SN/T 3963-2014
基本信息
标准号： SN/T 3963-2014
中文名称：桃丛簇花叶病毒检测方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3963-2014.Detection of Peach rosette mosaic virus.
1范围
SN/T 3963规定了桃丛簇花叶病毒的检疫鉴定方法。
SN/T 3963适用于桃树、葡萄等植物材料中桃丛簇花叶病毒的检疫和鉴定。
2原理
桃丛簇花叶病毒学名: Peach rosette mosaic virus ,缩写:PRMV。该病毒外壳蛋白的特异性及其基因组核酸序列的特殊性是本标准制定的主要依据。相关资料参见附录A。
3仪器设备、用具及试剂
3.1仪器设备
酶标检测仪、实时荧光PCR仪、低温冰箱、恒温箱、高压灭菌锅、电子分析天平、台式高速冷冻离心
机、恒温水浴锅、制冰机等。
3.2 用具
微量可调移液器(量程分别为25μL、10μL、100μL、200μL和1mL)及灭菌的吸头、1.5 mL离心管、研钵、酶联板、0.2 mL PCR管、96孔PCR反应板及盖子等。
3.3试剂
主要试剂、缓冲液、引物和探针序列等见附录B和附录C。
4检测与鉴定
4.1血清学(双抗体夹心酶联免疫吸附测定)
4.1.1包被抗体
将PRMV的抗体用包被缓冲液稀释至工作浓度,加入酶联板中,每孔加入100 μL。将酶联板加盖(或用保鲜膜密封后)放入保湿盒中,置于37 °C恒温箱中温育2 h(或4℃冰箱过夜)。之后每孔加入300μL PBST洗板3次,每次3 min。
4.1.2样品制备
称取待检植物叶片0.2g,加入2mL样品抽提缓冲液，充分研磨后，转入1.5 mL的离心管中，5000r/min离心5min,取上清液,即为1:10稀释的样品粗提液。
1范围
SN/T 3963规定了桃丛簇花叶病毒的检疫鉴定方法。
SN/T 3963适用于桃树、葡萄等植物材料中桃丛簇花叶病毒的检疫和鉴定。
2原理
桃丛簇花叶病毒学名: Peach rosette mosaic virus ,缩写:PRMV。该病毒外壳蛋白的特异性及其基因组核酸序列的特殊性是本标准制定的主要依据。相关资料参见附录A。
3仪器设备、用具及试剂
3.1仪器设备
酶标检测仪、实时荧光PCR仪、低温冰箱、恒温箱、高压灭菌锅、电子分析天平、台式高速冷冻离心
机、恒温水浴锅、制冰机等。
3.2 用具
微量可调移液器(量程分别为25μL、10μL、100μL、200μL和1mL)及灭菌的吸头、1.5 mL离心管、研钵、酶联板、0.2 mL PCR管、96孔PCR反应板及盖子等。
3.3试剂
主要试剂、缓冲液、引物和探针序列等见附录B和附录C。
4检测与鉴定
4.1血清学(双抗体夹心酶联免疫吸附测定)
4.1.1包被抗体
将PRMV的抗体用包被缓冲液稀释至工作浓度,加入酶联板中,每孔加入100 μL。将酶联板加盖(或用保鲜膜密封后)放入保湿盒中,置于37 °C恒温箱中温育2 h(或4℃冰箱过夜)。之后每孔加入300μL PBST洗板3次,每次3 min。
4.1.2样品制备
称取待检植物叶片0.2g,加入2mL样品抽提缓冲液，充分研磨后，转入1.5 mL的离心管中，5000r/min离心5min,取上清液,即为1:10稀释的样品粗提液。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 39632014
桃丛簇花叶病毒检测方法
Detection of Peach rosette mosaic virus2014-04-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-11-01实施
本标准按照G3/T1.1--2009给出的规则起草。本标准山国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3963—2014
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国浙江出人境检验检疫局、中华人闵共和天津出人境检验检疫局、中华入民其和国宁波出入境检验检疫局，本标推主要起草人：马云霞、张明哲、郭京泽、闻伟刚、李明福、朱水芳1范围
