SN/T 3953-2014
基本信息
标准号： SN/T 3953-2014
中文名称：国境口岸轮状病毒(A组)、诺如病毒、星状病毒的多重RT-PCR检测方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.zip .pdf
下载大小：1704486
相关标签： 国境 口岸 轮状病毒 诺如 病毒 多重 PCR 检测 方法
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3953-2014.Detection of rotavirus( group A)，norovirus and astrovirus by multiple RT-PCR at frontier port.
1范围
SN/T 3953规定了国境口岸轮状病毒(A组)、诺如病毒、星状病毒多重RT-PCR检测的对象、检测方法及结果报告。
SN/T 3953适用于国境口岸轮状病毒(A组)、诺如病毒、星状病毒的实验室检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安全通用要求
SN/T 1193基因检验实验 室技术要求
SN/T1720出人境口岸轮状病毒感染监测规程
WS/T230临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1轮状病毒rotavirus
属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)轮状病毒属(Rotavirus),为双链RNA病毒,基因组分11个节段，是引起人类、哺乳动物类和鸟类腹泻的主要病原体。轮状病毒有7个血清组(A~G),其中A.B、C组能引起人和动物腹泻,以A组最常见，它是婴幼儿腹泻首要的致病原。
3.2诺如病毒Norovirus
诺瓦克样病毒Norwalk-like viruses;NLV
诺沃克样病毒Norwalk-like viruses ;NLV
属于杯状病毒科(Caliciviridae)诺如病毒属(Norovirus),为单股正链RNA病毒,是引起成人和婴幼儿急性非细菌性胃肠炎的重要病原体,全世界范围内均有流行,全年均可发生感染。诺如病毒原称为诺瓦克样病毒或诺沃克样病毒(Norwalk-like viruses, NLV),诺瓦克病毒(Norwalk virus,NV)是这 组病毒的代表种,2002年第8届国际病毒分类委员会将其正式命名为Norovirus,我国按照音译称为诺如病毒。
1范围
SN/T 3953规定了国境口岸轮状病毒(A组)、诺如病毒、星状病毒多重RT-PCR检测的对象、检测方法及结果报告。
SN/T 3953适用于国境口岸轮状病毒(A组)、诺如病毒、星状病毒的实验室检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安全通用要求
SN/T 1193基因检验实验 室技术要求
SN/T1720出人境口岸轮状病毒感染监测规程
WS/T230临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1轮状病毒rotavirus
属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)轮状病毒属(Rotavirus),为双链RNA病毒,基因组分11个节段，是引起人类、哺乳动物类和鸟类腹泻的主要病原体。轮状病毒有7个血清组(A~G),其中A.B、C组能引起人和动物腹泻,以A组最常见，它是婴幼儿腹泻首要的致病原。
3.2诺如病毒Norovirus
诺瓦克样病毒Norwalk-like viruses;NLV
诺沃克样病毒Norwalk-like viruses ;NLV
属于杯状病毒科(Caliciviridae)诺如病毒属(Norovirus),为单股正链RNA病毒,是引起成人和婴幼儿急性非细菌性胃肠炎的重要病原体,全世界范围内均有流行,全年均可发生感染。诺如病毒原称为诺瓦克样病毒或诺沃克样病毒(Norwalk-like viruses, NLV),诺瓦克病毒(Norwalk virus,NV)是这 组病毒的代表种,2002年第8届国际病毒分类委员会将其正式命名为Norovirus,我国按照音译称为诺如病毒。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3953-2014
