SN/T 3962-2014
基本信息
标准号： SN/T 3962-2014
中文名称：水仙迟季黄化病毒的检疫鉴定方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.zip .pdf
下载大小：1213680
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3962-2014.Detection and identification of Narcissus late season yellows virus.
1范围
SN/T 3962规定了水仙迟季黄化病毒检测的程序和方法。
SN/T 3962适用于进出境水仙中水仙迟季黄化病毒的检测。
2原理
水仙迟季黄化病毒的血清学和分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据。水仙迟季黄化病毒的分类地位、寄主范围、病害症状、分布地区、传播途径、粒体形态、基因组等参见附录A。
3仪器设备、用具及试剂
3.1 仪错设备
高速冷冻离心机、电子天平(1/1 000g)、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、-20℃低温冰箱和-80℃超低温冰箱、凝胶成像分析系统、pH计、微波炉、磁力搅拌器恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台、酶
标仪等。
3.2 用具
各种量程的可调移液器(1000 μL、200 μL、100 μL、20 μL、10 pL、2 μL)、PCR反应管、无RNase离心管(1.5 mL)、研钵、酶联板等。
3.3试剂
酶联板捕获抗原酶联免疫吸附测定法(plate-trapped antigen ELISA,PTA-ELISA)试剂见附录B,巢式RT-PCR试剂见附录C。
4检测与鉴定
4.1 PTA-ELISA
具体方法见附录B
4.2巢式 RT-PCR
具体方法见附录C
1范围
SN/T 3962规定了水仙迟季黄化病毒检测的程序和方法。
SN/T 3962适用于进出境水仙中水仙迟季黄化病毒的检测。
2原理
水仙迟季黄化病毒的血清学和分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据。水仙迟季黄化病毒的分类地位、寄主范围、病害症状、分布地区、传播途径、粒体形态、基因组等参见附录A。
3仪器设备、用具及试剂
3.1 仪错设备
高速冷冻离心机、电子天平(1/1 000g)、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、-20℃低温冰箱和-80℃超低温冰箱、凝胶成像分析系统、pH计、微波炉、磁力搅拌器恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台、酶
标仪等。
3.2 用具
各种量程的可调移液器(1000 μL、200 μL、100 μL、20 μL、10 pL、2 μL)、PCR反应管、无RNase离心管(1.5 mL)、研钵、酶联板等。
3.3试剂
酶联板捕获抗原酶联免疫吸附测定法(plate-trapped antigen ELISA,PTA-ELISA)试剂见附录B,巢式RT-PCR试剂见附录C。
4检测与鉴定
4.1 PTA-ELISA
具体方法见附录B
4.2巢式 RT-PCR
具体方法见附录C
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/13962—2014
水仙迟季黄化病毒的检疫鉴定方法Detection and identification of Narcissus late season yellows virus2014-04-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-11-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出山的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归目。SN/T3962—2014
本标准起草单位：中华人民共和国福建山人境检验检疫局、中华人民共利国厦门出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、福建农林大学。本标准主要越草人：沈建国、屡富荣、马克争、蔡伟、李敏、张志灯、闯诚、张永江、高芳銮关祖建1
1范围