桃丛簇花叶病毒检测方法
本标准规定了桃丛簇花叶病毒的检疫鉴定方法本标准适用于桃树、葡萄等植物材料中桃丛簇花叶病毒的检疫和鉴定。2原理
SN/T3963—2014
桃丛筷花叶病毒学名：Peachrosette mosaic uirus，缩写：PRMV。病毒外壳蛋白的特异性及其基
因组核酸序列的特殊性是本标准制定的主要依据。相关资料参见附录A。3仪器设备、用具及试剂
仪器设备
酶标检测仪、实时荧光PCR仪
义、低温冰箱、恒温箱、高压灭菌锅、电子分析天平、台式高速冷冻离心机、恒温水浴锅、制冰机等。
3.2用具
微量可调移液器（量程分别为2
0μL、0cμL、200μL和/mL)及灭菌的吸头，1.5mL离心管、研钵、酶联板、0.2mLPCR管、96孔PCR反应板及盖子等。3.3试剂
等见附录B和附录C。
主要试剂、缓冲液、引物和探针序列等4检测与鉴定
4.1血清学（双抗体夹心酶联免疫吸附测定4.1.1包被抗体
将PRMV的抗体用包被缓冲液稀释至工作浓度，加入酶联板中，每孔加人100L。将酶联板加盖（或用保鲜膜密封后）放人保湿盒中，置于37℃恒温箱中温育2h（或4℃冰箱过夜）。之后每孔加人300μLPBST洗板3次，每次3min。4.1.2样品制备
称取待检植物叶片0.2g，加入2mL样品抽提缓冲液，充分研磨后，转人1.5mL的离心管中，5000r/min离心5min，取上清液，即为1：10稀释的样品粗提液。4.1.3加样
将样品粗提液加入已包被抗体的酶联板中，每孔加100uL。加缓冲液的孔作为空白对照，同时设1
SN/T 3963—2014
置阴性对照、阳性对照。每个处埋设置个重复，然后将酶联板加盖或用保鲜膜密封后放人保滞盒中，置于37℃恒温箱中温育2h（或1℃冰箱过夜）。之后用PBST洗板3次：方达向4.1.1，4.1.4加酶标抗体
用ECL绥冲液将碱性磷酸酯酶标记的PRMV酶标抗体稀释至工作浓度，加人酶联板孔中，每孔190uL，置于37℃条件下保湿2h，之后用PRST洗板3次，每次3min。4.1.5加底物显色
用新鲜配制的底物缓冲液配制质量浓度为1mg/ml.的pNPP溶液，加人酶联板，绿孔100μL，室温避光显色3cmin~~60min
4.1.6终止反应
待阳性对照孔颜色反应较充分而阴性对照孔尚未有非特异反应山现时、每孔中加人33uI3mol/LNaOH中止反应。
4.1.7读数
用酶标读数仪测定（D值，记录实验结果。4.2PRMY的实时荧光PCR检测方法4.2.1样品制备和植物总RNA的提取取0.1待检的植物啡片，剪成小段.用液氮研磨成粉木状.移人炎菌的1.5ml离心管中，然后加人1ml.的Trizol.删烈振荡摇勾；4℃,12000r/min离心10min以除去不溶的成分，将上清液转人，新的 1. rrl.离心管,室温下放置 5 min;加人 0.2 ml.三氯甲烷,烈振荡 30 s,在室温下保持10min~1!min后，4、120001/min离心15min；将上层水相转移到新的1.5mL离心管中，加0.5ml.异丙醇，上下颠倒混，室温下保持15mir;4℃,120G0r/min离心10minRNA就会在管的侧壁和底部形成沉淀：弃L清液.加入1mL75%的乙醇洗涤沉淀，然后1.7500/min离心5min，吸取.上清液；沉淀十室温下充分干燥后，溶于30μL去离子水（1DEPC:处理）中，20C保行备用。4.2.2实时荧光 RT-PCR
实时荧光RT-PCR采用商品化的RTPCK一步法试剂盒迹行，每个样品及对照设2个平行处理，检测时以感染PRMV的梢物材料作为阳性对照；在没有感染PRMV的植物材料作为阳性对照的情况下，可以用人工构建的阳性参考质粒分子或者以通过体外转录得到的含有待检核酸序列的RVA作为阳性对照（见附录C），以健康的植物材料4提取的总RNA作为阴性对照：以水代替RNA作为空对照。时荧光RT-P.R度质体系如下I：：2× Master Mix 混含液(不含 IN()40×MultiScribe利RNase酶钟制剂(RNasc:Inhibiiot)混合被正向引物（1cμmol/)
反尚引物(10 μmol/1)
0.G3 μT.