国境口岸轮状病毒（A组）、诺如病毒、星状病毒的多重RT-PCR检测方法Delection of rotavirus(group A) ,norovirus and astrovirusby mtltiple RT-PCR at frontier porl2014-04-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-11-01实施
本标准按照（GI3/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3953—2014
本标准起草单位：中华人民共和国珠海出人境检验检疫局、深圳市计量质量检测研究院、中华人民共和国云南出境检验检疫局。
本标准主要起草人：贞秋华、谭华、李卫岗、梁玉英、胡科新、岁忠鑫、史咏梅、杨泽、涂戚宁、祝。I
1范围
国境口岸轮状病毒（A组）诺如病毒星状病毒的多重RT-PCR检测方法SN/T3953—2014
本标准规定了国境口岸轮状病毒（A组）、诺如病毒、星状病毒多重RT-PCR检测的对象、检测方法及结果报告。
本标准适用于国境口岸轮状病毒（A组）诺如病毒星状病毒的实验室检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489
实验室生物安全通用要求
SN/T1193
SN/T1720
WS/T230
3术语和定义
基因检验实验室技术要求
出人境口岸轮状病毒感染监测规程临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用下列术语和定义适用于本文件
轮状病毒
rotavirus
属于呼肠孤病毒科（Reoviridae)轮状病毒属（Rotavirus）为双链RNA病毒，基因组分11个节段
是引起人类、哺乳动物类和鸟类腹泻的主要病原体轮状病毒有
引起人和动物腹泻，以A组最常见它是婴幼儿腹泻首要的致病！3.2
诺如病毒Norovirus
诺瓦克样病毒Norwalk-likeviruses;NLV诺沃克样病毒Norwalk-likeviruses;NLV个血清组(AG),其中AB、C组能
属于杯状病毒科（Caliciviridae）诺如病毒属（Norouzrus），为单股正链RNA病毒，是引起成人和婴幼儿急性非细菌性胃肠炎的重要病原体，全世界范围内均有流行，全年均可发生感染。诺如病毒原称为诺瓦克样病毒或诺沃克样病毒（Norwalk-likeviruses，NLV），诺瓦克病毒（Norwalkvirus，NV）是这组病毒的代表种，2002年第8届国际病毒分类委员会将其正式命名为Norovirus，我国按照音译称为诺如病毒。
星状病毒Astrovirus
属于星状病毒科（Astroviridae）哺乳类星状病毒属（Mamastrouirus），为单股止链RNA病毒，是引起婴幼儿腹泻的重要病原体。
SN/T 3953—2014
逆转录聚合酶链反应reverse transtription polyerase chain reactiun RT-PCF将RNA的逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR)相结合的技术。木标准采用步法逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR）。在一步法RT-PCR中，苷先以RNA为模板，利用下游特异性引物，在依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）的作用下转录合成万补NA（cDNA），该步称作\逆转录”随后，再以cDNA为模板，利用上游和下游特异性引物，在DNA聚合酶的作用下进行PCR循怀扩增；最终便RNA分子的某个特定区域（口的片段)被扩增达几百万倍。3.5
相同标签辅助-无引物二聚体homo-tagassistednon-dimer;lAND采用同源加尾的方式，即在上游引物和下游物的5末端分别加上相同的标签岸列，利用标签序列作为通用引物扩增电特异性引物产生的PCR片段，从而能有效地抑制引物二聚体的产生，减小多重PCR体系中各基因间扩增效率的差异，提高多重PCR的稳定性、均一性和扩增效率。HAND系统又可译为同源加尾系统。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
4.1T)FPC：diethylpyrocarbonate，焦碳酸乙二酯，4.2PAGE:polyacrylamidegelclcetrophoresis，聚丙烯酰胺凝胶电泳。4.3bp:basc pair,基对。
5检测对象
5.1国境口岸发现的有呕吐、腹泻和发热等症状，疑似腹泻病毒感染的急性肠胃炎病人。5.2其他中请检验的人员，
6生物安全和PCK防污染要求
