SN/T 3964-2014
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标准简介
SN/T 3964-2014.Detection and identification of Tomato severe leaf curl virus.
1范围
SN/T 3964规定了番茄严重曲叶病毒的免疫学及分子生物学等检疫鉴定方法。
SN/T 3964适用于可能携带番茄严重曲叶病毒的寄主植物及其产品的检疫鉴定。
2番茄严重曲叶病毒基本信息
学名: Tomato severe leaf curl virus
缩写:ToSLCV
分类地位:双生病毒科(Geminiviridae),菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)。
传播途径:主要通过烟粉虱(Bemisiatabaci)传播,也可通过嫁接传播。
番茄严重曲叶病毒的其他信息参见附录A。
3原理
根据番茄严重曲叶病毒与抗体之间的特异性反应，对样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附(DAS-ELISA)检测;根据该病毒DNA保守区的特异性进行常规PCR或实时荧光PCR检测,通过电泳条带大小或扩增曲线的变化进行结果判定。
4仪器设备、用具及试剂
4.1仪器设 备
酶标仪、普通PCR仪、实时荧光PCR仪、多功能电泳仪、高速冷冻离心机、凝胶成像系统、4℃冰箱、电子分析天平(0.001g)、恒温水浴锅、-80℃超低温冰箱、高压灭菌锅及制冰机等。
4.2 主要用具
可调移液器(2.5μL、10μL、20μL、100μL、1000μL)、离心管、PCR管、酶标板及研钵等。
4.3主要 试剂
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂。
双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DASELISA)试剂见附录B,常规PCR检测试剂见附录C。
1范围
SN/T 3964规定了番茄严重曲叶病毒的免疫学及分子生物学等检疫鉴定方法。
SN/T 3964适用于可能携带番茄严重曲叶病毒的寄主植物及其产品的检疫鉴定。
2番茄严重曲叶病毒基本信息
学名: Tomato severe leaf curl virus
缩写:ToSLCV
分类地位:双生病毒科(Geminiviridae),菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)。
传播途径:主要通过烟粉虱(Bemisiatabaci)传播,也可通过嫁接传播。
番茄严重曲叶病毒的其他信息参见附录A。
3原理
根据番茄严重曲叶病毒与抗体之间的特异性反应，对样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附(DAS-ELISA)检测;根据该病毒DNA保守区的特异性进行常规PCR或实时荧光PCR检测,通过电泳条带大小或扩增曲线的变化进行结果判定。
4仪器设备、用具及试剂
4.1仪器设 备
酶标仪、普通PCR仪、实时荧光PCR仪、多功能电泳仪、高速冷冻离心机、凝胶成像系统、4℃冰箱、电子分析天平(0.001g)、恒温水浴锅、-80℃超低温冰箱、高压灭菌锅及制冰机等。
4.2 主要用具
可调移液器(2.5μL、10μL、20μL、100μL、1000μL)、离心管、PCR管、酶标板及研钵等。
4.3主要 试剂
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂。
双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DASELISA)试剂见附录B,常规PCR检测试剂见附录C。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3964—2014
番茄严重曲叶病毒检疫鉴定方法Detection and identification of Tomato severe lea f curl virus2014-04-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-11-01实施
本标谁按照GB/T1.1一2009给出的规则起草，SN/T 3964--2014
