SN/T 3954-2014
基本信息
标准号： SN/T 3954-2014
中文名称：国境口岸尼帕病毒RT-PCR和实时荧光 RT-PCR检测方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.zip .pdf
下载大小：2774514
相关标签： 国境 口岸 尼帕 病毒 PCR 实时 荧光 检测 方法
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3954-2014.Detection of nipah virus at frontier port by RT-PCR and real time fluorescence RT-PCR.
1范围
SN/T 3954规定了国境口岸尼帕病毒RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法检验的对象、检测方法及结果报告。
SN/T 3954适用于国境口岸尼帕病毒的实验室检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室 生物安 全通用要求
SN/T 1193基因检验实验室技术要求
WS/T230临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用
可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定(原中华人民共和国卫生部)
人间传染的病原微生物菌(毒)种保藏机构管理办法(原中华人民共和国卫生部)
人间传染的病原微生物名录(原中华人民共和国卫生部,2006年)
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1尼帕病毒Nipah virus; NiV
尼巴病毒Nipah virus; NiV
属于副粘病毒科(Paramyxoviridac)亨德拉尼帕病毒属(Heniparirus),单股负链RNA病毒,可引起一种新型烈性人畜共患传染性疾病一尼 帕病毒病(Nipah virus disease,NVD),严重威胁人类和猪、马等动物的健康。尼帕病毒感染人后的潜伏期为1周~3周,在人群中有人传人的可能，人的临床表现主要为严重的快速进行性脑炎,脑干功能失常(表现为高血压、心动过速),死亡率高达40%~70%。不同患者发病的严重程度各异,多数以神经症状为主，也可以呼吸道症状为主,特征症状是颈部和腹部肌肉痉挛,同时出现体温升高、头痛、嗜睡、呕吐、咳嗽、意识混乱，严重的昏迷、死亡。
1范围
SN/T 3954规定了国境口岸尼帕病毒RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法检验的对象、检测方法及结果报告。
SN/T 3954适用于国境口岸尼帕病毒的实验室检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室 生物安 全通用要求
SN/T 1193基因检验实验室技术要求
WS/T230临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用
可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定(原中华人民共和国卫生部)
人间传染的病原微生物菌(毒)种保藏机构管理办法(原中华人民共和国卫生部)
人间传染的病原微生物名录(原中华人民共和国卫生部,2006年)
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1尼帕病毒Nipah virus; NiV
尼巴病毒Nipah virus; NiV
属于副粘病毒科(Paramyxoviridac)亨德拉尼帕病毒属(Heniparirus),单股负链RNA病毒,可引起一种新型烈性人畜共患传染性疾病一尼 帕病毒病(Nipah virus disease,NVD),严重威胁人类和猪、马等动物的健康。尼帕病毒感染人后的潜伏期为1周~3周,在人群中有人传人的可能，人的临床表现主要为严重的快速进行性脑炎,脑干功能失常(表现为高血压、心动过速),死亡率高达40%~70%。不同患者发病的严重程度各异,多数以神经症状为主，也可以呼吸道症状为主,特征症状是颈部和腹部肌肉痉挛,同时出现体温升高、头痛、嗜睡、呕吐、咳嗽、意识混乱，严重的昏迷、死亡。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3954-2014
国境口岸尼帕病毒RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法
Detection of nipah virus at frontier pori by RT-PCR and real timefluorescence RT-PCR
2014-04-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-11-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准出国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3954-2014
本标准起草单位：中华人民其和国珠海出人境检验检疫局、深圳市计量质量检测研究院，中华人民非和国四川出人境检验检疫局。本标滩主要起草人：莫秘华、李卫岗、谭华、史咏梅、胡科新、兰个学、林继灿、杨泽、赵俊华.陈肖萧。1范围