水仙迟季黄化病毒的检疫鉴定方法本标准规定了水仙迟季黄化病毒检测的程序和方法。本标准适用于进出境水仙中水仙迟季黄化病毒的检测2原理
SN/T3962—2014
水仙迟季黄化病毒的血清学和分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据。水仙迟季黄化病毒的分类地位、寄主范围、病害症状、分布地区、传播途径、粒体形态、基因组等参见附录A。3仪器设备、用具及试剂
3.1仪设备
高速冷冻离心机、电子天平（1/1000g）、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、一20℃低温冰箱和一80℃超低温冰箱、凝胶成像分析系统、PH计、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台、酶标仪等。
3.2用具
各种量程的可调移液器（1000uL、200uL100μl20l10μl2μL）PCR反应管、无RNase离心管（1.5mL）、研钵、酶联板等3.3试剂
酶联板捕获抗原酶联免疫吸附测定法(plate-trappedantigenELISA，PTA-ELISA）试剂见附录B，巢式RT-PCR试剂见附录C。
4检测与鉴定
4.1PTA-ELISA
具体方法见附录B。
巢式RT-PCR
具体方法见附录C。
5结果判定与记录
5.1结果判定
当水仙迟季黄化病毒PTAELISA检测结果为阳性，且巢式RT-PCR检测结果也为阳性时，则判SN/T 3962-2014
定为检出水仙迟季黄化病。
当水仙迟季黄化病毒PTA-EI.ISA检测结果为阴性，且巢式RT-PCR检测结果也为阴性时则判定为术检出水仙迟季黄化病毒
若水仙迟季黄化病毒仅PTA-FL.ISA或RT-PCR为阳性，测需进一步采用电镜鉴定或PCR产物序列测定等方法进行器定，
结果记录
记录好各项实验数据，包括样品来源，种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。血清学检测结果保留吸光值的数据报告：分子生物学检测结果保留电泳照片.6样品的保存
经检测结果判定为阿的样品应要善保存在一20℃一80℃超低温冰箱小，并作好登记和标记T作.以备复核用。
riKAoNiKAca
分类地位
中文名：水仙迟季黄化病毒
附录A
（资料性附录）
水仙迟季黄化病毒的背景资料
学名：Narcissus late season yellows virus缩写：NLSYV
分类地位：马铃薯Y病毒科（Potyviridae），马铃薯Y病毒属（Potyoirus）。A.2
寄丰范围
寄主范围较窄，已报道的寄主为水仙。病害症状
SN/T3962—2014
侵染水仙后引起叶片、花茎上出现窄长的褪绿条纹或椭圆状斑块等症状（见图A.1）。图A.1
A.4分布地区
NLSYV侵染水仙后引起的症状
主要分布于英国、荷兰、新西兰等国家。A.5
传播途径
主要由桃蚜（Myauspersicae）传播粒体形态
病毒粒体为线条状，大小约为750nm×12nm。病毒基因组
正义单链RNA病毒，全长约9651bp。3
-TiKAoNiiKAca
SN/T3962—2014
B.1试剂
包被缓冲液（pH9.6）
碳酸钠（NaCO）
碳酸氢钠（NaHCO）
叠氮化钠（NaN）
附录B
（规范性附录）
PTA-ELISA
加人蒸馏水900mL用HCl调节pH至9.6，然后加蒸馏水至1L，4℃储存。B.1.2磷酸盐缓冲液(PBSpH7.4)
氯化钠(NaCI)
磷酸二氢钾（KH,PO）
磷酸氢二钠（NaHPO）
氯化钾（KCI)
叠氮化钠（NaN）
加人900mL蒸馏水溶解，用NaOH或HCI调节pH至7.4，然后加水至1L。B.1.3
每升PBS中加入0.5mL的吐温-20
抗体稀释缓冲液/酶标抗体稀释缓冲液三羟基氨甲烷盐酸盐（Tris-HCI)三羟甲基氨基甲烷(Tris)
氯化钠（NaCI)
叶温-20（Tween20)
脱脂奶粉
加人蒸馏水定容至1L，4℃储存。B.1.5底物（pNPP)缓冲液（pH9.8）氯化镁（MgCl）
叠氮化钠（NaV）
二乙醇胺HN(CH,CH·OH)
溶于800mL蒸馏水中，用HC1调pH至9.8.蒸馏水定容至1L，4℃储存。B.1.6抗体
病毒抗体：水仙迟季黄化病毒抗体酶标抗体：碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG4
-TiKAoNiKAcaWww.bzxZ.net
B.2程序
B.2.1样品制备
SN/T3962—2014