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本义件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准由国家认证认可监替管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局，中华人民共和国烟台出人境检验检疫局，
本标准主要起草人：张水江、邓从良、沈建国、廖富荣、粟智平、鲁洁，朱水芳、李明福、李佳芬、魏梅生。1范围
番茄严重曲叶病毒检疫鉴定方法本标准规定了番茄严重曲叶病毒的免疫学及分子生物学等检疫鉴定方法。本标准适用于可能携带番茄严重曲叶病毒的寄主植物及其产品的检疫鉴定。2番茄严重曲叶病毒基本信息
学名：Tomato severe leaf curl virus缩写：TOSLCV
分类地位：双生病毒科（Geminiviridae），菜豆金色花叶病毒属（Begomouirus）。传播途径：主要通过烟粉虱（Bemisia.tabacn)传播，也可通过嫁接传播：番茄严重曲叶病毒的其他信息参见附录A3原理
SN/T3964—2014
根据番茄严重曲叶病毒与抗体之间的特异性反应，对样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附（DAS-区的特异性进行常规PCR或实时荧光PCR检测，通过电泳条带大ELISA)检测；根据该病毒DNA保守小或扩增曲线的变化进行结果判定仪器设备、用具及试剂
4.1仪器设备
酶标仪、普通PCR仪、实时卖光PCR仪、多功能电泳仪、高速冷冻离心机、凝胶成像系统、4℃冰箱、电子分析天平（0.001g）恒温水浴锅、一80超低温冰箱、高压灭菌锅及制冰机等。主要用具
可调移液器（2.5uL、10μL、20μL、100μL、1000uL）、离心管、PCR管、酶标板及研体等。4.3主要试剂
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂。双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA)试剂见附录B，常规PCR检测试剂见附录C5检疫鉴定方法
5.1检测样品的制备
5.1.1苗木：有症状（如植株矮化、叶片畸形、卷曲、皱缩等）的苗木单独编号，每株采集症状叶片5g用于后续检测；无症状的植株每10株分为1组并编号，混合采集植株顶部叶片5g用于后续检测。SN/T3964-—2014
5.1.2植物产品：有症状的植物产品单独编号，取状部位0.5用后续检测；无症状或无法观察症状的植物产品,分组编号后混台采样(1,5g用下后续检测。5.2双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）具体操作步骤处附录B.
5.3常规PCR检测
提取样品 INA,设置阳性对照,阴性对照和空白刘照，进行常规特异引物 PCR检测或常规通用引物 PCR检测。具体操作步骤见附录。5.4实时荧光PCR检测
提取样品 IDNA，设置阳性对照,性刘照和空H对照，进行实时荧光 PCR检测、具体操作步骤见附录D.
6结果判断
同时符合双抗体夹心酶联免接吸附测定(DAS-ELISA)和带规特异引物PCR检测结果为阳性的，判定待检测样品携带番茄严重曲叶病赤。采用常规通用引物PCR行检测，当检测结果为阳性时，则进行序列测定-测定序列经比对分析为番茄严重曲叶病毒的,判定待检测样品携带脊严重曲叫病声。实时荧光PCR检测结果为阳性的，判定待检测样品携带番茄严重曲叶病母。7样品保存与记录结果
7.1样品保存
检测结果判定为阳性的样品应妥善保存在-80心冰箱中，并作好登记和标记，以备复核用。7.2结果记录
包括样品来源、种类、取样人员、检测原始记录、照片等文档按有关规定作好登记、标记和存档，以便必要时复核。
TrKAoNiKAca
A.1寄主范围
附录A
（资料性附录）
番茄严重曲叶病毒背景资料
SN/T3964—2014
寄主植物包括番茄属（Lycopersiconspp.）、辣椒属（Capsicumspp.）、茄属（SoLanumspp.）、藜属（Chenopodiumspp.）、属（Polygonumspp.）、滨藜属（Atriplexspp.）、Halogetum属、烟草属（Nic-otiana spp.）、独行菜属（Lepidium spp.）、拟漆姑属（Spergulariaspp.）、苋属（Amaranthusspp.）及锦葵属（Malvaspp.）。
A.2病害症状
侵染寄主植物导致植株矮化及叶片卷曲或皱缩（图A,1)。图A.1受侵染番茄症状