国境口岸尼帕病毒RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法
SN/T3954—2014
本标准规定了国境口岸尼帕病毒RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法检验的对象，检测方法及结果报告。
本标准适用于国境口岸尼帕病毒的实验空检测2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1193.基因检验实验室技术要求WS/T230临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（原中华人民共和国卫生部）人间传染的病原微生物菌（毒）种保藏机构管理办法（原中华人民共和国卫生部）人间传染的病原微生物名录（原中华人民共和国卫生部，2006年）3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
尼帕病毒Nipahvirus;Niv
尼巴病毒Nipahvirus;Niv
属于副粘病毒科（Paramyxoviridae）亨德拉尼帕病毒属（Henipauirus），单股负链RNA病毒，可引起一种新型刻性人备共患传染性疾病-尼帕病毒病（Nipahirusdisease，NVD），严重威胁人类和猪、马等动物的健康。尼帕病毒感染人后的潜伏期为1周一3周，在人群中有人传人的可能，人的临床表现主要为严重的快速进行性脑炎，脑干功能失常（表现为高血压、心动过速），死亡率高达40%～70%。不同患者发病的严重程度各异，多数以神经症状为主，也可以呼吸道症状为主，特征症状是颈部和腹部肌肉挛，同时出现体温升高、头痛、嗜睡、呕吐、咳嗽、意识混乱，严重的昏迷、死亡。3.2
逆转录聚合酶链反应reversetranscriptionpolymerasechainreaction；RT-PCR将RNA的逆转录（RT)和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR)相结合的技术。本标准采用一步法逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）。在一步法RT-PCR中，首先以RNA为模板，利用下游特异性引物在依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）的作用下转录合成互补DNA（cDNA），该步称作“逆转录”：随后，再以cDNA为模板，利用上游和下游特异性引物，在DNA聚合酶的作用下进行PCR循环扩增；最终使RNA分子的某个特定区域（目的片段）被扩增达几百万倍。1
SN/T 3954-2014
实时荧光 RT-PCRreal-time fluorescence RT-PCR通过荧光染料或荧光标记的特异性荧光探针，对反转录后FCR扩增的产物进行标记跟踪，利用炭光信号累积实现实时在线监测整个PCR反应过程，结合相应的软件可以对结果进行定性和定量分析。本标准所采用的荧光探针是 TagMan水解探针。该探针为一段寡核背酸分子，在5’端和3’端分别标记荧光报告基团（如FAM)和荧光率灭基团（如TAMRA）。该探针可与PCR产物发生特异性杂交。当探针保持完整时，率灭基团抑制报告基团的荧光发射。在PCR扩增时，利用Tu4酶的5\→3'外切酶活性将探针酶切水解，使荧光报告基团和荧光灭基闭分离，距离变大，萍灭作用被解除，荧光信号释放出来并被仪器的荧光探测系统检测到，模板每复制一次：就有一条探针被切断：伴随个费光信号的放,从而实现荧光信号的累积与PCR产物的数量完全同步。3.4
Cl 值 cyele threshold
在荧光PCR中，每个反应管内的荧光信号到达设定的阔值时所经历的循环数。4缩略语
下列缩略诺适用于本文件，
4.1DEPC.diethylpyrocarbonate,焦碳酸=。4.2PAGE+polyacrylamidegel electrophoresis，聚丙烯酰胺凝胶电泳4.3HPLC.highpeiformenceliquid chromatography.高效液相色谱，4.4bp:base pair,碱基对。
4.5FAM:6-carboxy-fluoresccin，6-羧基-荧光素·一种荧光报告基闭。4.6TAMPA:carboxylctramcthylrhodamine.羧基四甲基罗丹明。5检测对象
5.1国境11岸伴发热的尼帕病毒感染的病例或疑似病例。5.2其他申请检验的人员。
生物安全和 PCR防污染要求Www.bzxZ.net
实验室生物安全应符合GB19489的规定。按照原中华人民共和国卫生部制定的《人间传染的病原微生物名录\的规定操作相应的试验材料，未经培养的感染材料的操作在BSL-3 生物安全实验空内进行，面在BSL·2生物安全实验率内可操作灭活的材料，PCR防污染措施按WS/T239和SN/T1193的规定执行。
7主要仪器
7.1二级B型生物安全柜。
7.2台式高速冷冻离心机（最高离心力12000g以上）7.3旋涡振荡器。
7.4冰箱:4 ℃、-20 ℃和-70 。7.5超净工作台，
-TKAONKAca
7.6微型离心机，
7.7PCR热循环仪。
7.8 荧光 PCR仪。
7.9 电子天平(d=1 mg)。
7.10微波炉，
7.11电泳仪。
凝胶成像分析系统。
高压火菌锅。
超纯水器或双蒸水器。
SN/T 3954—2014
微量可调移液器一套（含以下5种规格：10ml、20μl、100μL.200μL，1mL)。主要试剂
8.1无 RNA 酶的 DEPC 水,
8.2引物和探针：RT-PCR引物应为PAGE以上级别纯化，探针为HPLC纯化，引物和操针序列见9.2.4.1和 9.2.5.1.
