准的主要依据。该病菌的分类地位，寄主范围、分布和为害症状等背景资料参见附录A。4仪器及用具
4.1仪器
高压灭菌器、生物培养箱、台式高速离心机、PCR扩增仪、凝体视显微镜、生物显微镜、超净工作台胶成像仪、电子天平（感量0.01g）、水浴箱2用具
酒精灯、接种针、培养血（直径9cm）、烧杯、三角瓶、试管、量样品袋、标签、放大镜、镊子、解剖力筒、载玻片、盖玻片、研钵及研杆、微量移液器（可调式范围：2.5-1000μL)、离心管。5试剂和培养基
5.1试剂
1%NaC1O溶液、无水乙醇、70%乙醇、无菌双蒸水、2%CTAB提取缓冲液、10%SDS溶液、3mol/1醋酸钠溶液、PCR试剂（包括Taq聚合酶、dNTP、Buffer）、苯酚、三氯甲烷、异戊醇，Tris-HCl、EDTA，琼脂糖、DNA分子量标准、TBE电泳缓冲液。5.2培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：每1000mLPDA山200g去皮马铃薯，20g葡萄糖，18g琼脂配制而成。
酸性马铃薯葡萄糖琼脂培养基（APDA)：每1000mLPDA中加人4.0mL25%乳酸。1
SN/T 3752—2013
6检疫鉴定方法
6.1口岸现场查验
6.1.1抽样
口岸现场查验时，按照S.N/T2455进行抽样与取样。6.1.2枝条症状检查
观察嫩枝项梢是否死，树皮是否下枯，病部是否有突起细小的黑色颗粒状分生孢子器及乳黄色分生拖了闭等病征(症状特点参见附录 A、 B.1 图片 10-~11)。6.1.3果实症状检查
仔细检查果梗叫部，萼凹部是否腐烂，病质地及顏色，病部是否有突起细小的黑色颗粒状分生孢子器及乳黄色分生孢子幽等病征（症状特点参见附录A.图L.1图片19)。将可疑技条利果实样品带回实验室作进一步检验，记录样品品种、数量、来源国及取样地点、取样人和取样日期等信息，
6.2实验鉴定
6.2.1直接检验
观察记录病,果的外观及剖面症状特点，将有明显病征的病技与病果置丁休视显微镜下检查，挑取病部黑色粒状分生弛广器制成玻片，置丁生物显微镜下镜检。6,2.2保湿培养
如病枝或病果上只有可疑病状而无明显病征，则将病枝（截成5cm）或病果置于样品袋中，丁20℃下保湿培养.观察症状的变化。
6.2.3分离培养
直接挑取病部的分生孢子器或分牛孢子团，肾于APDA平板上*或采用组织分离培养法，用1%NaCIO溶液或70%乙醇对果实表面喷雾消毒，风干后用消毒过的刀片切取病健交界处果肉组织，切成5mm×5mm小块后放置于APDA4.在20℃、黑暗下培养7d～14d，定期观察，将菌落边缘菌丝体置于新鲜的APDA平板.上进行纯化，以便用十后续的形态学和分子生物学鉴定。6.2.4病菌形态特征和培养性状观察显微镜检分生孢子器及分生孢的形态特征，产孢方式。，在20℃，黑暗条作下，观察记录菌落的生长速度、色变化、分生孢了器及分生孢子团的形成情况。6.2.5分子生物学鉴定
6.2.5.1 INA 提取
采用附录C中的CTAB法提取病菌基因LINA。6.2.5.2PCR 检测及 ITS基因分析采用C.I、C,2扩增检测病菌基因组DNA中的ITS基因，测序后采用C,3进行I3I.AST与系统发有2
-TTKAONT KAca
分析。
7聋定特征
7.1病菌形态
SN/T 3752--2013
在寄土果实上分生孢子器半理生或儿乎表生，业球形，稍扇平，暗黑色，直径约0.3mm～0.8m，单腔室或多腔室，并口单个或几个，呈小孔状或不规则孔穴：产抱方式为瓶梗式内壁芽生或合轴式全壁芽生，分生孢子无色透明，单胞，派滴形。一端平截，或卵形牟懒圆形，无胞痕，光滑，油球2个。人小为：在裁培苹果(Muts dumrstica)上[(4.5~-)6-~7.5(-~9)_ μm×[2-~4(~-5)] μm. 均 7 μm×3.5 μm;在PDA上[（5~）6～7.5（~8）-μm×_3~4（~4.5)μm，半均7μm×3.5μm在欧洲森林苹果（Msylestris）上的大小为[(4.5~）6~7(~7.5）μm×(2~4）μm，平均6m×3μm(参见图B.2图片1~10)。7.2菌落特征