A.3分布地区
中美洲。
A.4粒体形态
病毒粒子为双联体结构，颗粒大小为18nm×30nm，无包膜，由两个不完整的二十面体组成。TKAONKAca
SN/T 3964—2014
基因组特性
为单组份病毒，基因组DNA大小为2.5kh2.6b,包含AR1.AL7、AI.2、AL3及AL4等5个阅读框，分别编码外壳白、复制相关蛋白、转录激活蛋白、复制增强蛋白及（4蛋白。-TIKAoNrKAca
B.1试材
酶联板的要求
附录B
（规范性附录）
双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）使用质量有保证厂商生产的酶联板B.1.2
包被抗体
特异性的番茄严重曲叶病毒抗体B.1.3酶标抗体
碱性磷酸酯酶标记的番茄严重曲叶病毒抗体B.1.4底物
对硝基苯磷酸二钠（pNPP）。
B.1.5PBST缓冲液（洗涤缓冲液pH7.4）氯化钠（NaCI）
磷酸氢二钠（NazHPO,）
磷酸二氢钾（KHPO,）
氯化钾（KCI)
吐温-20（Tween-20）
加人900mL蒸馏水溶解，调节pH到7.4，加蒸馅水定容至5样品抽提缓冲液（pH7.4）
亚硫酸钠（Na2SO）
聚乙烯吡咯烷酮（PVP，MW24000~40000）叠氮化钠（NaN）
PBST定容至1L,4℃储存。
B.1.7包被缓冲液（pH9.6）
碳酸钠（NaCO,）
碳酸氢钠（NaHCO,）
登氮化钠（NaN.）
蒸馏水定容至1L4℃储存。
B.1.8酶标抗体稀释缓冲液（pH7.4）牛血清白蛋白（BSA)或脱脂奶粉1.3g
SN/T3964—2014
-TKAONiKAca
SN/T 3964—2014
聚乙烯吡咯烷酮（PVP,MW24000~40000）叠氮化钠(NaN）
PBST定容至1L;4℃储存。
B.1.9底物(pNPP)缓冲液(pH 9.8)氟化钾（KC1)
叠氮化钠（NaV）
二乙醇胺(C.HNO,)
溶于 800 mL蒸馏水中,用 HCl调 pH 至 9.8,蒸馏水定容至1 L,4 C储存。B,2程序
B.2.1包被抗体
用包被缓冲将抗体按说明稀释，加入酶联板孔巾，100μI/孔，37℃孵育2h，清空孔中溶液，PBST 洗涤 3 次。
B.2.2样品制备
待测样品按1：10(质量体积比)加人抽提缓冲液,用研钵研磨成浆.7500 r/min离心10 min，_上.清液即为制备好的检测样品。阴性对照.阳性对照作相应的处现或按照说明乃进行；空白对照为样品抽提缓冲液。
B.2.3加样
根据检测需要设计96孔（或48孔)酶联板：包括2个阴性对照孔,2个阳性刘照孔，2个空白对照孔和多个待测样品孔。加样量为100 &L/孔，每个样品设1个重复。4℃冰箱孵育过夜，酶联板用PBST洗涤3次。
B,2.4加酶标抗体
用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释垒工作浓度，并加入到酶联板中，100μL/孔，37℃孵育4h，P13ST洗涤3次。
K,2.5加底物
将底物 pNPP加人到底物缓冲液中，使终浓度为 1 mg/ml(现配现用）.按 100 μL/孔,加入到酶联板中,室温避光孵育。
B,2,6读数
用酶标仪在 30 mim,1 h和2 h于 405 nm处读()值.注：实际检测时,PFST洗涤次数和显色读数时间按照检测抗体或试剂盒中说明书的规定执行。B.3结果判断
B.3.1对照孔的()Dns值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)应该在质量控制范围内,即：a）阴性对照孔的D4s值(0.15；
b）阳性对照（)Du值/阴性对照（D值2；6
-TIKAONiKAca
c）同一样品的OD4值应基本一致。B.3.2在满足了B.3.1质最要求后，结果原则上可判断如下：a）样品ODans道/阴性对照OD4n5值>2,判为阳性：SN/T 3964—2014
样品ODAs值/阴性对照OD40s值接近网值，判为可疑样品，需重做·次或用其他方法验证；b)
样品（DAas值/阴性对照（)Daos值2，判为阴性。3若满足不了B,3.1质量要求，则不能进行结果判断。B.3.3
注：质量控制标准和结果判定按捡测抗体或试剂盒巾说明书的规定执行。SN/T3964—2014
C.1试剂
附录C
（规范性附录）
常规PCR检测
C.1.1十六烷基三甲基溴化胺（CTAB)DNA提取缓冲液十六烷基三甲基漠化胺（CTAB）乙二胺四乙酸二钠（EDTA，0.5mol/L）氯化钠（VaCD
1mol/LTris-HCl
2-ME(β-巯基乙醇）