称取0.5g～1.0g待测样品，按1：10（质量体积比）比例加入包被缓冲液，用研钵研磨成浆，8000r/tnin离心5min，上清液即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照做相应的处理或按说明书进行。
B.2.2包被抗原
加入制备好的检测样品，同时设置阴性对照、阳性对照和空白对照。每个处理至少设2个重复。100uL/孔，37℃孵育1h或4℃冰箱孵育过夜，倒去酶联板孔中溶液，用PBST洗涤4次~6次。B.2.3加病毒抗体
将病毒抗体按说明稀释至工作浓度，加入到酶联板的孔中，100L/孔，37℃孵育1h，倒去酶联板孔中溶液，用PBST洗涤4次~6次。B.2.4加酶标抗体
将酶标抗体按说明稀释至工作浓度，加入到酶联板的孔中，100uL孔，37℃孵育1h，倒去酶联板孔中溶液，用PBST洗涤4次～6次B.2.5加底物
将底物pNPP加入到底物缓冲液中，使终质量浓度为1mg/mL（现配现用），按100μL/孔，加入到酶联板中，室温避光孵育
吸光值的测定
用酶联仪在30min、1h和2h于405nm处读取OD值。B.3结果判断
在满足阴性对照孔的OD0s值<0.15阳性对照孔的OD需值/阴性对照孔的OD4o值>5～10，孔的重复性基本一致的质量要求后，样品OD值/阴性对照OD值2，判为阳性。样品OD405值/阴性对照OD4值在國值附近，判为可疑样品，应重新做一次，或用其他方法加以验证。样品OD4值/阴性对照OD45值明显<2，判为阴性。
KAoNiKAca
SN/T 3962—2014
C.1试剂
C.1.1TrizoL裂解液。
C.1.2 5× TBE缓冲液:
Tris 碱
硼酸(H,B
0.5 1101/L, EDTA(pH 8,0)
附录C
（规范性附录）
巢式 RT-PCR 检测方法
补充蒸馅水至1L。用时加蒸馏水释至0.5×TBEC.1.3 三氯甲烷。
C,1.4 异丙醇。
C.1.5 75%乙醇。
无水7醇。
RT缓冲液。
dNTPs:10 mml/L.s
M-MLVRT:200 U/μL
C.1.10 RNasin:40 U/μl,
Tan DNA 聚台酶，
C.1.12PCR缓冲液
C.1.13 MgCl2 :23 mmol/L.
C.1.14引物序列
根据已报道的NLSYV基因组序刻设计2对用于特异性扩增的引物：外侧引物 NLSYVT:5-CCACTTGAAGTCTATCACCA-3外侧7物 NISYVI:5'-CCAAACTAGCATCCTTGTGT-3内侧I物 NILSYVI+5 ATCACATACACACCACGACA 3内侧I物 NLSYV2:3'-GTGTGTCTCTCCGTGTTCTC-3外侧引物PCR产物人小938bp.内侧引物PCR产物大小539bpC.2巢式 RT-PCR 检测
总RNA提取
取 ).1 g样品组织置十研体巾,加人 1. mL PBST缓冲液研磨.4 ℃,1 00 g 离心5 min,取上液并将上清液迅速转移至灭菌的 l.5 ml. 离心管中,并加入 1 ml. Trizol. 试剂,剧烈振荡后,室温静置5 min;4 ℃,12 000 & 离心 10 min,取上清液;加人=氛甲烷 300 μL,剧烈振荡 15 ≤,空温静置 5 min4 ,12 000 g 离心15 min,取上层水相;加人等体积的异闪醇,颠倒混匀后室温下静置 15 mim,4℃：12000g离心10 min，弃上清液;加人1mL75%的乙醇洗涤沉淀2次,每次4℃.7500g离心3min，弃上清液;RNA 沉淀 「燥后,用 20 μL～40 μl 终 LDEPC（焦碳酸乙酯)处理过的 ddH()溶解、一20 ℃保存备用。
TTKAONiKAca
C.2.2 cDNA 合成
SN/T 3962-2014
在PCR管中人2μL总RNA.1μL下游引物(NLSYVr),ddHO5μL，70C水浴10min，迅速冰浴5 inin再加入F别试剂:5× RT 缓冲液 2.5 l、dNTPs(10 mmol/L）1 μL、M-MLVRT（200U/pL)0.5L，RNasin(40U/μI.)0.5μl。42C水浴G0min，70水浴10)tnit，自然冷却至室温，一20C保存备用，
C.2.3PCR 扩增
第-一次PCR反应体系见表C.1.每个反应设置2个重复。检测时以含有病毒口标片段的质粒或含病毒材料作为阳性对照，以不含病毒的健康植物组织作为阴性对照，同时以水代替模板作为空白对照。第次PCR反应条件：9℃预变性3min，然后S4℃变性30s.56℃退火45s、72℃延伸1min35个循环,最后~个循环结束后72℃继续延伸10min，表 C.1PCR 反应体系
试剂名称
Tan DNA案合酶(5 U/μL)
dNTPs (10 mmol/1.)
