SN/T 3952-2014
基本信息
标准号： SN/T 3952-2014
中文名称：国境口岸甲型流感病毒检测方法 Dot-ELISA法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3952-2014.Detection of influenza A virus at frontier port-Dot-ELISA.
1范围
SN/T 3952规定了甲型流感病毒的术语和定义、生物安全防护要求、样本的采集与处理、酶联免疫渗滤法的检测步骤、结果判定、检测报告与阳性结果的处置。
SN/T 3952适用于在国境口岸对人感染甲型流感病毒的检测。
2规范性引用 文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安 全通用要求
SN/T 2752.1卫生 检疫人员的自我防护规范
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1甲型流感病毒influenza Avirus
甲型流感病毒归属于正粘病毒科( Drthamyxoviridae)是一种球形或杆状、有包膜的单股负链RNA病毒。甲型流感病毒可以感染禽类、人和猫等哺乳动物，根据表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性的不同,可将甲型流感病毒分成16个H和9个N亚型。甲型流感病毒可引起急性呼吸道传染病,该病主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触、被污染物品的接触传播。典型的临床症状为迅速发热、浑身酸痛、乏力等。
3.2核蛋白 nucleocapsid ;NP
由甲型流感病毒基因组第5片段编码，含498 个氨基酸，是一种单体磷酸化的非糖基化蛋白,与3种RNA多聚酶一起构成核糖核酸蛋白体(RNPs),RNPs与RNA聚合酶共同构成病毒的核心部分。NP在流感病毒的8个基因中最为保守,具有型特异性,是将流感病毒分为A.B、C三种型的重要依据。
1范围
SN/T 3952规定了甲型流感病毒的术语和定义、生物安全防护要求、样本的采集与处理、酶联免疫渗滤法的检测步骤、结果判定、检测报告与阳性结果的处置。
SN/T 3952适用于在国境口岸对人感染甲型流感病毒的检测。
2规范性引用 文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安 全通用要求
SN/T 2752.1卫生 检疫人员的自我防护规范
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1甲型流感病毒influenza Avirus
甲型流感病毒归属于正粘病毒科( Drthamyxoviridae)是一种球形或杆状、有包膜的单股负链RNA病毒。甲型流感病毒可以感染禽类、人和猫等哺乳动物，根据表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性的不同,可将甲型流感病毒分成16个H和9个N亚型。甲型流感病毒可引起急性呼吸道传染病,该病主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触、被污染物品的接触传播。典型的临床症状为迅速发热、浑身酸痛、乏力等。
3.2核蛋白 nucleocapsid ;NP
由甲型流感病毒基因组第5片段编码，含498 个氨基酸，是一种单体磷酸化的非糖基化蛋白,与3种RNA多聚酶一起构成核糖核酸蛋白体(RNPs),RNPs与RNA聚合酶共同构成病毒的核心部分。NP在流感病毒的8个基因中最为保守,具有型特异性,是将流感病毒分为A.B、C三种型的重要依据。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3952-2014
国境口岸甲型流感病毒检测方法Dot-ELISA 法
Detection of influenza A virus at frontier port-Dot-ELISA2014-04-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-11-01实施