1.25 μl.
1）该反应体系针对 Tuy Man@ (hlt-Step RT-FCR Manter Mix Reagents Kit (Applierf Binsystems, CaT,Nn.4309169)给出，给出这一信息是为了方便本标滩使月书，并不表否只认可该产品·如果其他等效产品具有相回的效果，则可使川等效产品。
-TIKAONIKAca
TaMan针(humal/l
RNA样品
总体积
5,0 μL
25.c frl.
SN/T 3963—2014
实时荧光RTPCR反应参数：48，30min；95℃，10min；95℃,15*，60℃1min，4个循环。5结果判定与记录
5.1血清学结果判断
5.1.1对照孔的)Dm.值（空白对照孔、别性对照及阳性对照孔）应该在质量控制范围内，即：空亡刊和阴性对照孔的（)D25值.0.15，当阴性对照的01)405m值0.05时，按0).05计算，网性对照有明显的显色反应；阳性对照D5.值/阴性对照)Tm值2孔的重复性基本-致。5.1.2 在满足「 5.1.1 的质量要求后,结果原则上可判断如下：阳性对照(Ds值/阴性刘照OD1a5 nn值泌2,判为阳性。阳性对照（I值/阴性对照（1m.值2，判为阴性。5.1.3若不能满足5.1.1的质量控制要求,则不能进行结果判断。5.1.4如果是商品试剂盒，则根概试剂盒的说明来判断。5,2实时荧光RT-PCR结果判断
5.2.1实时荧光RI-PR阴性对照和空对照无荧光增幅现象，阳性对照有显著炭光增现象则表明反应体系运行正常。
5.2.2在满足5.2.1的质量要求后.结果可判断如下：若待检测样品无茨光增幅现象，则判定样品木检出桃丛簇化叶病存，判为阴性，若待检测样品有荧光增帼现象，日Cl值35时-则判断样品中检出桃丛簇花叶病毒，判为阴性。
-若得检测样品35Ct值~.40时应重新进行实时荧光RTPCR检测。一重新检测后在设定同一域值条件下，若Ct值40时，则判为阴性。重新检测后35（t值40，则判阳性。
5,3血清学检测结果与实时荧光RT-PCR结果的综合判断若同一样品的血清学检测结果与实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性，则判断该样品为PRMV性。
若同一样品的血清学检测结果与实时荧光RTPCR检测结果均为阴性，则判断该样品为PRMV阴性。
同一样品的血清学检测结果为阴性，而实时荧光RT-PCR的Ct值35时，则判断该样品为PRMV阳性：
若同一样品的I血清学检测结果为阳性，而实时荧光RT-PCR的检测结果为阴性，则需要分别重复血清学检测.实时荧光RT-PCR实验。如果再次重复实验后，血清学检测结果与实时淡光RT-PCR检测结果均为阳性，则判定该样品为PRMV阳性。如果再次重复实验的结果仍与最初结果相同，则需要结合其他的鉴定方法如症状、萨通PCR等检测方法，慎重做出结论。5.4结果记录
记录好各项实验数据，包括样品米源、种类、时问，实验的时闸地点、方法和结果等，要有经于人rKAoNiKAca
SN/T 3963—2014
和实验人员的签字。
样品的保存
检测结果判定为阳性的植物样品，经液氮冷冻后，于·80冰箱冷冻保存。保存样品做好登记和标记工作。
-TIKAONiKAca
A.1学名和分类地位
学名：Peachrosettemosaicvirus附录A
（资料性附录）
桃丛簇花叶病毒的相关资料
分类地位：伴生豆病毒科（Secoviridae），线虫传多面体病毒属（Nepouirus）。2病毒粒体形态及基因组组成
病毒粒子为球形，直径约28nm，病毒的基因组由两个正义，单链RNA组成。3寄主范围和症状
SN/T3963-—2014
该病毒的主要自然寄主是桃和葡萄。在桃树上引起的症状为枝条的未端表现为丛簇状，叶片花叶、植株矮化。在葡萄上引起枝条节间变短、弯曲，叶片畸形以及茎基部扁平状等症状。A.4传播方式