在2C、黑暗培养条件下，菌萍在PDA平板上呈圆形、平铺，气生菌丝盛、绒毛状，边缘不整齐，呆裂瓣状。菌落初为纯白色（培养3d），菌丝体老熟后逐渐由白色变为鼠灰色、灰黑色，最终变为黑色。培养了d后菌落中部呈鼠灰色至灰黑色，培养10d后菌落形成深浅色交替的菌丝环带，蘭落背面从中部至边缘依次呈黑、灰黑、灰、广色共4个环带。分生孢子器成熟速度较快且产孢丰富，培养至7d即涌出大量分生孢子，在菌落表面难集成团，黏调状、乳白色至乳黄色，培养14d后分生孢团则布满整个菌落（参见图B.2图片11~-12）。7.3ITS序列特征
PCR扩增产物序列测定大小为513bp，EI.AST分析表明病菌与GcnBank\已知的苹果星裂壳孢果腐病菌的ITSI-3.8SrRNA-ITS2全序列AY6C8643、AY608611.AY608645.AY608646、AY608647、AY608618的同源性均为100%，在系统发育树上：与苹果星裂壳孢果腐病菌案在同一簇，支持度为100%，而与该病菌的近似种梨波氏盘果腐病菌（态见附录I)相邻，但不聚在同一簇。8结果判定
符合下列任一种情况均可判定为检出苹果星裂壳孢果腐病菌：如果病部有明显的病状和病征，病菌形态学特征与鉴定指标7.1吻介，而与该病菌的近似种波氏盘果腐病菌的形态特征（附录D)不吻合；扩增得到的ITS序列在系统发育树1.与苹果星裂壳孢果腐病菌聚在同一簇，支持度为100%。如果病部有病状但无病征，经保湿培养和/或分离培养所产生的病菌形态学特征及培养性状与鉴定指标7.1~～7.2吻合，而与该病菌的近似种梨波氏盘果膚病菌的形态特征（附录D)不晰合，并1扩增得到的ITS基匹在系统发育树上与苹果星裂壳孢果腐病菌聚在同簇，支持度为100%。9样品和资料的保存
9.1萄种和DNA样品的保存
菌株在含30%甘油的冻存管中于一80℃保存，或将菌株转接在PDA斜面上培养，待菌丝体长满斜面后，置于4℃下保存，并定期（180d)转管，标注分离物来源、寄主、分离时间和鉴定人；病菌基因红DNA样品于一20℃下保存。
-iiKAoNiKAca
SN/T3752-2013
检验资料的保存
妥善保存检验报告包括症状、病菌、电泳图谱饰图义资料，以备复验、谈判和仲裁。检验报告应注明检验日期、万法，结巢等，并有检验人签名。4
-TTKAONKAca
A.1分类地位
附录A
（资料性附录）
苹果星裂壳孢果腐病菌的分类地位、寄主范围、分布和为害症状英文名：speckrotonapple:Phacidiopycnisrotonapple学名：Phacidiopyenis washingtonensisXiao&JDRogers 2005SN/T3752—2013
在分类上隶属于半知菌亚门（Deuteromycotina），腔孢纲（Coelomycetes），球壳孢目（Sphaeropsidales），球壳孢科（Sphaeropsidaceae），星裂壳孢属（Phacidiopycnis）。A.2寄主范围
普薇科（Rosaccac）：苹果属（Malus）、梨属（Pyrus）温属（Cydonia）等果树欧洲栽培苹果（M.domestica）及欧洲森林苹果（M.svluestris）和西洋梨（P.communis）等三个种均可被害。受害的欧洲栽培苹果品种包括RedDelicious（红元帅）、Galden等，其中RedDelicious最易感病。A.3地理分布
美国华盛顿州
A,4病害症状