步法RT-PCR 基础试剂：宝生物工程（大连）有限公司 PrimeScript One Step RT-PCR Kit8.3
8.4-步法荧光RT-PCR基础试剂：宝生物工程(大连)有限公可neStepPrimeScriptRT-PCRKit(Perfert Real Tirle)!
8.5电泳缓池液（10×TBE）：称取108Tris碱.7.44gNaEDTA·H和55g硼酸，溶于800mL的双蒸水中，充分揽拌溶解后加水定容至1L.室温保存。8.6溴化乙锭（ER）：10mg/tnL，使用浓度为0.5μg/mlB.7GoldenVicw核酸染料：使用浓度为5pL/100rnL。9检验程序
9.1样品的采集保存和运送
采集发热的疑似病人或患者的临床标本，包括血液，脑脊液、咽拭了等，如是血浆不宜使用肝素抗凝。样品的运送过程宜在0℃以下进行。样品的保存和运输的生物安全要求参照原卫生部颁布的《人间传染的病原微生物菌（毒）种保藏机构管理办法》和《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》。
9.2实验室检验
9.2.1样品处理
血液样本直接分离血清或血浆。脑脊液样本苔先在4℃以30001/min离心10min.小心吸弃上层液体，保留约250uL上清，并用其重悬细胞沉淀。咽拭子样本直接进行病毒核酸提取。不能立即进行检验时,样本冻存于一70 ℃超低温冰箱备用。1）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可和推荐，如果其他等效产品具有相同的效果,则可使用这些等效产品。
-TTKAONKAca
SN/T3954—2014
病毒核酸提取
9.2.2.1Trizol法
取9.2.1处理好的样本150μl.加人750μLTrizol液，振荡混匀后室温静置5min，然后加人200处三氯甲烷，盖紧离心管，振荡混匀15后室温静置5min.4℃12000r/min离心10min，取上层水相至另一离心管中，加人等量异丙醇沉淀RNA，充分混勾后室温放置10min，12000r/min离心10min，充上清液，再加人1mL的70%乙醇洗涤1次，12000r/min离心5min，弃上清液，室温放置2min~3min，马上加入20μL~~50μL无RNA酶的DEPC水（或其他核酸溶解液）溶解沉淀，即为RNA模板，用于RT-PCR扩增。分装后保存在一70℃备用9.2.2.2试剂盒提取纯化核酸法
按适用于病毒基因组提取的商品试剂盒说明书操作9.2.3阳性对照、阴性对照和空白对照设置检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照为尼帕病毒核酸或根据尼帕病毒核苷酸序列通过基因合成、载体构建和体外转录合成的RNA（见附录A），阴性对照可选择其他种类病毒的核酸样本，空白对照用无菌水作为RT-PCR和实时荧光RT-PCR反应的模板。9.2.4普通RT-PCR检测
9.2.4.1检测引物
引物应用液浓度配制成20umol/L，扩增片段大小292bp.序列如下：NiV-FI:5'-TAGAAATAATCTCAGAOATCGGAAA-3'NiV-RI.5'-CCCATAGACCTGTCAATAGTAGTAGC-3注：其他等效商品试剂盒也可使用反应体系组成
步法RTPCR反应体系采用以下参数：2XonestepRT-PCR缓冲液10uL；引物NiV-F1和NiV-R1各1.0μL;RT-PCREnzymeMix（含逆转录酶和Taq7.0μL;加无RNA酶的水补足至20μL9.2.4.3反应条件
DNA聚合酶）1.0uL，RNA模板5.0uL~一步法RT-PCR反应条件：50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃变性30555℃退火305，72℃延伸405，40个循环，72℃延伸7min4℃保温。因不同PCR仪器的性能差异，可根据条件适当调整PCR退火温度和时间。
9.2.4.4琼脂糖凝胶电泳
用0.5XTBE电泳缓冲液配制2.0%（质量分数）的琼脂糖凝胶（含溴化乙锭或GoldenVicw或其他等效核酸染料）。将琼脂糖凝胶放人水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好没胶面。取5L普通RT-PCR扩增产物和1L上样缓冲液混匀后加入糖凝胶的样品孔。在电泳时设立DNA标准分子量作对照，使用100bpDNA分子量标准。按8V/cm的电压条件电泳约30min～40min。采用凝胶成像分析系统观察核酸条带并判断结果。