本标按照GB/I 1.1
12009给出的规则起草
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口SN/T3952—2014
本标准起草单位：中华人民共国厦门出人境检验检疫局、厦门大学公共卫生学院。本标准主要起草人：杨坤字、陈慧、吴冰冰、张毅、李庶甘、陈帆、陈教、林青、杨剑，1范围
国境口岸甲型流感病毒检测方法Dot-ELISA法
SN/T3952—2014
本标准规定了甲型流感病毒的术语和定义、生物安全防护要求、样本的采集与处理、酶联免疫渗滤法的检测步骤、结果判定，检测报告与阳性结果的处置。本标准适用于在国境口岸对人感染甲型流感病毒的检测2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仪注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求SN/T2752.1卫生检疫人员的自我防护规池3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
甲型流感病毒
influenzaA
甲型流感病毒归属于正粘病毒科（Orthomyxoviri种球形或杆状、有包膜的单股负链RNA病毒。甲型流感病毒可以感染窝炎、人和猫等哺乳动物根据表面糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）抗原性的不同，可将甲型流个N业型。甲型流感病毒可引起急性呼感病毒分成16
个H和9
吸道传染病，该病主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触被污染物品的接触传播。典型的临床症状为迅速发热、浑身酸痛、乏力等3.2
核蛋白nucleocapsid：NP
由甲型流感病毒基因组第5片段编码含498个氨基酸，是一种单体磷酸化的非糖基化蛋白，与3种RNA多聚酶一起构成核糖核酸蛋白体（RNPs），RNPs与RNA聚合酶共同构成病毒的核心部分。NP在流感病毒的8个基因中最为保守，具有型特异性，是将流感病毒分为AB、C三种型的重要依据。3.3
酶联免疫渗滤法dot-enzymelinkedimmunosorbnentassaydot-ELISA甲型流感酶联免疫渗滤法采用酶联免疫原理中的双抗体夹心法和免疫渗滤技术，用于检测样本中的甲型流感病毒核蛋白NP抗原。在硝酸红维膜上包被抗NP抗原的单克隆抗体，待测样本经裂解液处理后，被硝酸纤维膜上的单克隆抗体捕获，形成抗原-抗体复合物，再加入抗NP抗原的酶标抗体，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，最后通过酶催化底物显色进行结果判定。4生物安全防护要求
现场采样人员的个人防护应符合SN/T2752.1的要求，实验室结构和设施、安全操作规范、安全设1
SN/T3952—2014
备、试验人员防护及废弃物品处埋应符合GB19189中二级生物安全防扩实验空的要求，5检测对象
疑似感染流感病毒的入出境旅客及国际航行交通工具员工国境口岸现场的丁作人员及其他中请测人员。
6材料与试剂
6.1仪器和耗材
振荡器、可调式微量如样器，普通冰箱（2℃～8℃）、超低温冰箱（-70℃)、压舌板、带有聚闪烯纤维头的采样拭了、与可调式微量排样器配套使用的滤心吸头、能装2mL液体的尖嘴塑料过滤瓶。6.2试剂
Hank=液、裂解液、反应板、标木洗涤液、酶标试剂、显色液、终止液等检测所需的各种试剂的准备参见附录A。除刃有规定外，所有化学试剂均采用分析纯。7标本的菜集、处理与转运
7.1标本的采集
7.1.1咽拭子：嘱受采集人员发“啊”音，必要时以压舌板轻压否部，用带有聚丙烯纤维头的子适度用力擦拭双侧扇桃体及咽后壁.成避免触及舌部。将拭子折断，弃去于接触部分，将带医用棉签的部分浸泡至 1 mL-~2 mL, 的Hank's 液体中在标本保存管上标注被采集人员姓名,采集时问和标本编号7.1.2虽咽拭子：将带有聚丙烯纤维头的子平行于上题插入异孔，使拭子头部深人鼻腔根部，轻轻旋转，保持数砂,待拭于头吸收分泌物以后，缓慢转动退出。将拭子折断·弃去手接触部分，将带有医用棉签的部分浸泡至 1 tml,～-2 mL的Hank液体巾。在标本保存管上标注被采集人员姓名、采集时间和标本编号。