加水定容至200mL，调pH至8.0，121℃高压灭菌30minC.1.2十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）沉淀液十六烷基三甲基溴化胺（CTAB
氧化钠（NaCD
加水定容至100mL，121℃高开火3高盐TE缓冲液
乙二胺四乙酸二钠（EDTA0.5
氯化钠(NaCI）
1mol/LTris-HCl
121℃高压灭菌30min
加水定容至100mL，调pH全8.0.下载标准就来标准下载网
C.1.4电泳缓冲液TBE（5×）
三羟甲基氨基甲烷（Tris)
硼酸（H.BO）
乙二胺四乙酸二钠（EDTA)）
加双蒸水定容至500mL，用时加蒸馏水稀释至0.5×TBEC.1.5溴化乙锭（EB）溶液（10μg/uL）溴化乙锭
灭菌去离子水
C.2引物
常规特异PCR检测引物序列如下：ToSLCVf:5-ATGCCTAAGCGTGATGCCCCAT-327
ToSLCVI:5'-CTGTTMGTGTGGTTCTTCARCTTGATGT-38
(M-C/A;R-A/G)
扩增片段长度约386bp。
常规通用PCR检测引物序列如下：PA:5-TAATATTACCKGWKGVCCSC-3
PB:5'-TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA-3SN/T3964—2014
(B-C/T/G; K=G/T;R=A/G; S-C/G; V=A/C/G:W=A/T: Y- C/T)扩增片段长度约500bp。
C.3DNA提取
取待测样品0.5g于液氮中磨碎，加入1.5mL65℃预热的2-ME/CTABDNA抽提液，混勾后转人2mL离心管中，于65℃温浴1h，不时混用等体积的三氯甲烧10000r/min离心10min；回收上清液，加人等体积的CTAB沉淀液异戊醇（24：1）抽提，室温下
颠倒混匀，于65℃温浴1h；
10000r/min离心5min，移出上清液，用1.5mL高盐1E缓冲液重悬沉淀，加2倍体积无水乙醇沉淀℃干燥后，溶手100μL双蒸水中，一20℃保存备用。核酸；12000r/min离心15min，70%乙醇洗涤，37注：或者按照商品DNA提取试剂盒进行操作C.4PCR扩增
PCR反应体系见表C.1，每个样品设2个平行处理，反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不严重曲叶病毒的材料作为阳性对照，以健康植物材料同的反应总体积进行适当调整。检测时以含番而严以水代替DNA模板作为空白对照。或菜豆金色花叶病毒属的其他病毒材料作为阴性对照常规特异PCR检测反应条件：94
10min。
305.58℃
常规通用PCR检测反应条件95℃5min；9430
10min。
PCR缓冲液（含MgCI）
ToSLCVf或PA
ToSLCVr或PB
TagDNA聚合酶
补水至
5琼脂糖凝胶电泳检测
PCR反应体系
储存液浓度
20μmol/L
20μmol/L
5U/μl
s，72℃30s30个循环72℃
30572℃305，30个循环；72℃
加样量
终浓度
2.5mmol/L
0.5μmol/L
0.5μmol/L
制备1%的琼脂糖凝胶，按比例混匀电泳上样缓冲液和PCR扩增产物，用DNAMarker作为分子量标记，进行电泳分析。电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性DNA9
SN/T 3964—2014
条带，并拍摄记录。
结果判定
常规特异 PCR 检测
如果附性对照出现约386 bpP的条带,检测样品、阴性对照和空白对照未出现条带，可判定样品为ToSLCV阴性。
如果阳性对照及检测样品出现约386 bp的条带，阴性对照和空门对照未出现条带，可判定样品为ToSLCV 阳性。
常规通用PCR检
如果阳性对照出现约500bpP的条带，检测样品、阴性对照和空白对照未出现条带，可判定样品为ToSLCV 阴性。
如果阳性对照及检测样品出现约500 bp的条带,阴性对照和空白对照木山现条带，则对样品条带进行序列测定，测定的序列比对结果为ToSLCV的判定样品为 ToSLCV阳性。10
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番茄严重曲叶病毒检疫鉴定方法Detection and identification of Tomato severe lea f curl virus2014-04-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-11-01实施