-TTKAONiKAca
9.2.5实时荧光RT-PCR方法
9.2.5.1检测引物和探针
SN/T3954—2014
引物应用液浓度配制成20μmol/L，扩增片段大小131bp。探针应用液浓度配制成20μmol/L，探针的5和3端分别用FAM和TAMRA标记。引物和探针的序列如下：
NiV-F2:5-CATCAGCAGGAAGGCAAGAGAGTA-3NiV-R2.5-CTGTCTGCCACTCTGYTCTATAGGT-3'NiV-P:5*-FAM-ACTGCCTCCAATGAGCACACCTCCTGC-TAMRA-3注：简并碱基Y为C或T。
9.2.5.2反应体系组成
一步法实时荧光RT-PCR反应体系采用以下参数：2XOneStepRT-PCR缓冲液Ⅲ（含dNTP和Mg+等)12.5μL;引物NiV-F20.7μL:引物NV-R20.6μL探针NiV-P0.4μL;TaKaRaExTaqHS(5U/μL)0.5μL;PrimeScriptRTEnzymeMix0.5uL;RNA模板5.0μL；加水补足至25μL9.2.5.3反应条件
一步法实时荧光RT-PCR反应条件：42℃反转录10min：95℃预变性30s；95℃变性6s.55℃退火35s，72℃延伸15S.45个循环：选择FAM通道于55℃退火时收集荧光信号。不同实验室可根据所使用的试剂和仪器参考上述反应条件作适当调整。9.2.6结果判定及报告
9.2.6.1普通RT-PCR方法结果的判定当阳性对照出现目的片段条带，而阴性对照和空白对照没有任何核酸条带出现时才可对样本进行结果判定及报告，否则视为试验失败，需重新试验本方法检验结果判定及报告如下检测样本出现292bp条带时：报告\检出尼帕病特异性基因（RT-PCR法，292bp）\；检测样本未出现292bp条带时，报告未检出尼帕病毒特异性基因（RT-PCR法，292bp）”。9.2.6.2实时荧光RT-PCR方法结果的判定在实时荧光RT-PCR试验中，若阳性对照有明显的荧光增幅现象，且Ct值在预期的范围之内（≤30)；阴性对照和空白对照无荧光增幅现象，则表明反应体系运行正常，可以进行结果判定，否则，试验视为无效，需重新试验。
当同时进行的阳性、阴性和空白对照试验结果正常，本方法检验结果判定及报告如下：检测样品有明显的荧光增幅曲线，且Ct值≤35时，判为阳性，报告“检出尼帕病毒特异性基因（实时荧光RT-PCR法）”。
检测样品荧光增幅曲线的Ct值介于35和40之间时，应重新进行实时荧光RT-PCR检测。若重新检测的Ct值仍介于35和40之间，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性，报告检出尼帕病毒特兄性基因（实时荧光RT-PCR法）”，否则判为阴性，报告“未检出尼帕病毒特异性基因（实时荧光RT-PCR法）”。检测样品荧光增幅曲线的Ct值介于40和45之间时，建议采用浓缩方式处理核酸样本，再重新进行实时荧光RT-PCR检测。若重新检测的Ct值有明显减少趋势，且曲线有明显的对数增长5
-TTKAONiKAca
SN/T 3954--2014
期,判为阳性,报告\检出尼帕病毒特异性基因(实时荧光RT-P(法)”。此类样本建议用其他方法进一步验证否则判为阴性，报告“末检出尼帕病毒特异性基因（实时荧光RT-PCR法）”。检测样品无荧光增幅现象，判为阴性，报告\末检出尼帕病毒特异性基因(实时荧光RT-P(次法)\3测序（可选择）
对于检测阳性的样本可切下电泳分析的目的条带，用凝胶向收试剂盒向收纯化（按其说明·行进行）全自动遗传分析仪进行测序，确认病毒基因序列，也可进一步分析病毒基因的变异情况。6
rTKAoNiKAca
附录A
（规范性附录）
尼帕病毒阳性对照基因合成序列及GenBank参考序刻编号尼帕病毒GenBank参考序列编号：A.i564621.。阳性对照基因合成序列：
SN/T 3954—-2014