10× PCR缓冲波(不含 Mg\-）
MgCl.(25 nInuE/L)
NLSYVI (ICμmol/L)
NI$YV 10 μmol/L>
总体积
第二次PCR反应休系见表C.2.取第一次PCR反应-物作为模板祥盘
第二次PCR反应条件：94℃预变性3min：然后94℃变性30s、58℃退火15s、72℃延伸1min，30个循环，最后个循坏结束后72℃继续延伸10min。表 C.2第三次 PCR反应体系
玩剂名称
第一次 PCR 反应产物
TagI3NA聚合酶（2U/rL）
dNTP, (1C mmol/1.)
10× PCR缓冲泼（不含Mg\+）
MgCl (25 rmmol/L)
NLSYV1 (10 μmol/L)
NLSYV2 (10 μmol/L)
总休积
加样量
SN/T 3962—2014
C.2.4琼脂糖凝胶电泳
制备1.5%的琼脂糖凝胶.对PCR产物进行电泳，电泳结束后，在漠化乙锭（EB，浓度为0.5 产g/InL)溶液中染色10 min,再在凝胶成像系统中观察是否扩增出预期的特异性DNA电泳带,拍照并做记录。
C.2.5结果判断
如果阴性对照和空自对照无特异性扩增，阳性对照在539bp大小处有扩增条带，待测样品出现与阳性对照致的扩增条带，则判定为阳性。如果阴性对照和空白对照光特异性护增，阳性对照在539bp大小处有扩增条带，待测样品未出现与阳性对照
致的扩增条带，则判定为阴性。
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水仙迟季黄化病毒的检疫鉴定方法Detection and identification of Narcissus late season yellows virus2014-04-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-11-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出山的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归目。SN/T3962—2014
本标准起草单位：中华人民共和国福建山人境检验检疫局、中华人民共利国厦门出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、福建农林大学。本标准主要越草人：沈建国、屡富荣、马克争、蔡伟、李敏、张志灯、闯诚、张永江、高芳銮关祖建1
1范围
水仙迟季黄化病毒的检疫鉴定方法本标准规定了水仙迟季黄化病毒检测的程序和方法。本标准适用于进出境水仙中水仙迟季黄化病毒的检测2原理
SN/T3962—2014
水仙迟季黄化病毒的血清学和分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据。水仙迟季黄化病毒的分类地位、寄主范围、病害症状、分布地区、传播途径、粒体形态、基因组等参见附录A。3仪器设备、用具及试剂
3.1仪设备
高速冷冻离心机、电子天平（1/1000g）、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、一20℃低温冰箱和一80℃超低温冰箱、凝胶成像分析系统、PH计、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台、酶标仪等。
3.2用具
各种量程的可调移液器（1000uL、200uL100μl20l10μl2μL）PCR反应管、无RNase离心管（1.5mL）、研钵、酶联板等3.3试剂
酶联板捕获抗原酶联免疫吸附测定法(plate-trappedantigenELISA，PTA-ELISA）试剂见附录B，巢式RT-PCR试剂见附录C。
4检测与鉴定
4.1PTA-ELISA
具体方法见附录B。
巢式RT-PCR
具体方法见附录C。
5结果判定与记录
5.1结果判定
当水仙迟季黄化病毒PTAELISA检测结果为阳性，且巢式RT-PCR检测结果也为阳性时，则判SN/T 3962-2014
定为检出水仙迟季黄化病。
当水仙迟季黄化病毒PTA-EI.ISA检测结果为阴性，且巢式RT-PCR检测结果也为阴性时则判定为术检出水仙迟季黄化病毒
若水仙迟季黄化病毒仅PTA-FL.ISA或RT-PCR为阳性，测需进一步采用电镜鉴定或PCR产物序列测定等方法进行器定，
结果记录
记录好各项实验数据，包括样品来源，种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。血清学检测结果保留吸光值的数据报告：分子生物学检测结果保留电泳照片.6样品的保存