Delicious（金冠）、Fuji（富士）枝条症状：苹果星裂壳孢果腐病菌能为害苹果树及梨树的枝干和枝梢，造成欧洲森林苹果嫩枝顶梢枯死和苹果授粉树树皮溃疡、西洋梨树嫩枝坏死，后期在坏死的树皮表面可见突起细小的黑色颗粒状分生孢子器（参见图B.1图片10～11果实症状：典型症状为果梗凹腐（带腐）果凹腐（底腐）。分别从果梗基部或萼凹基部开始侵染，至贮藏阶段在果梗凹部、果萼凹部腐烂开始发病、呈现浅褐色至暗褐色，其中果梗凹腐症状在苹果品种RedDelicious、GoldenDelicious较为普遍，果萼凹腐则多出现在苹果品种Fuji上。病部果皮暗褐色至黑色，病健交界明显，有黑褐色分界纹带，果肉组织褐变，淡褐色至褐色，呈海绵状，质地稍硬。部开病果，可见褐变腐烂区域呈V或U形，病健交界处可见明显的褐色鲜亮纹带，储藏后期，病果表面可见黑色、颗粒状分生孢子器及乳白色至乳黄色黏质状分生孢子团，分生孢子器在立体显微镜下呈半球形，在果皮上表生或部分埋生。后期病果呈暗褐色或黑色，散发浓烈的酸臭味（参见图B.1图片1~9)。5
kAoNirKAca
SN/T3752—2013
说明：
梗叶腐：
萼叫腐：
附录B
（资料性附录）
苹果星裂壳孢果腐病症状、病原形态特征及培养性状图广东口岸进境截获的美国红元帅苹果病果；分生孢子器形成在枯死的苹果嫩枝上；枯死苹果嫩枝上分生他子器的近摄照片。注：图片1~6，10~11引自XiaoCL等，2005，2006图片79引白王卫芳等，2011。图B.1
苹果星裂壳孢果腐病菌为害所致的症状图iiKAoNiKAca
说明：
果实表面上分生孢子器的近摄照片：具单个开口孔的分生孢子器；bZxz.net
具几个不规则孔穴的分生孢子器；具三个开口（箭头示）的分生孢了器；瓶梗式内壁芽生产孢方式：分生孢子着生在明显的瓶梗上SN/T3752—2013
分生孢子着生在产孢细胞上，图片6分生孢子下的曲膝状表示合轴式全壁芽牛产孢方式；分生孢子（DIC下拍摄）：
菌落正面：
菌落反面
注：图片1.4~9引白XiaoCL等，2005；图片2~3、10~12引自王卫芳等，2011标尺：图片1：0.41mm，图片4~9：6.6μm。
图B.2苹果星裂壳孢果腐菌形态和菌落图SN/T3752—2013
C.1DNA提取一CTAB提取法
附录C
（规范性附录）
ITS序列测定
采用常规CTAB法提取病菌基因组DNA作扩增模板，分离材料可选寄主病部的分牛孢子器、分生孢子团或菌丝体，也可选分离物菌落边缘新鲜菌丝（培养基APDA，20℃黑暗条件下培养5d)20mg。加人570μL2%CTABDNA提取液，30μL10%SDS溶液，充分研磨，65℃水浴30min，加人600uL酚三氯甲烷液（酚：三氯甲烷：异戊醇25：241）抽提2次，11000g常温离心5min，取上清液，加入1/10体积3mol/L醋酸钠溶液和2倍体积无水乙醇混勺，空温静置20min，11Q00g4℃离心10min，充上清液，沿离心管壁加人1mL70%乙醇溶液清洗DNA沉淀，11C00g4℃离心5min，弃上清液，加入40LTris-EDTA缓冲液溶解，置于一20备用。也可用商品化的适合真菌基因组DNA提取试剂盒提取菌丝DNA。
PCR扩增及PCR产物检测分析
PCR物：ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG3'）和 ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)
PCR反应体系总体积为25μL：10倍PCR缓冲液（含MgCl）2.5L，dNTPs（2.5mmol/L)2aL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，TqDNA聚合酶（5U/uL)0.125L，模板DNA2μL.（50ng），ddH.016.375uL.