1gctaaaggcagagcaglagaaztaatctcagacalcggaaactaigtcgaggaaaciggtalggcaggattcticgcaaccatcagattcgggttggagaraaggtatccagcactigcaclcaacgaaticcagagtgaectcaacaccalcaaaagellgatgctacictacagagzatiggcccaagagccccttatatggtgcttriigaagaatraattcagartaaat1igccrctggaggttacccat tattgiggagetitgccut gggigiggclactactattgac.aggtetetgggggcattgaatatcaatcgiggtlatrtigagrelatglaittcagaclaggccaaaanlcagcecgtcaccatgctggaggaatt gatragaacatggcaaatagactgggactaagttcagatcaagttgcagaactcgclgrtgcegllcaggaaaralcagcaggaaggcaagagaglaatgttcaggctagagaggcaaaatttgctgcaggaggtgtgctcattggaggcagigatcaugelatrgatgaaggggaagaacclatagaacagaglggcagacagtcagttaccttcaaaagggagatgagtatttcarccrttgctaacagtgtgccgagcagticlg1gagcatalccggtgggaccagai1gac
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国境口岸尼帕病毒RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法
Detection of nipah virus at frontier pori by RT-PCR and real timefluorescence RT-PCR
2014-04-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-11-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准出国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3954-2014
本标准起草单位：中华人民其和国珠海出人境检验检疫局、深圳市计量质量检测研究院，中华人民非和国四川出人境检验检疫局。本标滩主要起草人：莫秘华、李卫岗、谭华、史咏梅、胡科新、兰个学、林继灿、杨泽、赵俊华.陈肖萧。1范围
国境口岸尼帕病毒RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法
SN/T3954—2014
本标准规定了国境口岸尼帕病毒RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法检验的对象，检测方法及结果报告。
本标准适用于国境口岸尼帕病毒的实验空检测2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1193.基因检验实验室技术要求WS/T230临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（原中华人民共和国卫生部）人间传染的病原微生物菌（毒）种保藏机构管理办法（原中华人民共和国卫生部）人间传染的病原微生物名录（原中华人民共和国卫生部，2006年）3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
尼帕病毒Nipahvirus;Niv
尼巴病毒Nipahvirus;Niv
属于副粘病毒科（Paramyxoviridae）亨德拉尼帕病毒属（Henipauirus），单股负链RNA病毒，可引起一种新型刻性人备共患传染性疾病-尼帕病毒病（Nipahirusdisease，NVD），严重威胁人类和猪、马等动物的健康。尼帕病毒感染人后的潜伏期为1周一3周，在人群中有人传人的可能，人的临床表现主要为严重的快速进行性脑炎，脑干功能失常（表现为高血压、心动过速），死亡率高达40%～70%。不同患者发病的严重程度各异，多数以神经症状为主，也可以呼吸道症状为主，特征症状是颈部和腹部肌肉挛，同时出现体温升高、头痛、嗜睡、呕吐、咳嗽、意识混乱，严重的昏迷、死亡。3.2