该病毒自然条件下可由矛线虫科（Dorylamidae）美洲剑线虫（xiphinemaamericanum）折环长针以通过机械接种、嫁接传播。
线虫（Longidorusdiadecturus）传播
但不能够通过植物问的接触传
播。该病毒可以种传。
地理分布
该病毒分布于加拿大的安大略省和美国的密执安地区A.6鉴别寄主
昆诺藜（Chenopodiumquinoa）：褪绿局部斑、茎尖坏死以及表现为偏上性生长等症状克色黎（C.amaranticolor）：较轻微的系统斑驳。5
-TiKAoNiKAca
SN/T 3963-2014
B.1试剂
附录B
（规范性附录）
双抗体夹心酶联免疫吸附测定法主要试剂、溶液配制无水亚硫酸钠（Na,S0)）聚乙烯吡略烷（PVP)（MW2000C～40Q00）套氮钠（NaN,）、卵清白黄白（Albutminegg）、吐温-20（Tween-20）、氧化镁（MgCl.）、一乙醇胺（diethanolamine）、水碳酸钠(NazCO,）)、碳酸氢钠(NaHCO,）、氯化钠(NaCl)、磷酸二氧钾（KH,PO,）、氟化钾（KC1)、牛血清白蛋白（Bovintserunallumin，SA）、磷酸氢二钠（无水）（Na.HPO,）对硝基苯磷酸二钠（pNPP）PRMV抗体、碱性磷酸酯酶标记的PRMV抗体等。溶液配制
包被缓冲液(0.05nol/L碳酸盐缓冲液·pH9.6）B.2.1
无水碳酸钠
碳酸氢钠
叠氮钠
溶于蒸馏水中至1000LH0.6)，4℃保存。B.2.2PHST 缓冲液
氯化钠
磷酸氢二钠（无水）
磷酸氢钾
氯化钾
叶温20
溶于蒸馏水中垒 100C umL(μH 7.4).4 ℃:保存。B.2.3样品描提缓冲液
无水亚硫酸钠
聚乙烯吡烷酮（MW20009-~20000）叠氮钠
卵清白蛋白
吐温-20
溶于1000ml.1×PBST（pH7.4).4℃保存B.2.4ECL 缓冲液
牛血清占蛋白
聚乙烯吡咯烷酮
叠氮钠
-TIKAONiKAca
溶于1000 mL 1×PRS（pH 7.4），4保存B.2.5底物缓冲液
氯化镁(MgCl，·H,0)
叠氮钠
二乙醇胺
溶蒸馏水中,用盐酸调节 pH至 9.8,定容到1000 mL.4 保存。B.2.6
3 mul/L Naoll
12 g NaOH落于 10) mI.蒸馏水巾。SN/T 3963—2014
SN/T3963—2014
C.1试材、试剂此内容来自标准下载网
附录C
（规范性附录）
实时荧光RT-PCR检测法
TrizolRNA提取试剂盒、无水乙醇、异丙醇三氯甲烷（CHICI,）、一步法RT-PCR试剂盒等。含桃丛簇花叶病毒检测目的片段的参考质粒分子，保存。
20℃冰箱保存。植物样品于一70℃冰箱所有实验用试剂均为分析纯：除特别说明外，实验用水为蒸馏水或去离子水。C.2引物、探针设计
设计引物和探针如下（扩增片断对应手PRMVRNA1的第1022~1105位碱基）：PRMV-F(正向引物）：5'-CGAOGTATTGCAGATGGTATTTCC-3PRMV-R(反向引物）：5'-ACOAACATTCTTCACTGCATCAAGPRMV-P(探针）：5'-(FAM)
CCATTCTTCCTCAGCATCGGGT
TGT(Eclipse)-3
C.3含有待检核酸序列的RNA分子的制备C.3.1构建含有PRMV实时荧光KT-PCR检测目标片断的参考质粒分子
人工合成对应于PRMVRNA1的第9931130位碱基的人载体pGH上。
DNA模板
C.3.2PCR扩增得到进行体外转录所需要的以人工合成的含有对应于PRMV的第993-一段长
内138nt的DNA片段，并将其连
30nt的参考质粒分子作为模板，用引物PRMVT7-5F和PRMV-T73R进行PCR扩增，PCR产物经胶回收纯化后件为体外转录模板的DNA片段。PRMV-T7-5F（正向）：
5'TAATACGACTCACTATAGGGAGACTTAGTGGCATGCGTTTAGCAC-3PRMV-T7-3R（反向）：