本标谁按照GB/T1.1一2009给出的规则起草，SN/T 3964--2014
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本义件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准由国家认证认可监替管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局，中华人民共和国烟台出人境检验检疫局，
本标准主要起草人：张水江、邓从良、沈建国、廖富荣、粟智平、鲁洁，朱水芳、李明福、李佳芬、魏梅生。1范围
番茄严重曲叶病毒检疫鉴定方法本标准规定了番茄严重曲叶病毒的免疫学及分子生物学等检疫鉴定方法。本标准适用于可能携带番茄严重曲叶病毒的寄主植物及其产品的检疫鉴定。2番茄严重曲叶病毒基本信息
学名：Tomato severe leaf curl virus缩写：TOSLCV
分类地位：双生病毒科（Geminiviridae），菜豆金色花叶病毒属（Begomouirus）。传播途径：主要通过烟粉虱（Bemisia.tabacn)传播，也可通过嫁接传播：番茄严重曲叶病毒的其他信息参见附录A3原理
SN/T3964—2014
根据番茄严重曲叶病毒与抗体之间的特异性反应，对样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附（DAS-区的特异性进行常规PCR或实时荧光PCR检测，通过电泳条带大ELISA)检测；根据该病毒DNA保守小或扩增曲线的变化进行结果判定仪器设备、用具及试剂
4.1仪器设备
酶标仪、普通PCR仪、实时卖光PCR仪、多功能电泳仪、高速冷冻离心机、凝胶成像系统、4℃冰箱、电子分析天平（0.001g）恒温水浴锅、一80超低温冰箱、高压灭菌锅及制冰机等。主要用具
可调移液器（2.5uL、10μL、20μL、100μL、1000uL）、离心管、PCR管、酶标板及研体等。4.3主要试剂
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂。双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA)试剂见附录B，常规PCR检测试剂见附录C5检疫鉴定方法
5.1检测样品的制备
5.1.1苗木：有症状（如植株矮化、叶片畸形、卷曲、皱缩等）的苗木单独编号，每株采集症状叶片5g用于后续检测；无症状的植株每10株分为1组并编号，混合采集植株顶部叶片5g用于后续检测。SN/T3964-—2014
5.1.2植物产品：有症状的植物产品单独编号，取状部位0.5用后续检测；无症状或无法观察症状的植物产品,分组编号后混台采样(1,5g用下后续检测。5.2双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）具体操作步骤处附录B.
5.3常规PCR检测
提取样品 INA,设置阳性对照,阴性对照和空白刘照，进行常规特异引物 PCR检测或常规通用引物 PCR检测。具体操作步骤见附录。5.4实时荧光PCR检测
提取样品 IDNA，设置阳性对照,性刘照和空H对照，进行实时荧光 PCR检测、具体操作步骤见附录D.
6结果判断
同时符合双抗体夹心酶联免接吸附测定(DAS-ELISA)和带规特异引物PCR检测结果为阳性的，判定待检测样品携带番茄严重曲叶病赤。采用常规通用引物PCR行检测，当检测结果为阳性时，则进行序列测定-测定序列经比对分析为番茄严重曲叶病毒的,判定待检测样品携带脊严重曲叫病声。实时荧光PCR检测结果为阳性的，判定待检测样品携带番茄严重曲叶病母。7样品保存与记录结果
7.1样品保存
检测结果判定为阳性的样品应妥善保存在-80心冰箱中，并作好登记和标记，以备复核用。7.2结果记录
包括样品来源、种类、取样人员、检测原始记录、照片等文档按有关规定作好登记、标记和存档，以便必要时复核。
TrKAoNiKAca
A.1寄主范围
附录A
（资料性附录）
番茄严重曲叶病毒背景资料
SN/T3964—2014
寄主植物包括番茄属（Lycopersiconspp.）、辣椒属（Capsicumspp.）、茄属（SoLanumspp.）、藜属（Chenopodiumspp.）、属（Polygonumspp.）、滨藜属（Atriplexspp.）、Halogetum属、烟草属（Nic-otiana spp.）、独行菜属（Lepidium spp.）、拟漆姑属（Spergulariaspp.）、苋属（Amaranthusspp.）及锦葵属（Malvaspp.）。