逆转录聚合酶链反应reversetranscriptionpolymerasechainreaction；RT-PCR将RNA的逆转录（RT)和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR)相结合的技术。本标准采用一步法逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）。在一步法RT-PCR中，首先以RNA为模板，利用下游特异性引物在依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）的作用下转录合成互补DNA（cDNA），该步称作“逆转录”：随后，再以cDNA为模板，利用上游和下游特异性引物，在DNA聚合酶的作用下进行PCR循环扩增；最终使RNA分子的某个特定区域（目的片段）被扩增达几百万倍。1
SN/T 3954-2014
实时荧光 RT-PCRreal-time fluorescence RT-PCR通过荧光染料或荧光标记的特异性荧光探针，对反转录后FCR扩增的产物进行标记跟踪，利用炭光信号累积实现实时在线监测整个PCR反应过程，结合相应的软件可以对结果进行定性和定量分析。本标准所采用的荧光探针是 TagMan水解探针。该探针为一段寡核背酸分子，在5’端和3’端分别标记荧光报告基团（如FAM)和荧光率灭基团（如TAMRA）。该探针可与PCR产物发生特异性杂交。当探针保持完整时，率灭基团抑制报告基团的荧光发射。在PCR扩增时，利用Tu4酶的5\→3'外切酶活性将探针酶切水解，使荧光报告基团和荧光灭基闭分离，距离变大，萍灭作用被解除，荧光信号释放出来并被仪器的荧光探测系统检测到，模板每复制一次：就有一条探针被切断：伴随个费光信号的放,从而实现荧光信号的累积与PCR产物的数量完全同步。3.4
Cl 值 cyele threshold
在荧光PCR中，每个反应管内的荧光信号到达设定的阔值时所经历的循环数。4缩略语
下列缩略诺适用于本文件，
4.1DEPC.diethylpyrocarbonate,焦碳酸=。4.2PAGE+polyacrylamidegel electrophoresis，聚丙烯酰胺凝胶电泳4.3HPLC.highpeiformenceliquid chromatography.高效液相色谱，4.4bp:base pair,碱基对。
4.5FAM:6-carboxy-fluoresccin，6-羧基-荧光素·一种荧光报告基闭。4.6TAMPA:carboxylctramcthylrhodamine.羧基四甲基罗丹明。5检测对象
5.1国境11岸伴发热的尼帕病毒感染的病例或疑似病例。5.2其他申请检验的人员。
生物安全和 PCR防污染要求Www.bzxZ.net
实验室生物安全应符合GB19489的规定。按照原中华人民共和国卫生部制定的《人间传染的病原微生物名录\的规定操作相应的试验材料，未经培养的感染材料的操作在BSL-3 生物安全实验空内进行，面在BSL·2生物安全实验率内可操作灭活的材料，PCR防污染措施按WS/T239和SN/T1193的规定执行。
7主要仪器
7.1二级B型生物安全柜。
7.2台式高速冷冻离心机（最高离心力12000g以上）7.3旋涡振荡器。
7.4冰箱:4 ℃、-20 ℃和-70 。7.5超净工作台，
-TKAONKAca
7.6微型离心机，
7.7PCR热循环仪。
7.8 荧光 PCR仪。
7.9 电子天平(d=1 mg)。
7.10微波炉，
7.11电泳仪。
凝胶成像分析系统。
高压火菌锅。
超纯水器或双蒸水器。
SN/T 3954—2014
微量可调移液器一套（含以下5种规格：10ml、20μl、100μL.200μL，1mL)。主要试剂
8.1无 RNA 酶的 DEPC 水,
8.2引物和探针：RT-PCR引物应为PAGE以上级别纯化，探针为HPLC纯化，引物和操针序列见9.2.4.1和 9.2.5.1.
步法RT-PCR 基础试剂：宝生物工程（大连）有限公司 PrimeScript One Step RT-PCR Kit8.3
8.4-步法荧光RT-PCR基础试剂：宝生物工程(大连)有限公可neStepPrimeScriptRT-PCRKit(Perfert Real Tirle)!