2min:94℃45s.60
PCR反应程序：94℃预变性
10min。
45s72C
min，30个循环：72C延伸
PCR产物在0.5XTBE电泳缓冲液中1%凉脂糖凝胶电泳及凝胶成像分析。3PCR产物测序、ITS序列BLAST及系统发育分析C.3
PCR产物纯化后测序，测序结果与NCBI/GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较，确定与试验菌株亲缘关系最近的种，从GenBank获得与试验菌株ITS序列同源性较高的相关种属的ITS序列.构建系统发育树。用MEGAversion4.c.1进行进化分析，进化树的构建采用Neighbourjoining方法，设置均为默认值，同时计算进化谢离及各分支的置信度8
无性型
有性型
病果症状
病原菌
无性型的
形态特征
生长温度
ITS序列
附录D
（资料性附录）
苹果星裂壳孢果腐病菌与近似种梨波氏盘果腐病菌的区别表D.1
苹果星裂壳孢果腐病菌与梨波氏盘果腐病菌的比较苹果星裂壳孢果腐病菌
Pharidiopyenis washingtonensis Xiao&J.DRogers
尚未报道
美国（华盛顿州）
欧洲栽培草果（Malu
lomestica及欧
stris）和西洋梨Pyrus
森林苹果（M.sylue
欧洲裁培革果品种中红元师
communis)。
（Red Delicios）最易感病
苹果树和
梨树树皮遗场或坏死·枝梢枯
死，储藏期苹果腐烂
主要为果梗凹腐、果萼凹腐
侵染导致的腹烂
腐烂组织海绵状，质地稍硬，
也有经皮孔
腐烂组织水
浸状不如裂果腐病明显，边缘不太透明烂果无特殊的香味
分牛孢了器单腔室
多腔室，半理生或
乎表生，只产生一种类型孢子。生孢子
色透明，单胞，泪滴形、端平载、或卵形
椭圆形，尤胞痕、光滑，具2个
油球，平均大
小为7μm×3.5μm
范：-3℃~25℃
最适：20℃~25℃
SN/T3752—2013
梨波氏盘果魔病菌
Phacidiopycnis piri(Fuckel)Weindlmayromiamycespyri(Berk.&Br.DennisPoteb
英国、乌克兰、我罗斯、塞浦路斯、美国（华盛顿州、俄勒冈州）、加拿大、印度皇家嘎拉苹果（MalusXdome、stica），温棒（Cydoniavulgaris），西洋梨（P.communis），沙梨（P.pyrifolia）西洋梨中冬梨（dAnjou）最易感病
树和梨树树皮的溃疡或坏死，枝梢枯苹果
储霞期梨果腐烂
要为果梗凹腐、果萼凹腐：也有经伤口侵教的廣烂。
腐烂组织游绵状。发病初期至后期腐烂组及剖面果肉组织均呈透明的水浸状。织边缘
烂果散发特殊的香味
抱子器多腔室，埋生、半埋生，可产生分生
大、小两种类型的孢子。大孢子无色透明至淡光滑，一端平钝，亚球形至椭圆形或卵黄色
老熟后具油滴，平均大小为11.5m×5只m小饱子不如大分生孢了常见，大小为(46 μm)X(2--2.5 μm)
范围：-3℃--25℃
最适：20℃~25℃
有4个的差异碱基位点：3个在ITS1区，1个在ITS2区；在系统发育树上苹果星裂壳孢果腐病菌与梨波氏盘果腐菌相邻但不聚在同一簇，而与其他亲缘关系较低的种属距离远注：引自XiaoCL等（2004，2005，2006）、工卫芳等（2009）。9
SN/T3752—2013
参考文献
Ll] Xiao Cf, Rogers JD,Kim YK.et at.Phacidiopyenis washingtonensis.. a ncw specics assoui-aledl with pome fruits [rom Washinglon State,J.Mycologie,2005.97(2);264-473.L2] Kim YK and Xiao CL.A postharvest fruit rot in appic calsrd hy Pharidiupye:mis wu.hingtonensis.1].Plant disease.2306,9oc11):1376-1381.L3! White IJ, Bruns I, Lee S,et al.Amplification and lircet sequeneing of funigal ribosumalRNA genes for phylogenetics.In PCR protocols : a guide to methods and applitalticusL MJ. San Tiegu.CalifarniuAcadcmicPress,1990.315-322._4_ Xiao CL,and Boal RJ.Prevalencc ard incidence of Phacidiupyenis rot irn d*Anjou pears inWa:hington State_Jl.Plant Disease,2004,88(4),413-418.L5_ Xiao CL and Boal RJ.Distribution of Potehniamyces pyri in the L:.S.Pacifir Northweal andits association with a canker and twig dichack disease of pear trecs[J.Plsm Dincasr,20oi, 89 (9):920-925.
L6J DiCosmo F.,Nag Raj TR and Kendrick WB.A revision of the Phaeidiuceue and related anatorphsLJ].Mycot=xon, 1984.21 :1-234.[7]下卫芳，胡佳，赵立荣等.进境美国苹果星裂克孢果腐病菌的首次截获—病原真菌的鉴定及风险分析二J.植物病理学报，2011，41（3）；232-239，[」下卫芳.胡佳：崔汝强等.进境水果重要真菌病古一一星裂尧孢梨果腐病和节果果腐病J门.梢物检疫，2009,23(1)：26-30.