5'-GGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACG-3°C.3.3体外转录得到进行实时荧光RT-PCR检测PRMV的阳性RNA对照的方法以C.3.2中得到的纯化的PCR产物作为模板，进行体外转录，得到进行实时荧光RT-PCR检测PRMV的阳性RNA对照。方法如下：在室温条件下，严格按照以下顺序在微量离心管中配制以下反应体系：5XT，转录缓冲液（TranscriptionOptimizedbuffer)0.Imol/LDTT
RNase抑制剂（RNaseInhibitor）混合液（4oU/μL）5XNTP
线性化的DNA模板（LinearizerlDNAtemplate)DEPC H,O
总体积
SN/T 39632014
然后.加入0.8μLT7RNAPolymerase,37℃反应2h，反应结束后电冰检测体外转录是否成功，取8μl休外转录产物.加入1μL10XDNase|缓冲液，1μL DNasel（RNase污染;1U/μL)，37 ℃反应 30 min,然后加入 1 μL DNase 终止液(DNasc Stop Solution)终止反应,再在 65 ℃ 下水浴1C min以失活DNasC。至此，得到的反应产物即可作为实时荧光RT-PCR检测 PRMV 的阳性对照 RNA，
注：本反应体系中所用的酶与试剂均购自Pr心I1Cg公司。如川其他公可的酶与试剂·需根据说明做相应的调整。SN/T 3963-—2014
参考文
[11 Klos, F.J.; Fronck, F., Krierem, J.A.: Cation. D.1966. Peach rosctte mosaic transmission andcontrol.Michigan Agrirultural Experinenlal Station Quarterly Bulletin,49:287-293.[2] Lammers, A, H., Allisou, R.F., Ramsdell, D.C.1999.Cloning and sequencing of peachrosetemosaic virusRNAl.VirusResearch,65:5773.10
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桃丛簇花叶病毒检测方法
Detection of Peach rosette mosaic virus2014-04-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-11-01实施
本标准按照G3/T1.1--2009给出的规则起草。本标准山国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3963—2014
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国浙江出人境检验检疫局、中华人闵共和天津出人境检验检疫局、中华入民其和国宁波出入境检验检疫局，本标推主要起草人：马云霞、张明哲、郭京泽、闻伟刚、李明福、朱水芳1范围
桃丛簇花叶病毒检测方法
本标准规定了桃丛簇花叶病毒的检疫鉴定方法本标准适用于桃树、葡萄等植物材料中桃丛簇花叶病毒的检疫和鉴定。2原理
SN/T3963—2014
桃丛筷花叶病毒学名：Peachrosette mosaic uirus，缩写：PRMV。病毒外壳蛋白的特异性及其基
因组核酸序列的特殊性是本标准制定的主要依据。相关资料参见附录A。3仪器设备、用具及试剂
仪器设备
酶标检测仪、实时荧光PCR仪
义、低温冰箱、恒温箱、高压灭菌锅、电子分析天平、台式高速冷冻离心机、恒温水浴锅、制冰机等。
3.2用具
微量可调移液器（量程分别为2