8.5电泳缓池液（10×TBE）：称取108Tris碱.7.44gNaEDTA·H和55g硼酸，溶于800mL的双蒸水中，充分揽拌溶解后加水定容至1L.室温保存。8.6溴化乙锭（ER）：10mg/tnL，使用浓度为0.5μg/mlB.7GoldenVicw核酸染料：使用浓度为5pL/100rnL。9检验程序
9.1样品的采集保存和运送
采集发热的疑似病人或患者的临床标本，包括血液，脑脊液、咽拭了等，如是血浆不宜使用肝素抗凝。样品的运送过程宜在0℃以下进行。样品的保存和运输的生物安全要求参照原卫生部颁布的《人间传染的病原微生物菌（毒）种保藏机构管理办法》和《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》。
9.2实验室检验
9.2.1样品处理
血液样本直接分离血清或血浆。脑脊液样本苔先在4℃以30001/min离心10min.小心吸弃上层液体，保留约250uL上清，并用其重悬细胞沉淀。咽拭子样本直接进行病毒核酸提取。不能立即进行检验时,样本冻存于一70 ℃超低温冰箱备用。1）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可和推荐，如果其他等效产品具有相同的效果,则可使用这些等效产品。
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病毒核酸提取
9.2.2.1Trizol法
取9.2.1处理好的样本150μl.加人750μLTrizol液，振荡混匀后室温静置5min，然后加人200处三氯甲烷，盖紧离心管，振荡混匀15后室温静置5min.4℃12000r/min离心10min，取上层水相至另一离心管中，加人等量异丙醇沉淀RNA，充分混勾后室温放置10min，12000r/min离心10min，充上清液，再加人1mL的70%乙醇洗涤1次，12000r/min离心5min，弃上清液，室温放置2min~3min，马上加入20μL~~50μL无RNA酶的DEPC水（或其他核酸溶解液）溶解沉淀，即为RNA模板，用于RT-PCR扩增。分装后保存在一70℃备用9.2.2.2试剂盒提取纯化核酸法
按适用于病毒基因组提取的商品试剂盒说明书操作9.2.3阳性对照、阴性对照和空白对照设置检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照为尼帕病毒核酸或根据尼帕病毒核苷酸序列通过基因合成、载体构建和体外转录合成的RNA（见附录A），阴性对照可选择其他种类病毒的核酸样本，空白对照用无菌水作为RT-PCR和实时荧光RT-PCR反应的模板。9.2.4普通RT-PCR检测
9.2.4.1检测引物
引物应用液浓度配制成20umol/L，扩增片段大小292bp.序列如下：NiV-FI:5'-TAGAAATAATCTCAGAOATCGGAAA-3'NiV-RI.5'-CCCATAGACCTGTCAATAGTAGTAGC-3注：其他等效商品试剂盒也可使用反应体系组成
步法RTPCR反应体系采用以下参数：2XonestepRT-PCR缓冲液10uL；引物NiV-F1和NiV-R1各1.0μL;RT-PCREnzymeMix（含逆转录酶和Taq7.0μL;加无RNA酶的水补足至20μL9.2.4.3反应条件
DNA聚合酶）1.0uL，RNA模板5.0uL~一步法RT-PCR反应条件：50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃变性30555℃退火305，72℃延伸405，40个循环，72℃延伸7min4℃保温。因不同PCR仪器的性能差异，可根据条件适当调整PCR退火温度和时间。
9.2.4.4琼脂糖凝胶电泳
用0.5XTBE电泳缓冲液配制2.0%（质量分数）的琼脂糖凝胶（含溴化乙锭或GoldenVicw或其他等效核酸染料）。将琼脂糖凝胶放人水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好没胶面。取5L普通RT-PCR扩增产物和1L上样缓冲液混匀后加入糖凝胶的样品孔。在电泳时设立DNA标准分子量作对照，使用100bpDNA分子量标准。按8V/cm的电压条件电泳约30min～40min。采用凝胶成像分析系统观察核酸条带并判断结果。