实验室生物安全应符合GB19489的规定。PCR防污染措施按WS/T230和SN/T1193的规定执行。
7主要仪器
7.1二级B型生物安全柜。
7.2台式高速冷冻离心机（最高离心力12000以上）。7.3旋涡振荡器。
7.4冰箱：4℃、—20℃和—70℃。7.5超净工作台。
7.6微型离心机。
7.7PCR热循环仪。
7.8电子天平(d=1 mg）
7.9微波炉。
fKAONiKAca
7.10电泳仪。
7.11凝胶成像分析系统。
7.12高压灭菌锅。
7.13超纯水器或双蒸水器
SN/T 3953--2014
7.14 微量可调移液器 --套(含以下 5种规格:[) μT.,20 μL、1U0 μl.、200 μl.1 mL)。8主要试剂
8.1无RNA酶的 DEPC水。
8.2RT-PCR引物应为PAGE以上级别纯化,引物序列见 9.2.3.1。8.3一步法 RT-PCR 基础试剂:宝生物工程(大连)有限公司 PrineScript One Siep RT PCR Kitl。8.4 电泳缓冲液(10× TBE);称取 108 g Iris 碱.7.44 g NazEDIA·Hz0 和 55 g 硼酸,溶于 800) tml.的效蒸水中，充分搅拌溶解后加水定容率1L，室温保存。8.5澳化乙锭（EB）：10mg/mL使用浓度为0.5μg/ml5GoldenView核酸染料：使用浓度为5μL/1o0 mL。8.6
9检验程序
样品采集
樊便标本和呕吐物标本的采集按照SN/T1720执行。9.2
实验室检验
9.2.1样品处理
取黄臣大小约100mg-200mg的粪便标本或呕吐物，或100uL～200μL水样便，加人800μ1的生理盐水,刷烈振荡混勺,制成10%～20%的悬液：然后 4℃.,8000 r/min离心5min;转移上清至灭菌的下净离心管。不能立即进行检测时，样本冻存于一70℃超低温冰箱备用。9.2.2病毒核酸提取
9,2,2,1Trizol 法
取 9.2.1处理好的样本 150 μL,加人 750 μL Trizul 液，掘荡混勾后室温静置 5 rnin,然后加入200 μl.三氧甲烷,盖紧离心管，振荡混勾 15 s后室温静置 5 min,4 ℃,12 000 r/min离心10 min,取上层水相至另一离心管中,加入等量异丙醇沉淀RNA，充分混匀后室温放置 0 min，12 000 I/min 离心10 min,弃上清液,再加人 1 mL的70%乙醇洗涤一次,12 000 r/min离心5min,弃上清液，室温放置2 min~～3 min 后加入 20 ul_～50 μL DEPC 水(或其他核酸游解液)溶解核酸沉淀,分装后于 -70 C:条件下保存，备用。
试剂盒提取纯化核酸法
按适用于病毒基因组提取的商品试剂盒说明书操作。1）给出这一信息是为「方使本标准的使用者·并不表示对该产品的认可和推荐。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。3
TKAONIKAca
SN/T3953—2014
多重RT-PCR检测
9.2.3.1引物
采用HAND系统设计引物，引物应用液浓度配制成20umol/L，序列分别如下：a）轮状病毒（A组）引物（扩增片段大小186bp）：RotaVP6-FP5-ggggtcccaaaagggteagiTGTGAATCAGTRCTTGCSGA-3\;RotaVP6-RP：5'-ggggtcccaaaagggtcagtTCYCTVGATGGTGAATAGTTAGTRAT-3。b）诺如病毒引物（扩增片段大小376bp）：NLV-FP.5-ggggtcco
TGATGCAGAYTA-3':
-NLV-RP:5'-ggggtcccaaaagggtcagICAATTTCATCATCACCATARAARGA-3'c）星状病毒引物（扩增片段大小27ebp）：AstV-FP.5'-ggggtcccaaaagggtcagtACYIGATTYGAGATCCGTGA-3';
-AstV-RP:5-ggggtccaaaagggtcagtACRACATGTCTGCTGTTACT-3'。d）通用引物：
RNA-P20.5*-ggggtccc
igggtcagt
注：简并碱基中R为A或GS为G或GY为C或V为A或C或9.2.3.2阳性对照和空白对照设置检测过程中分别设阳性对照和空白对照。阳性对照为3种病毒阳性样木核酸的混合物，或者为克隆轮状病毒（A组）、诺如病毒和星状病毒的部分核苷酸序列（应包含扩增区域在内）在体外转录合成的PCR反应的模板。
RNA；空白对照用无菌水作为多重RT9.2.3.3反应体系组成
步法多重RT-PCR反立体系
采用以