7.2标本的转运与保存
采集标本后,在冷藏条件下(2℃～8℃)由专人运送至实验空。7.3标本的保存
如果标本在2天内检测.可暂时储存于2℃~8℃;如果标本在2天以后检测,保存于一70 ℃以下，标本避免反复冻融。
8实验室检测1
8.1检测前处理
检测前将试剂盒乎衡至室温（约15 tnin）,用振荡器将标本振荡混勾。1）检测过程和结果判定以北京万泰生物药业段份有限公司生产的甲型流感病毒抗原(FlAAg)快速诊断试剂盒为例。给出这，-信息是为方便不标准的使用者·并不表示对这一产品的认可,其地等效市售商品试剂也可采用，燥作时励严格按照试剂盒说明书要求进行：iikoNiKAca
8.2裂解
SN/T3952-—2014
将200uI.待测标本加人标本处理瓶中，再加人400uL裂解液，将瓶盖拧紧,充分混匀。8.3加样
扩开标本处理瓶滴头盖，倒置标本处理瓶，用力挤瓶壁使标本尽可能多地滴人反应板中，待标本完全渗人后（约10min)，摘掉反应板上的盖子。8.4加酶
在反应孔中加人200 μL的酶标试剂,待酶标试剂完全谬人后再反应2 min~3 min。8.5洗涤
在反虚孔中加人350的洗涤液，待体完全渗人后再加人350I.的洗涤液8.6显色
待洗涤液完全渗人后,在反应孔中加人 i00 μl-的显色液,完牟渗人后再反应 2 min-~3 min.8.7终止
在反应孔中加人 50 μL终止液,3 min内观察结果9结果判定
9.1质控点(C)显色,检测点(T)不显色，结果判定为阴性[如图1a)]。9.2质控点（C)显色，检测点（T)也显色，结果判定为阳性[如图1b）9,3质控点（C)不显色，无论检测点（T)显色或不显色，结果均判定为无效[如图1c)、廣控点()
检测点(T)
）阴性图形
b）阳性图形
图 1Dat-ELISA法检测甲型流感病毒抗原的结果示意图10检测报告
结果呈阴性时可报告为“甲型流感病毒抗原阴性一Dot-EI.ISA法\。10.1
10.2结果呈阳性时可报为\甲型流感病毒抗原阳性一DotELISA法”。阳性结果的处置
Dat-E1.ISA法检测为阳性结果的相应标本应做进一步确诊。11.2确诊为阳性结果片应按规定向上级主管部门报告。(）无效围形
-irkoNiKca
SN/T3952—2014
A.1Hank's液
附录A
（资料性附录）
主要试剂
A.1.1甲液：NazHPO.·2H,O0.06g.KH,PO.0.06g,MgSO,·7H.O0.2g.葡葡糖1.0g,NaCI8.0g，去离子水750mL。
A.1.2乙液：CaCl0.14g，去离
高子水100mL
A.1.3应用液：将乙液缓慢加人甲液中.形成A液。在3638
C条件下，将0.35gNaHCO，溶解免费标准下载网bzxz
在100mL去离子水中，形成B液。取3mL～5mL的NaHC溶液溶解0.02g酚红，形成C液。将上述三种液体混合在一起，再用去离子水定容至！000m上，充分混匀，过滤消毒灭菌。2裂解液
将15g十六烷基二甲基漠化铵（hexadecyltrimethylammoniumbromide，CTAB），58.5gNaCl、30mL0.5mol/L乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）溶解至600mL的去离子水中，加人75mL1mol/LTris-HCl(pH=8.0)，用去离子水定容至1000mL，反应板
的单克隆抗体包被反应孔，每孔100ng。用抗重组甲型流感病毒NP蛋白
A.4质控点
包被羊抗鼠多克降抗体，每孔5
A.5酶标试剂
标记辣根过氧化物酶（HRP)的抗重组甲型流感病毒NP蛋白的单克降抗体。A.6标本洗涤液
PBST(20mmol/LNaCl,2.68mmol/LKCl,10mmol/LNa.HPO,1.76mmol/LKH,PO..0.05%吐温-20），使用时稀释20倍。4
-KAoNiKAca
A.7显色液
SN/T3952—2014
3,3\.5,5*-四甲基联举胺（3,3*,5,5\-tctramethylbenzidinc,TMB)膜底物显色液A.8
终止液
2 mol/L H,so,.