经检测结果判定为阿的样品应要善保存在一20℃一80℃超低温冰箱小，并作好登记和标记T作.以备复核用。
riKAoNiKAca
分类地位
中文名：水仙迟季黄化病毒
附录A
（资料性附录）
水仙迟季黄化病毒的背景资料
学名：Narcissus late season yellows virus缩写：NLSYV
分类地位：马铃薯Y病毒科（Potyviridae），马铃薯Y病毒属（Potyoirus）。A.2
寄丰范围
寄主范围较窄，已报道的寄主为水仙。病害症状
SN/T3962—2014
侵染水仙后引起叶片、花茎上出现窄长的褪绿条纹或椭圆状斑块等症状（见图A.1）。图A.1
A.4分布地区
NLSYV侵染水仙后引起的症状
主要分布于英国、荷兰、新西兰等国家。A.5
传播途径
主要由桃蚜（Myauspersicae）传播粒体形态
病毒粒体为线条状，大小约为750nm×12nm。病毒基因组
正义单链RNA病毒，全长约9651bp。3
-TiKAoNiiKAca
SN/T3962—2014
B.1试剂
包被缓冲液（pH9.6）
碳酸钠（NaCO）
碳酸氢钠（NaHCO）
叠氮化钠（NaN）
附录B
（规范性附录）
PTA-ELISA
加人蒸馏水900mL用HCl调节pH至9.6，然后加蒸馏水至1L，4℃储存。B.1.2磷酸盐缓冲液(PBSpH7.4)
氯化钠(NaCI)
磷酸二氢钾（KH,PO）
磷酸氢二钠（NaHPO）
氯化钾（KCI)
叠氮化钠（NaN）
加人900mL蒸馏水溶解，用NaOH或HCI调节pH至7.4，然后加水至1L。B.1.3
每升PBS中加入0.5mL的吐温-20
抗体稀释缓冲液/酶标抗体稀释缓冲液三羟基氨甲烷盐酸盐（Tris-HCI)三羟甲基氨基甲烷(Tris)
氯化钠（NaCI)
叶温-20（Tween20)
脱脂奶粉
加人蒸馏水定容至1L，4℃储存。B.1.5底物（pNPP)缓冲液（pH9.8）氯化镁（MgCl）
叠氮化钠（NaV）
二乙醇胺HN(CH,CH·OH)
溶于800mL蒸馏水中，用HC1调pH至9.8.蒸馏水定容至1L，4℃储存。B.1.6抗体
病毒抗体：水仙迟季黄化病毒抗体酶标抗体：碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG4
-TiKAoNiKAcaWww.bzxZ.net
B.2程序
B.2.1样品制备
SN/T3962—2014
称取0.5g～1.0g待测样品，按1：10（质量体积比）比例加入包被缓冲液，用研钵研磨成浆，8000r/tnin离心5min，上清液即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照做相应的处理或按说明书进行。
B.2.2包被抗原
加入制备好的检测样品，同时设置阴性对照、阳性对照和空白对照。每个处理至少设2个重复。100uL/孔，37℃孵育1h或4℃冰箱孵育过夜，倒去酶联板孔中溶液，用PBST洗涤4次~6次。B.2.3加病毒抗体
将病毒抗体按说明稀释至工作浓度，加入到酶联板的孔中，100L/孔，37℃孵育1h，倒去酶联板孔中溶液，用PBST洗涤4次~6次。B.2.4加酶标抗体
将酶标抗体按说明稀释至工作浓度，加入到酶联板的孔中，100uL孔，37℃孵育1h，倒去酶联板孔中溶液，用PBST洗涤4次～6次B.2.5加底物
将底物pNPP加入到底物缓冲液中，使终质量浓度为1mg/mL（现配现用），按100μL/孔，加入到酶联板中，室温避光孵育
吸光值的测定
用酶联仪在30min、1h和2h于405nm处读取OD值。B.3结果判断
在满足阴性对照孔的OD0s值<0.15阳性对照孔的OD需值/阴性对照孔的OD4o值>5～10，孔的重复性基本一致的质量要求后，样品OD值/阴性对照OD值2，判为阳性。样品OD405值/阴性对照OD4值在國值附近，判为可疑样品，应重新做一次，或用其他方法加以验证。样品OD4值/阴性对照OD45值明显<2，判为阴性。
KAoNiKAca
SN/T 3962—2014
C.1试剂
C.1.1TrizoL裂解液。
C.1.2 5× TBE缓冲液:
Tris 碱
硼酸(H,B
0.5 1101/L, EDTA(pH 8,0)
附录C
（规范性附录）
巢式 RT-PCR 检测方法
补充蒸馅水至1L。用时加蒸馏水释至0.5×TBEC.1.3 三氯甲烷。
C,1.4 异丙醇。
C.1.5 75%乙醇。
无水7醇。
RT缓冲液。
dNTPs:10 mml/L.s
M-MLVRT:200 U/μL
C.1.10 RNasin:40 U/μl,
Tan DNA 聚台酶，
C.1.12PCR缓冲液
C.1.13 MgCl2 :23 mmol/L.