2Xone step RTF
PCR缓冲液10uL，引物RotaVP6
下参数2
FP和RotaVP6-RP各0.25
L引物NLV-FP和NLV-RP各0.1
uL，引物AstV-FP和AstV-RP各
0.12uL：通用引物RVA-P20bzxZ.net
PcREnzymeMix（含逆转录酶和TagDNA聚合酶）1.OuL，最L5uL:RT
后加RNA模板6.56uL，使反应总体积为20ML9.2.3.4反应条件
一步法多重RT-PCR反应条件：50℃反转录30min；94℃预变性3min：94℃变性30s，56℃退火30s.72℃延伸40s，40个循环；72℃延伸7min；4℃保温。因不同PCR仪器的性能差异，可根据条件优化适当调整PCR退火温度和时间。9.2.3.5琼脂糖凝胶电泳
用0.5×TBE电泳缓冲液制备2.0%（质量分数）的琼脂糖凝胶平板（含0.5μg/mL溴化乙锭或GoldenView或其他等效染料）。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。取5μL多重RT-PCR扩增产物和1uL上样缓冲液混勾后加人样品孔。在电泳时设立DNA标准分了量作对照，推荐使用100bpDNA分子量标准。按8V/cm的电压条件电泳约30tmin~40min。采用凝胶成像分析系统观察核酸条带并判断结果。4
-rrKAoNikAca
检验缩果判斯及报告
SN/T 3953--2014
当阳性对照出现3条日的片段条带，而空白对照没有任何核酸条带出现时才可对样本进行结果判断及报告，否则视为试验失败,需重新试验。本标准检验结果判断及报先如下：检验样本出现186 bap条带时,报告“检出轮状病毒(A组)特异性基因(Rr-PCR法，186 bp)\检验样木出现376 hp 条带时,报告*检山诺如病毒特异性基因（RT-PCR法,376 bp)\；h)
检验样本出现 270 bp条带时,报告\检出量状病毒特异性基因(RT-PCR 法,27U bp)\;c
检验样本未出现何条带时,报告\未检出轮状病(A组)、诺如病毒,垦状病毒特异性基因d
(RT-PCR法）”，
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国境口岸轮状病毒（A组）、诺如病毒、星状病毒的多重RT-PCR检测方法Delection of rotavirus(group A) ,norovirus and astrovirusby mtltiple RT-PCR at frontier porl2014-04-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-11-01实施
本标准按照（GI3/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3953—2014
本标准起草单位：中华人民共和国珠海出人境检验检疫局、深圳市计量质量检测研究院、中华人民共和国云南出境检验检疫局。
本标准主要起草人：贞秋华、谭华、李卫岗、梁玉英、胡科新、岁忠鑫、史咏梅、杨泽、涂戚宁、祝。I
1范围
国境口岸轮状病毒（A组）诺如病毒星状病毒的多重RT-PCR检测方法SN/T3953—2014
本标准规定了国境口岸轮状病毒（A组）、诺如病毒、星状病毒多重RT-PCR检测的对象、检测方法及结果报告。
本标准适用于国境口岸轮状病毒（A组）诺如病毒星状病毒的实验室检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489
实验室生物安全通用要求
SN/T1193
SN/T1720
WS/T230
3术语和定义
基因检验实验室技术要求
出人境口岸轮状病毒感染监测规程临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用下列术语和定义适用于本文件
轮状病毒
rotavirus
属于呼肠孤病毒科（Reoviridae)轮状病毒属（Rotavirus）为双链RNA病毒，基因组分11个节段
是引起人类、哺乳动物类和鸟类腹泻的主要病原体轮状病毒有
引起人和动物腹泻，以A组最常见它是婴幼儿腹泻首要的致病！3.2
诺如病毒Norovirus
诺瓦克样病毒Norwalk-likeviruses;NLV诺沃克样病毒Norwalk-likeviruses;NLV个血清组(AG),其中AB、C组能