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苹果星裂壳孢果腐病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Phacidiopycnis washingtonensis Xiao & J.D Rogers2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民其和国广东出人境检验检疫局本标准主要起草人：工卫芳、冯黎霞、胡佳、章性、华丽，SN/T3752—2013
1范围
苹果星裂壳孢果腐病菌检疫鉴定方法本标准规定了植物检疫中苹果星裂壳孢果腐病菌的检疫鉴定方法。SN/T3752—2013
本标准适用于进境苹果和梨植株及其果实中苹果星裂壳孢果腐病菌的检疫鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2455进出境水果检验检疫规程3检疫鉴定原理
苹果星裂壳孢果腐病菌在寄主上的症状、病菌形态学特征与培养性状及分子生物学特征是制定本标准的主要依据。该病菌的分类地位，寄主范围、分布和为害症状等背景资料参见附录A。4仪器及用具
4.1仪器
高压灭菌器、生物培养箱、台式高速离心机、PCR扩增仪、凝体视显微镜、生物显微镜、超净工作台胶成像仪、电子天平（感量0.01g）、水浴箱2用具
酒精灯、接种针、培养血（直径9cm）、烧杯、三角瓶、试管、量样品袋、标签、放大镜、镊子、解剖力筒、载玻片、盖玻片、研钵及研杆、微量移液器（可调式范围：2.5-1000μL)、离心管。5试剂和培养基
5.1试剂
1%NaC1O溶液、无水乙醇、70%乙醇、无菌双蒸水、2%CTAB提取缓冲液、10%SDS溶液、3mol/1醋酸钠溶液、PCR试剂（包括Taq聚合酶、dNTP、Buffer）、苯酚、三氯甲烷、异戊醇，Tris-HCl、EDTA，琼脂糖、DNA分子量标准、TBE电泳缓冲液。5.2培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：每1000mLPDA山200g去皮马铃薯，20g葡萄糖，18g琼脂配制而成。
酸性马铃薯葡萄糖琼脂培养基（APDA)：每1000mLPDA中加人4.0mL25%乳酸。1
SN/T 3752—2013
6检疫鉴定方法
6.1口岸现场查验
6.1.1抽样
口岸现场查验时，按照S.N/T2455进行抽样与取样。6.1.2枝条症状检查
观察嫩枝项梢是否死，树皮是否下枯，病部是否有突起细小的黑色颗粒状分生孢子器及乳黄色分生拖了闭等病征(症状特点参见附录 A、 B.1 图片 10-~11)。6.1.3果实症状检查
仔细检查果梗叫部，萼凹部是否腐烂，病质地及顏色，病部是否有突起细小的黑色颗粒状分生孢子器及乳黄色分生孢子幽等病征（症状特点参见附录A.图L.1图片19)。将可疑技条利果实样品带回实验室作进一步检验，记录样品品种、数量、来源国及取样地点、取样人和取样日期等信息，
6.2实验鉴定
6.2.1直接检验
观察记录病,果的外观及剖面症状特点，将有明显病征的病技与病果置丁休视显微镜下检查，挑取病部黑色粒状分生弛广器制成玻片，置丁生物显微镜下镜检。6,2.2保湿培养
如病枝或病果上只有可疑病状而无明显病征，则将病枝（截成5cm）或病果置于样品袋中，丁20℃下保湿培养.观察症状的变化。
6.2.3分离培养
直接挑取病部的分生孢子器或分牛孢子团，肾于APDA平板上*或采用组织分离培养法，用1%NaCIO溶液或70%乙醇对果实表面喷雾消毒，风干后用消毒过的刀片切取病健交界处果肉组织，切成5mm×5mm小块后放置于APDA4.在20℃、黑暗下培养7d～14d，定期观察，将菌落边缘菌丝体置于新鲜的APDA平板.上进行纯化，以便用十后续的形态学和分子生物学鉴定。6.2.4病菌形态特征和培养性状观察显微镜检分生孢子器及分生孢的形态特征，产孢方式。，在20℃，黑暗条作下，观察记录菌落的生长速度、色变化、分生孢了器及分生孢子团的形成情况。6.2.5分子生物学鉴定
6.2.5.1 INA 提取
采用附录C中的CTAB法提取病菌基因LINA。6.2.5.2PCR 检测及 ITS基因分析采用C.I、C,2扩增检测病菌基因组DNA中的ITS基因，测序后采用C,3进行I3I.AST与系统发有2