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9.2.5实时荧光RT-PCR方法
9.2.5.1检测引物和探针
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引物应用液浓度配制成20μmol/L，扩增片段大小131bp。探针应用液浓度配制成20μmol/L，探针的5和3端分别用FAM和TAMRA标记。引物和探针的序列如下：
NiV-F2:5-CATCAGCAGGAAGGCAAGAGAGTA-3NiV-R2.5-CTGTCTGCCACTCTGYTCTATAGGT-3'NiV-P:5*-FAM-ACTGCCTCCAATGAGCACACCTCCTGC-TAMRA-3注：简并碱基Y为C或T。
9.2.5.2反应体系组成
一步法实时荧光RT-PCR反应体系采用以下参数：2XOneStepRT-PCR缓冲液Ⅲ（含dNTP和Mg+等)12.5μL;引物NiV-F20.7μL:引物NV-R20.6μL探针NiV-P0.4μL;TaKaRaExTaqHS(5U/μL)0.5μL;PrimeScriptRTEnzymeMix0.5uL;RNA模板5.0μL；加水补足至25μL9.2.5.3反应条件
一步法实时荧光RT-PCR反应条件：42℃反转录10min：95℃预变性30s；95℃变性6s.55℃退火35s，72℃延伸15S.45个循环：选择FAM通道于55℃退火时收集荧光信号。不同实验室可根据所使用的试剂和仪器参考上述反应条件作适当调整。9.2.6结果判定及报告
9.2.6.1普通RT-PCR方法结果的判定当阳性对照出现目的片段条带，而阴性对照和空白对照没有任何核酸条带出现时才可对样本进行结果判定及报告，否则视为试验失败，需重新试验本方法检验结果判定及报告如下检测样本出现292bp条带时：报告\检出尼帕病特异性基因（RT-PCR法，292bp）\；检测样本未出现292bp条带时，报告未检出尼帕病毒特异性基因（RT-PCR法，292bp）”。9.2.6.2实时荧光RT-PCR方法结果的判定在实时荧光RT-PCR试验中，若阳性对照有明显的荧光增幅现象，且Ct值在预期的范围之内（≤30)；阴性对照和空白对照无荧光增幅现象，则表明反应体系运行正常，可以进行结果判定，否则，试验视为无效，需重新试验。
当同时进行的阳性、阴性和空白对照试验结果正常，本方法检验结果判定及报告如下：检测样品有明显的荧光增幅曲线，且Ct值≤35时，判为阳性，报告“检出尼帕病毒特异性基因（实时荧光RT-PCR法）”。
检测样品荧光增幅曲线的Ct值介于35和40之间时，应重新进行实时荧光RT-PCR检测。若重新检测的Ct值仍介于35和40之间，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性，报告检出尼帕病毒特兄性基因（实时荧光RT-PCR法）”，否则判为阴性，报告“未检出尼帕病毒特异性基因（实时荧光RT-PCR法）”。检测样品荧光增幅曲线的Ct值介于40和45之间时，建议采用浓缩方式处理核酸样本，再重新进行实时荧光RT-PCR检测。若重新检测的Ct值有明显减少趋势，且曲线有明显的对数增长5
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期,判为阳性,报告\检出尼帕病毒特异性基因(实时荧光RT-P(法)”。此类样本建议用其他方法进一步验证否则判为阴性，报告“末检出尼帕病毒特异性基因（实时荧光RT-PCR法）”。检测样品无荧光增幅现象，判为阴性，报告\末检出尼帕病毒特异性基因(实时荧光RT-P(次法)\3测序（可选择）
对于检测阳性的样本可切下电泳分析的目的条带，用凝胶向收试剂盒向收纯化（按其说明·行进行）全自动遗传分析仪进行测序，确认病毒基因序列，也可进一步分析病毒基因的变异情况。6
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附录A
（规范性附录）
尼帕病毒阳性对照基因合成序列及GenBank参考序刻编号尼帕病毒GenBank参考序列编号：A.i564621.。阳性对照基因合成序列：
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