0μL、0cμL、200μL和/mL)及灭菌的吸头，1.5mL离心管、研钵、酶联板、0.2mLPCR管、96孔PCR反应板及盖子等。3.3试剂
等见附录B和附录C。
主要试剂、缓冲液、引物和探针序列等4检测与鉴定
4.1血清学（双抗体夹心酶联免疫吸附测定4.1.1包被抗体
将PRMV的抗体用包被缓冲液稀释至工作浓度，加入酶联板中，每孔加人100L。将酶联板加盖（或用保鲜膜密封后）放人保湿盒中，置于37℃恒温箱中温育2h（或4℃冰箱过夜）。之后每孔加人300μLPBST洗板3次，每次3min。4.1.2样品制备
称取待检植物叶片0.2g，加入2mL样品抽提缓冲液，充分研磨后，转人1.5mL的离心管中，5000r/min离心5min，取上清液，即为1：10稀释的样品粗提液。4.1.3加样
将样品粗提液加入已包被抗体的酶联板中，每孔加100uL。加缓冲液的孔作为空白对照，同时设1
SN/T 3963—2014
置阴性对照、阳性对照。每个处埋设置个重复，然后将酶联板加盖或用保鲜膜密封后放人保滞盒中，置于37℃恒温箱中温育2h（或1℃冰箱过夜）。之后用PBST洗板3次：方达向4.1.1，4.1.4加酶标抗体
用ECL绥冲液将碱性磷酸酯酶标记的PRMV酶标抗体稀释至工作浓度，加人酶联板孔中，每孔190uL，置于37℃条件下保湿2h，之后用PRST洗板3次，每次3min。4.1.5加底物显色
用新鲜配制的底物缓冲液配制质量浓度为1mg/ml.的pNPP溶液，加人酶联板，绿孔100μL，室温避光显色3cmin~~60min
4.1.6终止反应
待阳性对照孔颜色反应较充分而阴性对照孔尚未有非特异反应山现时、每孔中加人33uI3mol/LNaOH中止反应。
4.1.7读数
用酶标读数仪测定（D值，记录实验结果。4.2PRMY的实时荧光PCR检测方法4.2.1样品制备和植物总RNA的提取取0.1待检的植物啡片，剪成小段.用液氮研磨成粉木状.移人炎菌的1.5ml离心管中，然后加人1ml.的Trizol.删烈振荡摇勾；4℃,12000r/min离心10min以除去不溶的成分，将上清液转人，新的 1. rrl.离心管,室温下放置 5 min;加人 0.2 ml.三氯甲烷,烈振荡 30 s,在室温下保持10min~1!min后，4、120001/min离心15min；将上层水相转移到新的1.5mL离心管中，加0.5ml.异丙醇，上下颠倒混，室温下保持15mir;4℃,120G0r/min离心10minRNA就会在管的侧壁和底部形成沉淀：弃L清液.加入1mL75%的乙醇洗涤沉淀，然后1.7500/min离心5min，吸取.上清液；沉淀十室温下充分干燥后，溶于30μL去离子水（1DEPC:处理）中，20C保行备用。4.2.2实时荧光 RT-PCR
实时荧光RT-PCR采用商品化的RTPCK一步法试剂盒迹行，每个样品及对照设2个平行处理，检测时以感染PRMV的梢物材料作为阳性对照；在没有感染PRMV的植物材料作为阳性对照的情况下，可以用人工构建的阳性参考质粒分子或者以通过体外转录得到的含有待检核酸序列的RVA作为阳性对照（见附录C），以健康的植物材料4提取的总RNA作为阴性对照：以水代替RNA作为空对照。时荧光RT-P.R度质体系如下I：：2× Master Mix 混含液(不含 IN()40×MultiScribe利RNase酶钟制剂(RNasc:Inhibiiot)混合被正向引物（1cμmol/)
反尚引物(10 μmol/1)
0.G3 μT.
1.25 μl.
1）该反应体系针对 Tuy Man@ (hlt-Step RT-FCR Manter Mix Reagents Kit (Applierf Binsystems, CaT,Nn.4309169)给出，给出这一信息是为了方便本标滩使月书，并不表否只认可该产品·如果其他等效产品具有相回的效果，则可使川等效产品。
-TIKAONIKAca
TaMan针(humal/l
RNA样品
总体积
5,0 μL
25.c frl.