属于杯状病毒科（Caliciviridae）诺如病毒属（Norouzrus），为单股正链RNA病毒，是引起成人和婴幼儿急性非细菌性胃肠炎的重要病原体，全世界范围内均有流行，全年均可发生感染。诺如病毒原称为诺瓦克样病毒或诺沃克样病毒（Norwalk-likeviruses，NLV），诺瓦克病毒（Norwalkvirus，NV）是这组病毒的代表种，2002年第8届国际病毒分类委员会将其正式命名为Norovirus，我国按照音译称为诺如病毒。
星状病毒Astrovirus
属于星状病毒科（Astroviridae）哺乳类星状病毒属（Mamastrouirus），为单股止链RNA病毒，是引起婴幼儿腹泻的重要病原体。
SN/T 3953—2014
逆转录聚合酶链反应reverse transtription polyerase chain reactiun RT-PCF将RNA的逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR)相结合的技术。木标准采用步法逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR）。在一步法RT-PCR中，苷先以RNA为模板，利用下游特异性引物，在依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）的作用下转录合成万补NA（cDNA），该步称作\逆转录”随后，再以cDNA为模板，利用上游和下游特异性引物，在DNA聚合酶的作用下进行PCR循怀扩增；最终便RNA分子的某个特定区域（口的片段)被扩增达几百万倍。3.5
相同标签辅助-无引物二聚体homo-tagassistednon-dimer;lAND采用同源加尾的方式，即在上游引物和下游物的5末端分别加上相同的标签岸列，利用标签序列作为通用引物扩增电特异性引物产生的PCR片段，从而能有效地抑制引物二聚体的产生，减小多重PCR体系中各基因间扩增效率的差异，提高多重PCR的稳定性、均一性和扩增效率。HAND系统又可译为同源加尾系统。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
4.1T)FPC：diethylpyrocarbonate，焦碳酸乙二酯，4.2PAGE:polyacrylamidegelclcetrophoresis，聚丙烯酰胺凝胶电泳。4.3bp:basc pair,基对。
5检测对象
5.1国境口岸发现的有呕吐、腹泻和发热等症状，疑似腹泻病毒感染的急性肠胃炎病人。5.2其他中请检验的人员，
6生物安全和PCK防污染要求
实验室生物安全应符合GB19489的规定。PCR防污染措施按WS/T230和SN/T1193的规定执行。
7主要仪器
7.1二级B型生物安全柜。
7.2台式高速冷冻离心机（最高离心力12000以上）。7.3旋涡振荡器。
7.4冰箱：4℃、—20℃和—70℃。7.5超净工作台。
7.6微型离心机。
7.7PCR热循环仪。
7.8电子天平(d=1 mg）
7.9微波炉。
fKAONiKAca
7.10电泳仪。
7.11凝胶成像分析系统。
7.12高压灭菌锅。
7.13超纯水器或双蒸水器
SN/T 3953--2014
7.14 微量可调移液器 --套(含以下 5种规格:[) μT.,20 μL、1U0 μl.、200 μl.1 mL)。8主要试剂
8.1无RNA酶的 DEPC水。
8.2RT-PCR引物应为PAGE以上级别纯化,引物序列见 9.2.3.1。8.3一步法 RT-PCR 基础试剂:宝生物工程(大连)有限公司 PrineScript One Siep RT PCR Kitl。8.4 电泳缓冲液(10× TBE);称取 108 g Iris 碱.7.44 g NazEDIA·Hz0 和 55 g 硼酸,溶于 800) tml.的效蒸水中，充分搅拌溶解后加水定容率1L，室温保存。8.5澳化乙锭（EB）：10mg/mL使用浓度为0.5μg/ml5GoldenView核酸染料：使用浓度为5μL/1o0 mL。8.6
9检验程序
样品采集
樊便标本和呕吐物标本的采集按照SN/T1720执行。9.2
实验室检验
9.2.1样品处理
取黄臣大小约100mg-200mg的粪便标本或呕吐物，或100uL～200μL水样便，加人800μ1的生理盐水,刷烈振荡混勺,制成10%～20%的悬液：然后 4℃.,8000 r/min离心5min;转移上清至灭菌的下净离心管。不能立即进行检测时，样本冻存于一70℃超低温冰箱备用。9.2.2病毒核酸提取
9,2,2,1Trizol 法