A.2病害症状
侵染寄主植物导致植株矮化及叶片卷曲或皱缩（图A,1)。图A.1受侵染番茄症状
A.3分布地区
中美洲。
A.4粒体形态
病毒粒子为双联体结构，颗粒大小为18nm×30nm，无包膜，由两个不完整的二十面体组成。TKAONKAca
SN/T 3964—2014
基因组特性
为单组份病毒，基因组DNA大小为2.5kh2.6b,包含AR1.AL7、AI.2、AL3及AL4等5个阅读框，分别编码外壳白、复制相关蛋白、转录激活蛋白、复制增强蛋白及（4蛋白。-TIKAoNrKAca
B.1试材
酶联板的要求
附录B
（规范性附录）
双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）使用质量有保证厂商生产的酶联板B.1.2
包被抗体
特异性的番茄严重曲叶病毒抗体B.1.3酶标抗体
碱性磷酸酯酶标记的番茄严重曲叶病毒抗体B.1.4底物
对硝基苯磷酸二钠（pNPP）。
B.1.5PBST缓冲液（洗涤缓冲液pH7.4）氯化钠（NaCI）
磷酸氢二钠（NazHPO,）
磷酸二氢钾（KHPO,）
氯化钾（KCI)
吐温-20（Tween-20）
加人900mL蒸馏水溶解，调节pH到7.4，加蒸馅水定容至5样品抽提缓冲液（pH7.4）
亚硫酸钠（Na2SO）
聚乙烯吡咯烷酮（PVP，MW24000~40000）叠氮化钠（NaN）
PBST定容至1L,4℃储存。
B.1.7包被缓冲液（pH9.6）
碳酸钠（NaCO,）
碳酸氢钠（NaHCO,）
登氮化钠（NaN.）
蒸馏水定容至1L4℃储存。
B.1.8酶标抗体稀释缓冲液（pH7.4）牛血清白蛋白（BSA)或脱脂奶粉1.3g
SN/T3964—2014
-TKAONiKAca
SN/T 3964—2014
聚乙烯吡咯烷酮（PVP,MW24000~40000）叠氮化钠(NaN）
PBST定容至1L;4℃储存。
B.1.9底物(pNPP)缓冲液(pH 9.8)氟化钾（KC1)
叠氮化钠（NaV）
二乙醇胺(C.HNO,)
溶于 800 mL蒸馏水中,用 HCl调 pH 至 9.8,蒸馏水定容至1 L,4 C储存。B,2程序
B.2.1包被抗体
用包被缓冲将抗体按说明稀释，加入酶联板孔巾，100μI/孔，37℃孵育2h，清空孔中溶液，PBST 洗涤 3 次。
B.2.2样品制备
待测样品按1：10(质量体积比)加人抽提缓冲液,用研钵研磨成浆.7500 r/min离心10 min，_上.清液即为制备好的检测样品。阴性对照.阳性对照作相应的处现或按照说明乃进行；空白对照为样品抽提缓冲液。
B.2.3加样
根据检测需要设计96孔（或48孔)酶联板：包括2个阴性对照孔,2个阳性刘照孔，2个空白对照孔和多个待测样品孔。加样量为100 &L/孔，每个样品设1个重复。4℃冰箱孵育过夜，酶联板用PBST洗涤3次。
B,2.4加酶标抗体
用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释垒工作浓度，并加入到酶联板中，100μL/孔，37℃孵育4h，P13ST洗涤3次。
K,2.5加底物
将底物 pNPP加人到底物缓冲液中，使终浓度为 1 mg/ml(现配现用）.按 100 μL/孔,加入到酶联板中,室温避光孵育。
B,2,6读数
用酶标仪在 30 mim,1 h和2 h于 405 nm处读()值.注：实际检测时,PFST洗涤次数和显色读数时间按照检测抗体或试剂盒中说明书的规定执行。B.3结果判断
B.3.1对照孔的()Dns值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)应该在质量控制范围内,即：a）阴性对照孔的D4s值(0.15；
b）阳性对照（)Du值/阴性对照（D值2；6
-TIKAONiKAca
c）同一样品的OD4值应基本一致。B.3.2在满足了B.3.1质最要求后，结果原则上可判断如下：a）样品ODans道/阴性对照OD4n5值>2,判为阳性：SN/T 3964—2014
样品ODAs值/阴性对照OD40s值接近网值，判为可疑样品，需重做·次或用其他方法验证；b)
样品（DAas值/阴性对照（)Daos值2，判为阴性。3若满足不了B,3.1质量要求，则不能进行结果判断。B.3.3
注：质量控制标准和结果判定按捡测抗体或试剂盒巾说明书的规定执行。SN/T3964—2014
C.1试剂
附录C
（规范性附录）