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分析。
7聋定特征
7.1病菌形态
SN/T 3752--2013
在寄土果实上分生孢子器半理生或儿乎表生，业球形，稍扇平，暗黑色，直径约0.3mm～0.8m，单腔室或多腔室，并口单个或几个，呈小孔状或不规则孔穴：产抱方式为瓶梗式内壁芽生或合轴式全壁芽生，分生孢子无色透明，单胞，派滴形。一端平截，或卵形牟懒圆形，无胞痕，光滑，油球2个。人小为：在裁培苹果(Muts dumrstica)上[(4.5~-)6-~7.5(-~9)_ μm×[2-~4(~-5)] μm. 均 7 μm×3.5 μm;在PDA上[（5~）6～7.5（~8）-μm×_3~4（~4.5)μm，半均7μm×3.5μm在欧洲森林苹果（Msylestris）上的大小为[(4.5~）6~7(~7.5）μm×(2~4）μm，平均6m×3μm(参见图B.2图片1~10)。7.2菌落特征
在2C、黑暗培养条件下，菌萍在PDA平板上呈圆形、平铺，气生菌丝盛、绒毛状，边缘不整齐，呆裂瓣状。菌落初为纯白色（培养3d），菌丝体老熟后逐渐由白色变为鼠灰色、灰黑色，最终变为黑色。培养了d后菌落中部呈鼠灰色至灰黑色，培养10d后菌落形成深浅色交替的菌丝环带，蘭落背面从中部至边缘依次呈黑、灰黑、灰、广色共4个环带。分生孢子器成熟速度较快且产孢丰富，培养至7d即涌出大量分生孢子，在菌落表面难集成团，黏调状、乳白色至乳黄色，培养14d后分生孢团则布满整个菌落（参见图B.2图片11~-12）。7.3ITS序列特征
PCR扩增产物序列测定大小为513bp，EI.AST分析表明病菌与GcnBank\已知的苹果星裂壳孢果腐病菌的ITSI-3.8SrRNA-ITS2全序列AY6C8643、AY608611.AY608645.AY608646、AY608647、AY608618的同源性均为100%，在系统发育树上：与苹果星裂壳孢果腐病菌案在同一簇，支持度为100%，而与该病菌的近似种梨波氏盘果腐病菌（态见附录I)相邻，但不聚在同一簇。8结果判定
符合下列任一种情况均可判定为检出苹果星裂壳孢果腐病菌：如果病部有明显的病状和病征，病菌形态学特征与鉴定指标7.1吻介，而与该病菌的近似种波氏盘果腐病菌的形态特征（附录D)不吻合；扩增得到的ITS序列在系统发育树1.与苹果星裂壳孢果腐病菌聚在同一簇，支持度为100%。如果病部有病状但无病征，经保湿培养和/或分离培养所产生的病菌形态学特征及培养性状与鉴定指标7.1~～7.2吻合，而与该病菌的近似种梨波氏盘果膚病菌的形态特征（附录D)不晰合，并1扩增得到的ITS基匹在系统发育树上与苹果星裂壳孢果腐病菌聚在同簇，支持度为100%。9样品和资料的保存
9.1萄种和DNA样品的保存
菌株在含30%甘油的冻存管中于一80℃保存，或将菌株转接在PDA斜面上培养，待菌丝体长满斜面后，置于4℃下保存，并定期（180d)转管，标注分离物来源、寄主、分离时间和鉴定人；病菌基因红DNA样品于一20℃下保存。
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SN/T3752-2013
检验资料的保存
妥善保存检验报告包括症状、病菌、电泳图谱饰图义资料，以备复验、谈判和仲裁。检验报告应注明检验日期、万法，结巢等，并有检验人签名。4
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A.1分类地位
附录A
（资料性附录）
苹果星裂壳孢果腐病菌的分类地位、寄主范围、分布和为害症状英文名：speckrotonapple:Phacidiopycnisrotonapple学名：Phacidiopyenis washingtonensisXiao&JDRogers 2005SN/T3752—2013
在分类上隶属于半知菌亚门（Deuteromycotina），腔孢纲（Coelomycetes），球壳孢目（Sphaeropsidales），球壳孢科（Sphaeropsidaceae），星裂壳孢属（Phacidiopycnis）。A.2寄主范围