取 9.2.1处理好的样本 150 μL,加人 750 μL Trizul 液，掘荡混勾后室温静置 5 rnin,然后加入200 μl.三氧甲烷,盖紧离心管，振荡混勾 15 s后室温静置 5 min,4 ℃,12 000 r/min离心10 min,取上层水相至另一离心管中,加入等量异丙醇沉淀RNA，充分混匀后室温放置 0 min，12 000 I/min 离心10 min,弃上清液,再加人 1 mL的70%乙醇洗涤一次,12 000 r/min离心5min,弃上清液，室温放置2 min~～3 min 后加入 20 ul_～50 μL DEPC 水(或其他核酸游解液)溶解核酸沉淀,分装后于 -70 C:条件下保存，备用。
试剂盒提取纯化核酸法
按适用于病毒基因组提取的商品试剂盒说明书操作。1）给出这一信息是为「方使本标准的使用者·并不表示对该产品的认可和推荐。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。3
TKAONIKAca
SN/T3953—2014
多重RT-PCR检测
9.2.3.1引物
采用HAND系统设计引物，引物应用液浓度配制成20umol/L，序列分别如下：a）轮状病毒（A组）引物（扩增片段大小186bp）：RotaVP6-FP5-ggggtcccaaaagggteagiTGTGAATCAGTRCTTGCSGA-3\;RotaVP6-RP：5'-ggggtcccaaaagggtcagtTCYCTVGATGGTGAATAGTTAGTRAT-3。b）诺如病毒引物（扩增片段大小376bp）：NLV-FP.5-ggggtcco
TGATGCAGAYTA-3':
-NLV-RP:5'-ggggtcccaaaagggtcagICAATTTCATCATCACCATARAARGA-3'c）星状病毒引物（扩增片段大小27ebp）：AstV-FP.5'-ggggtcccaaaagggtcagtACYIGATTYGAGATCCGTGA-3';
-AstV-RP:5-ggggtccaaaagggtcagtACRACATGTCTGCTGTTACT-3'。d）通用引物：
RNA-P20.5*-ggggtccc
igggtcagt
注：简并碱基中R为A或GS为G或GY为C或V为A或C或9.2.3.2阳性对照和空白对照设置检测过程中分别设阳性对照和空白对照。阳性对照为3种病毒阳性样木核酸的混合物，或者为克隆轮状病毒（A组）、诺如病毒和星状病毒的部分核苷酸序列（应包含扩增区域在内）在体外转录合成的PCR反应的模板。
RNA；空白对照用无菌水作为多重RT9.2.3.3反应体系组成
步法多重RT-PCR反立体系
采用以
2Xone step RTF
PCR缓冲液10uL，引物RotaVP6
下参数2
FP和RotaVP6-RP各0.25
L引物NLV-FP和NLV-RP各0.1
uL，引物AstV-FP和AstV-RP各
0.12uL：通用引物RVA-P20bzxZ.net
PcREnzymeMix（含逆转录酶和TagDNA聚合酶）1.OuL，最L5uL:RT
后加RNA模板6.56uL，使反应总体积为20ML9.2.3.4反应条件
一步法多重RT-PCR反应条件：50℃反转录30min；94℃预变性3min：94℃变性30s，56℃退火30s.72℃延伸40s，40个循环；72℃延伸7min；4℃保温。因不同PCR仪器的性能差异，可根据条件优化适当调整PCR退火温度和时间。9.2.3.5琼脂糖凝胶电泳
用0.5×TBE电泳缓冲液制备2.0%（质量分数）的琼脂糖凝胶平板（含0.5μg/mL溴化乙锭或GoldenView或其他等效染料）。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。取5μL多重RT-PCR扩增产物和1uL上样缓冲液混勾后加人样品孔。在电泳时设立DNA标准分了量作对照，推荐使用100bpDNA分子量标准。按8V/cm的电压条件电泳约30tmin~40min。采用凝胶成像分析系统观察核酸条带并判断结果。4
-rrKAoNikAca
检验缩果判斯及报告
SN/T 3953--2014
当阳性对照出现3条日的片段条带，而空白对照没有任何核酸条带出现时才可对样本进行结果判断及报告，否则视为试验失败,需重新试验。本标准检验结果判断及报先如下：检验样本出现186 bap条带时,报告“检出轮状病毒(A组)特异性基因(Rr-PCR法，186 bp)\检验样木出现376 hp 条带时,报告*检山诺如病毒特异性基因（RT-PCR法,376 bp)\；h)
检验样本出现 270 bp条带时,报告\检出量状病毒特异性基因(RT-PCR 法,27U bp)\;c
检验样本未出现何条带时,报告\未检出轮状病(A组)、诺如病毒,垦状病毒特异性基因d
(RT-PCR法）”，
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