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国境口岸甲型流感病毒检测方法Dot-ELISA 法
Detection of influenza A virus at frontier port-Dot-ELISA2014-04-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-11-01实施
本标按照GB/I 1.1
12009给出的规则起草
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口SN/T3952—2014
本标准起草单位：中华人民共国厦门出人境检验检疫局、厦门大学公共卫生学院。本标准主要起草人：杨坤字、陈慧、吴冰冰、张毅、李庶甘、陈帆、陈教、林青、杨剑，1范围
国境口岸甲型流感病毒检测方法Dot-ELISA法
SN/T3952—2014
本标准规定了甲型流感病毒的术语和定义、生物安全防护要求、样本的采集与处理、酶联免疫渗滤法的检测步骤、结果判定，检测报告与阳性结果的处置。本标准适用于在国境口岸对人感染甲型流感病毒的检测2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仪注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求SN/T2752.1卫生检疫人员的自我防护规池3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
甲型流感病毒
influenzaA
甲型流感病毒归属于正粘病毒科（Orthomyxoviri种球形或杆状、有包膜的单股负链RNA病毒。甲型流感病毒可以感染窝炎、人和猫等哺乳动物根据表面糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）抗原性的不同，可将甲型流个N业型。甲型流感病毒可引起急性呼感病毒分成16
个H和9
吸道传染病，该病主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触被污染物品的接触传播。典型的临床症状为迅速发热、浑身酸痛、乏力等3.2
核蛋白nucleocapsid：NP
由甲型流感病毒基因组第5片段编码含498个氨基酸，是一种单体磷酸化的非糖基化蛋白，与3种RNA多聚酶一起构成核糖核酸蛋白体（RNPs），RNPs与RNA聚合酶共同构成病毒的核心部分。NP在流感病毒的8个基因中最为保守，具有型特异性，是将流感病毒分为AB、C三种型的重要依据。3.3
酶联免疫渗滤法dot-enzymelinkedimmunosorbnentassaydot-ELISA甲型流感酶联免疫渗滤法采用酶联免疫原理中的双抗体夹心法和免疫渗滤技术，用于检测样本中的甲型流感病毒核蛋白NP抗原。在硝酸红维膜上包被抗NP抗原的单克隆抗体，待测样本经裂解液处理后，被硝酸纤维膜上的单克隆抗体捕获，形成抗原-抗体复合物，再加入抗NP抗原的酶标抗体，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，最后通过酶催化底物显色进行结果判定。4生物安全防护要求
现场采样人员的个人防护应符合SN/T2752.1的要求，实验室结构和设施、安全操作规范、安全设1
SN/T3952—2014
备、试验人员防护及废弃物品处埋应符合GB19189中二级生物安全防扩实验空的要求，5检测对象
疑似感染流感病毒的入出境旅客及国际航行交通工具员工国境口岸现场的丁作人员及其他中请测人员。
6材料与试剂
6.1仪器和耗材
振荡器、可调式微量如样器，普通冰箱（2℃～8℃）、超低温冰箱（-70℃)、压舌板、带有聚闪烯纤维头的采样拭了、与可调式微量排样器配套使用的滤心吸头、能装2mL液体的尖嘴塑料过滤瓶。6.2试剂
Hank=液、裂解液、反应板、标木洗涤液、酶标试剂、显色液、终止液等检测所需的各种试剂的准备参见附录A。除刃有规定外，所有化学试剂均采用分析纯。7标本的菜集、处理与转运
7.1标本的采集
7.1.1咽拭子：嘱受采集人员发“啊”音，必要时以压舌板轻压否部，用带有聚丙烯纤维头的子适度用力擦拭双侧扇桃体及咽后壁.成避免触及舌部。将拭子折断，弃去于接触部分，将带医用棉签的部分浸泡至 1 mL-~2 mL, 的Hank's 液体中在标本保存管上标注被采集人员姓名,采集时问和标本编号7.1.2虽咽拭子：将带有聚丙烯纤维头的子平行于上题插入异孔，使拭子头部深人鼻腔根部，轻轻旋转，保持数砂,待拭于头吸收分泌物以后，缓慢转动退出。将拭子折断·弃去手接触部分，将带有医用棉签的部分浸泡至 1 tml,～-2 mL的Hank液体巾。在标本保存管上标注被采集人员姓名、采集时间和标本编号。