普薇科（Rosaccac）：苹果属（Malus）、梨属（Pyrus）温属（Cydonia）等果树欧洲栽培苹果（M.domestica）及欧洲森林苹果（M.svluestris）和西洋梨（P.communis）等三个种均可被害。受害的欧洲栽培苹果品种包括RedDelicious（红元帅）、Galden等，其中RedDelicious最易感病。A.3地理分布
美国华盛顿州
A,4病害症状
Delicious（金冠）、Fuji（富士）枝条症状：苹果星裂壳孢果腐病菌能为害苹果树及梨树的枝干和枝梢，造成欧洲森林苹果嫩枝顶梢枯死和苹果授粉树树皮溃疡、西洋梨树嫩枝坏死，后期在坏死的树皮表面可见突起细小的黑色颗粒状分生孢子器（参见图B.1图片10～11果实症状：典型症状为果梗凹腐（带腐）果凹腐（底腐）。分别从果梗基部或萼凹基部开始侵染，至贮藏阶段在果梗凹部、果萼凹部腐烂开始发病、呈现浅褐色至暗褐色，其中果梗凹腐症状在苹果品种RedDelicious、GoldenDelicious较为普遍，果萼凹腐则多出现在苹果品种Fuji上。病部果皮暗褐色至黑色，病健交界明显，有黑褐色分界纹带，果肉组织褐变，淡褐色至褐色，呈海绵状，质地稍硬。部开病果，可见褐变腐烂区域呈V或U形，病健交界处可见明显的褐色鲜亮纹带，储藏后期，病果表面可见黑色、颗粒状分生孢子器及乳白色至乳黄色黏质状分生孢子团，分生孢子器在立体显微镜下呈半球形，在果皮上表生或部分埋生。后期病果呈暗褐色或黑色，散发浓烈的酸臭味（参见图B.1图片1~9)。5
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SN/T3752—2013
说明：
梗叶腐：
萼叫腐：
附录B
（资料性附录）
苹果星裂壳孢果腐病症状、病原形态特征及培养性状图广东口岸进境截获的美国红元帅苹果病果；分生孢子器形成在枯死的苹果嫩枝上；枯死苹果嫩枝上分生他子器的近摄照片。注：图片1~6，10~11引自XiaoCL等，2005，2006图片79引白王卫芳等，2011。图B.1
苹果星裂壳孢果腐病菌为害所致的症状图iiKAoNiKAca
说明：
果实表面上分生孢子器的近摄照片：具单个开口孔的分生孢子器；bZxz.net
具几个不规则孔穴的分生孢子器；具三个开口（箭头示）的分生孢了器；瓶梗式内壁芽生产孢方式：分生孢子着生在明显的瓶梗上SN/T3752—2013
分生孢子着生在产孢细胞上，图片6分生孢子下的曲膝状表示合轴式全壁芽牛产孢方式；分生孢子（DIC下拍摄）：
菌落正面：
菌落反面
注：图片1.4~9引白XiaoCL等，2005；图片2~3、10~12引自王卫芳等，2011标尺：图片1：0.41mm，图片4~9：6.6μm。
图B.2苹果星裂壳孢果腐菌形态和菌落图SN/T3752—2013
C.1DNA提取一CTAB提取法
附录C
（规范性附录）
ITS序列测定
采用常规CTAB法提取病菌基因组DNA作扩增模板，分离材料可选寄主病部的分牛孢子器、分生孢子团或菌丝体，也可选分离物菌落边缘新鲜菌丝（培养基APDA，20℃黑暗条件下培养5d)20mg。加人570μL2%CTABDNA提取液，30μL10%SDS溶液，充分研磨，65℃水浴30min，加人600uL酚三氯甲烷液（酚：三氯甲烷：异戊醇25：241）抽提2次，11000g常温离心5min，取上清液，加入1/10体积3mol/L醋酸钠溶液和2倍体积无水乙醇混勺，空温静置20min，11Q00g4℃离心10min，充上清液，沿离心管壁加人1mL70%乙醇溶液清洗DNA沉淀，11C00g4℃离心5min，弃上清液，加入40LTris-EDTA缓冲液溶解，置于一20备用。也可用商品化的适合真菌基因组DNA提取试剂盒提取菌丝DNA。
PCR扩增及PCR产物检测分析
PCR物：ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG3'）和 ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)
PCR反应体系总体积为25μL：10倍PCR缓冲液（含MgCl）2.5L，dNTPs（2.5mmol/L)2aL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，TqDNA聚合酶（5U/uL)0.125L，模板DNA2μL.（50ng），ddH.016.375uL.