SN/T 3963—2014
实时荧光RTPCR反应参数：48，30min；95℃，10min；95℃,15*，60℃1min，4个循环。5结果判定与记录
5.1血清学结果判断
5.1.1对照孔的)Dm.值（空白对照孔、别性对照及阳性对照孔）应该在质量控制范围内，即：空亡刊和阴性对照孔的（)D25值.0.15，当阴性对照的01)405m值0.05时，按0).05计算，网性对照有明显的显色反应；阳性对照D5.值/阴性对照)Tm值2孔的重复性基本-致。5.1.2 在满足「 5.1.1 的质量要求后,结果原则上可判断如下：阳性对照(Ds值/阴性刘照OD1a5 nn值泌2,判为阳性。阳性对照（I值/阴性对照（1m.值2，判为阴性。5.1.3若不能满足5.1.1的质量控制要求,则不能进行结果判断。5.1.4如果是商品试剂盒，则根概试剂盒的说明来判断。5,2实时荧光RT-PCR结果判断
5.2.1实时荧光RI-PR阴性对照和空对照无荧光增幅现象，阳性对照有显著炭光增现象则表明反应体系运行正常。
5.2.2在满足5.2.1的质量要求后.结果可判断如下：若待检测样品无茨光增幅现象，则判定样品木检出桃丛簇化叶病存，判为阴性，若待检测样品有荧光增帼现象，日Cl值35时-则判断样品中检出桃丛簇花叶病毒，判为阴性。
-若得检测样品35Ct值~.40时应重新进行实时荧光RTPCR检测。一重新检测后在设定同一域值条件下，若Ct值40时，则判为阴性。重新检测后35（t值40，则判阳性。
5,3血清学检测结果与实时荧光RT-PCR结果的综合判断若同一样品的血清学检测结果与实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性，则判断该样品为PRMV性。
若同一样品的血清学检测结果与实时荧光RTPCR检测结果均为阴性，则判断该样品为PRMV阴性。
同一样品的血清学检测结果为阴性，而实时荧光RT-PCR的Ct值35时，则判断该样品为PRMV阳性：
若同一样品的I血清学检测结果为阳性，而实时荧光RT-PCR的检测结果为阴性，则需要分别重复血清学检测.实时荧光RT-PCR实验。如果再次重复实验后，血清学检测结果与实时淡光RT-PCR检测结果均为阳性，则判定该样品为PRMV阳性。如果再次重复实验的结果仍与最初结果相同，则需要结合其他的鉴定方法如症状、萨通PCR等检测方法，慎重做出结论。5.4结果记录
记录好各项实验数据，包括样品米源、种类、时问，实验的时闸地点、方法和结果等，要有经于人rKAoNiKAca
SN/T 3963—2014
和实验人员的签字。
样品的保存
检测结果判定为阳性的植物样品，经液氮冷冻后，于·80冰箱冷冻保存。保存样品做好登记和标记工作。
-TIKAONiKAca
A.1学名和分类地位
学名：Peachrosettemosaicvirus附录A
（资料性附录）
桃丛簇花叶病毒的相关资料
分类地位：伴生豆病毒科（Secoviridae），线虫传多面体病毒属（Nepouirus）。2病毒粒体形态及基因组组成
病毒粒子为球形，直径约28nm，病毒的基因组由两个正义，单链RNA组成。3寄主范围和症状
SN/T3963-—2014
该病毒的主要自然寄主是桃和葡萄。在桃树上引起的症状为枝条的未端表现为丛簇状，叶片花叶、植株矮化。在葡萄上引起枝条节间变短、弯曲，叶片畸形以及茎基部扁平状等症状。A.4传播方式
该病毒自然条件下可由矛线虫科（Dorylamidae）美洲剑线虫（xiphinemaamericanum）折环长针以通过机械接种、嫁接传播。
线虫（Longidorusdiadecturus）传播
但不能够通过植物问的接触传
播。该病毒可以种传。
地理分布
该病毒分布于加拿大的安大略省和美国的密执安地区A.6鉴别寄主
昆诺藜（Chenopodiumquinoa）：褪绿局部斑、茎尖坏死以及表现为偏上性生长等症状克色黎（C.amaranticolor）：较轻微的系统斑驳。5
-TiKAoNiKAca
SN/T 3963-2014
B.1试剂
附录B
（规范性附录）
双抗体夹心酶联免疫吸附测定法主要试剂、溶液配制无水亚硫酸钠（Na,S0)）聚乙烯吡略烷（PVP)（MW2000C～40Q00）套氮钠（NaN,）、卵清白黄白（Albutminegg）、吐温-20（Tween-20）、氧化镁（MgCl.）、一乙醇胺（diethanolamine）、水碳酸钠(NazCO,）)、碳酸氢钠(NaHCO,）、氯化钠(NaCl)、磷酸二氧钾（KH,PO,）、氟化钾（KC1)、牛血清白蛋白（Bovintserunallumin，SA）、磷酸氢二钠（无水）（Na.HPO,）对硝基苯磷酸二钠（pNPP）PRMV抗体、碱性磷酸酯酶标记的PRMV抗体等。溶液配制
包被缓冲液(0.05nol/L碳酸盐缓冲液·pH9.6）B.2.1
无水碳酸钠
碳酸氢钠
叠氮钠
溶于蒸馏水中至1000LH0.6)，4℃保存。B.2.2PHST 缓冲液