7.2标本的转运与保存
采集标本后,在冷藏条件下(2℃～8℃)由专人运送至实验空。7.3标本的保存
如果标本在2天内检测.可暂时储存于2℃~8℃;如果标本在2天以后检测,保存于一70 ℃以下，标本避免反复冻融。
8实验室检测1
8.1检测前处理
检测前将试剂盒乎衡至室温（约15 tnin）,用振荡器将标本振荡混勾。1）检测过程和结果判定以北京万泰生物药业段份有限公司生产的甲型流感病毒抗原(FlAAg)快速诊断试剂盒为例。给出这，-信息是为方便不标准的使用者·并不表示对这一产品的认可,其地等效市售商品试剂也可采用，燥作时励严格按照试剂盒说明书要求进行：iikoNiKAca
8.2裂解
SN/T3952-—2014
将200uI.待测标本加人标本处理瓶中，再加人400uL裂解液，将瓶盖拧紧,充分混匀。8.3加样
扩开标本处理瓶滴头盖，倒置标本处理瓶，用力挤瓶壁使标本尽可能多地滴人反应板中，待标本完全渗人后（约10min)，摘掉反应板上的盖子。8.4加酶
在反应孔中加人200 μL的酶标试剂,待酶标试剂完全谬人后再反应2 min~3 min。8.5洗涤
在反虚孔中加人350的洗涤液，待体完全渗人后再加人350I.的洗涤液8.6显色
待洗涤液完全渗人后,在反应孔中加人 i00 μl-的显色液,完牟渗人后再反应 2 min-~3 min.8.7终止
在反应孔中加人 50 μL终止液,3 min内观察结果9结果判定
9.1质控点(C)显色,检测点(T)不显色，结果判定为阴性[如图1a)]。9.2质控点（C)显色，检测点（T)也显色，结果判定为阳性[如图1b）9,3质控点（C)不显色，无论检测点（T)显色或不显色，结果均判定为无效[如图1c)、廣控点()
检测点(T)
）阴性图形
b）阳性图形
图 1Dat-ELISA法检测甲型流感病毒抗原的结果示意图10检测报告
结果呈阴性时可报告为“甲型流感病毒抗原阴性一Dot-EI.ISA法\。10.1
10.2结果呈阳性时可报为\甲型流感病毒抗原阳性一DotELISA法”。阳性结果的处置
Dat-E1.ISA法检测为阳性结果的相应标本应做进一步确诊。11.2确诊为阳性结果片应按规定向上级主管部门报告。(）无效围形
-irkoNiKca
SN/T3952—2014
A.1Hank's液
附录A
（资料性附录）
主要试剂
A.1.1甲液：NazHPO.·2H,O0.06g.KH,PO.0.06g,MgSO,·7H.O0.2g.葡葡糖1.0g,NaCI8.0g，去离子水750mL。
A.1.2乙液：CaCl0.14g，去离
高子水100mL
A.1.3应用液：将乙液缓慢加人甲液中.形成A液。在3638
C条件下，将0.35gNaHCO，溶解免费标准下载网bzxz
在100mL去离子水中，形成B液。取3mL～5mL的NaHC溶液溶解0.02g酚红，形成C液。将上述三种液体混合在一起，再用去离子水定容至！000m上，充分混匀，过滤消毒灭菌。2裂解液
将15g十六烷基二甲基漠化铵（hexadecyltrimethylammoniumbromide，CTAB），58.5gNaCl、30mL0.5mol/L乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）溶解至600mL的去离子水中，加人75mL1mol/LTris-HCl(pH=8.0)，用去离子水定容至1000mL，反应板
的单克隆抗体包被反应孔，每孔100ng。用抗重组甲型流感病毒NP蛋白
A.4质控点
包被羊抗鼠多克降抗体，每孔5
A.5酶标试剂
标记辣根过氧化物酶（HRP)的抗重组甲型流感病毒NP蛋白的单克降抗体。A.6标本洗涤液
PBST(20mmol/LNaCl,2.68mmol/LKCl,10mmol/LNa.HPO,1.76mmol/LKH,PO..0.05%吐温-20），使用时稀释20倍。4
-KAoNiKAca
A.7显色液
SN/T3952—2014
3,3\.5,5*-四甲基联举胺（3,3*,5,5\-tctramethylbenzidinc,TMB)膜底物显色液A.8
终止液
2 mol/L H,so,.
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