2min:94℃45s.60
PCR反应程序：94℃预变性
10min。
45s72C
min，30个循环：72C延伸
PCR产物在0.5XTBE电泳缓冲液中1%凉脂糖凝胶电泳及凝胶成像分析。3PCR产物测序、ITS序列BLAST及系统发育分析C.3
PCR产物纯化后测序，测序结果与NCBI/GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较，确定与试验菌株亲缘关系最近的种，从GenBank获得与试验菌株ITS序列同源性较高的相关种属的ITS序列.构建系统发育树。用MEGAversion4.c.1进行进化分析，进化树的构建采用Neighbourjoining方法，设置均为默认值，同时计算进化谢离及各分支的置信度8
无性型
有性型
病果症状
病原菌
无性型的
形态特征
生长温度
ITS序列
附录D
（资料性附录）
苹果星裂壳孢果腐病菌与近似种梨波氏盘果腐病菌的区别表D.1
苹果星裂壳孢果腐病菌与梨波氏盘果腐病菌的比较苹果星裂壳孢果腐病菌
Pharidiopyenis washingtonensis Xiao&J.DRogers
尚未报道
美国（华盛顿州）
欧洲栽培草果（Malu
lomestica及欧
stris）和西洋梨Pyrus
森林苹果（M.sylue
欧洲裁培革果品种中红元师
communis)。
（Red Delicios）最易感病
苹果树和
梨树树皮遗场或坏死·枝梢枯
死，储藏期苹果腐烂
主要为果梗凹腐、果萼凹腐
侵染导致的腹烂
腐烂组织海绵状，质地稍硬，
也有经皮孔
腐烂组织水
浸状不如裂果腐病明显，边缘不太透明烂果无特殊的香味
分牛孢了器单腔室
多腔室，半理生或
乎表生，只产生一种类型孢子。生孢子
色透明，单胞，泪滴形、端平载、或卵形
椭圆形，尤胞痕、光滑，具2个
油球，平均大
小为7μm×3.5μm
范：-3℃~25℃
最适：20℃~25℃
SN/T3752—2013
梨波氏盘果魔病菌
Phacidiopycnis piri(Fuckel)Weindlmayromiamycespyri(Berk.&Br.DennisPoteb
英国、乌克兰、我罗斯、塞浦路斯、美国（华盛顿州、俄勒冈州）、加拿大、印度皇家嘎拉苹果（MalusXdome、stica），温棒（Cydoniavulgaris），西洋梨（P.communis），沙梨（P.pyrifolia）西洋梨中冬梨（dAnjou）最易感病
树和梨树树皮的溃疡或坏死，枝梢枯苹果
储霞期梨果腐烂
要为果梗凹腐、果萼凹腐：也有经伤口侵教的廣烂。
腐烂组织游绵状。发病初期至后期腐烂组及剖面果肉组织均呈透明的水浸状。织边缘
烂果散发特殊的香味
抱子器多腔室，埋生、半埋生，可产生分生
大、小两种类型的孢子。大孢子无色透明至淡光滑，一端平钝，亚球形至椭圆形或卵黄色
老熟后具油滴，平均大小为11.5m×5只m小饱子不如大分生孢了常见，大小为(46 μm)X(2--2.5 μm)
范围：-3℃--25℃
最适：20℃~25℃
有4个的差异碱基位点：3个在ITS1区，1个在ITS2区；在系统发育树上苹果星裂壳孢果腐病菌与梨波氏盘果腐菌相邻但不聚在同一簇，而与其他亲缘关系较低的种属距离远注：引自XiaoCL等（2004，2005，2006）、工卫芳等（2009）。9
SN/T3752—2013
参考文献
Ll] Xiao Cf, Rogers JD,Kim YK.et at.Phacidiopyenis washingtonensis.. a ncw specics assoui-aledl with pome fruits [rom Washinglon State,J.Mycologie,2005.97(2);264-473.L2] Kim YK and Xiao CL.A postharvest fruit rot in appic calsrd hy Pharidiupye:mis wu.hingtonensis.1].Plant disease.2306,9oc11):1376-1381.L3! White IJ, Bruns I, Lee S,et al.Amplification and lircet sequeneing of funigal ribosumalRNA genes for phylogenetics.In PCR protocols : a guide to methods and applitalticusL MJ. San Tiegu.CalifarniuAcadcmicPress,1990.315-322._4_ Xiao CL,and Boal RJ.Prevalencc ard incidence of Phacidiupyenis rot irn d*Anjou pears inWa:hington State_Jl.Plant Disease,2004,88(4),413-418.L5_ Xiao CL and Boal RJ.Distribution of Potehniamyces pyri in the L:.S.Pacifir Northweal andits association with a canker and twig dichack disease of pear trecs[J.Plsm Dincasr,20oi, 89 (9):920-925.
L6J DiCosmo F.,Nag Raj TR and Kendrick WB.A revision of the Phaeidiuceue and related anatorphsLJ].Mycot=xon, 1984.21 :1-234.[7]下卫芳，胡佳，赵立荣等.进境美国苹果星裂克孢果腐病菌的首次截获—病原真菌的鉴定及风险分析二J.植物病理学报，2011，41（3）；232-239，[」下卫芳.胡佳：崔汝强等.进境水果重要真菌病古一一星裂尧孢梨果腐病和节果果腐病J门.梢物检疫，2009,23(1)：26-30.
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