氯化钠
磷酸氢二钠（无水）
磷酸氢钾
氯化钾
叶温20
溶于蒸馏水中垒 100C umL(μH 7.4).4 ℃:保存。B.2.3样品描提缓冲液
无水亚硫酸钠
聚乙烯吡烷酮（MW20009-~20000）叠氮钠
卵清白蛋白
吐温-20
溶于1000ml.1×PBST（pH7.4).4℃保存B.2.4ECL 缓冲液
牛血清占蛋白
聚乙烯吡咯烷酮
叠氮钠
-TIKAONiKAca
溶于1000 mL 1×PRS（pH 7.4），4保存B.2.5底物缓冲液
氯化镁(MgCl，·H,0)
叠氮钠
二乙醇胺
溶蒸馏水中,用盐酸调节 pH至 9.8,定容到1000 mL.4 保存。B.2.6
3 mul/L Naoll
12 g NaOH落于 10) mI.蒸馏水巾。SN/T 3963—2014
SN/T3963—2014
C.1试材、试剂此内容来自标准下载网
附录C
（规范性附录）
实时荧光RT-PCR检测法
TrizolRNA提取试剂盒、无水乙醇、异丙醇三氯甲烷（CHICI,）、一步法RT-PCR试剂盒等。含桃丛簇花叶病毒检测目的片段的参考质粒分子，保存。
20℃冰箱保存。植物样品于一70℃冰箱所有实验用试剂均为分析纯：除特别说明外，实验用水为蒸馏水或去离子水。C.2引物、探针设计
设计引物和探针如下（扩增片断对应手PRMVRNA1的第1022~1105位碱基）：PRMV-F(正向引物）：5'-CGAOGTATTGCAGATGGTATTTCC-3PRMV-R(反向引物）：5'-ACOAACATTCTTCACTGCATCAAGPRMV-P(探针）：5'-(FAM)
CCATTCTTCCTCAGCATCGGGT
TGT(Eclipse)-3
C.3含有待检核酸序列的RNA分子的制备C.3.1构建含有PRMV实时荧光KT-PCR检测目标片断的参考质粒分子
人工合成对应于PRMVRNA1的第9931130位碱基的人载体pGH上。
DNA模板
C.3.2PCR扩增得到进行体外转录所需要的以人工合成的含有对应于PRMV的第993-一段长
内138nt的DNA片段，并将其连
30nt的参考质粒分子作为模板，用引物PRMVT7-5F和PRMV-T73R进行PCR扩增，PCR产物经胶回收纯化后件为体外转录模板的DNA片段。PRMV-T7-5F（正向）：
5'TAATACGACTCACTATAGGGAGACTTAGTGGCATGCGTTTAGCAC-3PRMV-T7-3R（反向）：
5'-GGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACG-3°C.3.3体外转录得到进行实时荧光RT-PCR检测PRMV的阳性RNA对照的方法以C.3.2中得到的纯化的PCR产物作为模板，进行体外转录，得到进行实时荧光RT-PCR检测PRMV的阳性RNA对照。方法如下：在室温条件下，严格按照以下顺序在微量离心管中配制以下反应体系：5XT，转录缓冲液（TranscriptionOptimizedbuffer)0.Imol/LDTT
RNase抑制剂（RNaseInhibitor）混合液（4oU/μL）5XNTP
线性化的DNA模板（LinearizerlDNAtemplate)DEPC H,O
总体积
SN/T 39632014
然后.加入0.8μLT7RNAPolymerase,37℃反应2h，反应结束后电冰检测体外转录是否成功，取8μl休外转录产物.加入1μL10XDNase|缓冲液，1μL DNasel（RNase污染;1U/μL)，37 ℃反应 30 min,然后加入 1 μL DNase 终止液(DNasc Stop Solution)终止反应,再在 65 ℃ 下水浴1C min以失活DNasC。至此，得到的反应产物即可作为实时荧光RT-PCR检测 PRMV 的阳性对照 RNA，
注：本反应体系中所用的酶与试剂均购自Pr心I1Cg公司。如川其他公可的酶与试剂·需根据说明做相应的调整。SN/T 3963-—2014
参考文
[11 Klos, F.J.; Fronck, F., Krierem, J.A.: Cation. D.1966. Peach rosctte mosaic transmission andcontrol.Michigan Agrirultural Experinenlal Station Quarterly Bulletin,49:287-293.[2] Lammers, A, H., Allisou, R.F., Ramsdell, D.C.1999.Cloning and sequencing of peachrosetemosaic virusRNAl.VirusResearch,65:5773.10
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