常规PCR检测
C.1.1十六烷基三甲基溴化胺（CTAB)DNA提取缓冲液十六烷基三甲基漠化胺（CTAB）乙二胺四乙酸二钠（EDTA，0.5mol/L）氯化钠（VaCD
1mol/LTris-HCl
2-ME(β-巯基乙醇）
加水定容至200mL，调pH至8.0，121℃高压灭菌30minC.1.2十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）沉淀液十六烷基三甲基溴化胺（CTAB
氧化钠（NaCD
加水定容至100mL，121℃高开火3高盐TE缓冲液
乙二胺四乙酸二钠（EDTA0.5
氯化钠(NaCI）
1mol/LTris-HCl
121℃高压灭菌30min
加水定容至100mL，调pH全8.0.下载标准就来标准下载网
C.1.4电泳缓冲液TBE（5×）
三羟甲基氨基甲烷（Tris)
硼酸（H.BO）
乙二胺四乙酸二钠（EDTA)）
加双蒸水定容至500mL，用时加蒸馏水稀释至0.5×TBEC.1.5溴化乙锭（EB）溶液（10μg/uL）溴化乙锭
灭菌去离子水
C.2引物
常规特异PCR检测引物序列如下：ToSLCVf:5-ATGCCTAAGCGTGATGCCCCAT-327
ToSLCVI:5'-CTGTTMGTGTGGTTCTTCARCTTGATGT-38
(M-C/A;R-A/G)
扩增片段长度约386bp。
常规通用PCR检测引物序列如下：PA:5-TAATATTACCKGWKGVCCSC-3
PB:5'-TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA-3SN/T3964—2014
(B-C/T/G; K=G/T;R=A/G; S-C/G; V=A/C/G:W=A/T: Y- C/T)扩增片段长度约500bp。
C.3DNA提取
取待测样品0.5g于液氮中磨碎，加入1.5mL65℃预热的2-ME/CTABDNA抽提液，混勾后转人2mL离心管中，于65℃温浴1h，不时混用等体积的三氯甲烧10000r/min离心10min；回收上清液，加人等体积的CTAB沉淀液异戊醇（24：1）抽提，室温下
颠倒混匀，于65℃温浴1h；
10000r/min离心5min，移出上清液，用1.5mL高盐1E缓冲液重悬沉淀，加2倍体积无水乙醇沉淀℃干燥后，溶手100μL双蒸水中，一20℃保存备用。核酸；12000r/min离心15min，70%乙醇洗涤，37注：或者按照商品DNA提取试剂盒进行操作C.4PCR扩增
PCR反应体系见表C.1，每个样品设2个平行处理，反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不严重曲叶病毒的材料作为阳性对照，以健康植物材料同的反应总体积进行适当调整。检测时以含番而严以水代替DNA模板作为空白对照。或菜豆金色花叶病毒属的其他病毒材料作为阴性对照常规特异PCR检测反应条件：94
10min。
305.58℃
常规通用PCR检测反应条件95℃5min；9430
10min。
PCR缓冲液（含MgCI）
ToSLCVf或PA
ToSLCVr或PB
TagDNA聚合酶
补水至
5琼脂糖凝胶电泳检测
PCR反应体系
储存液浓度
20μmol/L
20μmol/L
5U/μl
s，72℃30s30个循环72℃
30572℃305，30个循环；72℃
加样量
终浓度
2.5mmol/L
0.5μmol/L
0.5μmol/L
制备1%的琼脂糖凝胶，按比例混匀电泳上样缓冲液和PCR扩增产物，用DNAMarker作为分子量标记，进行电泳分析。电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性DNA9
SN/T 3964—2014
条带，并拍摄记录。
结果判定
常规特异 PCR 检测
如果附性对照出现约386 bpP的条带,检测样品、阴性对照和空白对照未出现条带，可判定样品为ToSLCV阴性。
如果阳性对照及检测样品出现约386 bp的条带，阴性对照和空门对照未出现条带，可判定样品为ToSLCV 阳性。
常规通用PCR检
如果阳性对照出现约500bpP的条带，检测样品、阴性对照和空白对照未出现条带，可判定样品为ToSLCV 阴性。
如果阳性对照及检测样品出现约500 bp的条带,阴性对照和空白对照木山现条带，则对样品条带进行序列测定，测定的序列比对结果为ToSLCV的判定样品为 ToSLCV阳性。10
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