C.1.14引物序列
根据已报道的NLSYV基因组序刻设计2对用于特异性扩增的引物：外侧引物 NLSYVT:5-CCACTTGAAGTCTATCACCA-3外侧7物 NISYVI:5'-CCAAACTAGCATCCTTGTGT-3内侧I物 NILSYVI+5 ATCACATACACACCACGACA 3内侧I物 NLSYV2:3'-GTGTGTCTCTCCGTGTTCTC-3外侧引物PCR产物人小938bp.内侧引物PCR产物大小539bpC.2巢式 RT-PCR 检测
总RNA提取
取 ).1 g样品组织置十研体巾,加人 1. mL PBST缓冲液研磨.4 ℃,1 00 g 离心5 min,取上液并将上清液迅速转移至灭菌的 l.5 ml. 离心管中,并加入 1 ml. Trizol. 试剂,剧烈振荡后,室温静置5 min;4 ℃,12 000 & 离心 10 min,取上清液;加人=氛甲烷 300 μL,剧烈振荡 15 ≤,空温静置 5 min4 ,12 000 g 离心15 min,取上层水相;加人等体积的异闪醇,颠倒混匀后室温下静置 15 mim,4℃：12000g离心10 min，弃上清液;加人1mL75%的乙醇洗涤沉淀2次,每次4℃.7500g离心3min，弃上清液;RNA 沉淀 「燥后,用 20 μL～40 μl 终 LDEPC（焦碳酸乙酯)处理过的 ddH()溶解、一20 ℃保存备用。
TTKAONiKAca
C.2.2 cDNA 合成
SN/T 3962-2014
在PCR管中人2μL总RNA.1μL下游引物(NLSYVr),ddHO5μL，70C水浴10min，迅速冰浴5 inin再加入F别试剂:5× RT 缓冲液 2.5 l、dNTPs(10 mmol/L）1 μL、M-MLVRT（200U/pL)0.5L，RNasin(40U/μI.)0.5μl。42C水浴G0min，70水浴10)tnit，自然冷却至室温，一20C保存备用，
C.2.3PCR 扩增
第-一次PCR反应体系见表C.1.每个反应设置2个重复。检测时以含有病毒口标片段的质粒或含病毒材料作为阳性对照，以不含病毒的健康植物组织作为阴性对照，同时以水代替模板作为空白对照。第次PCR反应条件：9℃预变性3min，然后S4℃变性30s.56℃退火45s、72℃延伸1min35个循环,最后~个循环结束后72℃继续延伸10min，表 C.1PCR 反应体系
试剂名称
Tan DNA案合酶(5 U/μL)
dNTPs (10 mmol/1.)
10× PCR缓冲波(不含 Mg\-）
MgCl.(25 nInuE/L)
NLSYVI (ICμmol/L)
NI$YV 10 μmol/L>
总体积
第二次PCR反应休系见表C.2.取第一次PCR反应-物作为模板祥盘
第二次PCR反应条件：94℃预变性3min：然后94℃变性30s、58℃退火15s、72℃延伸1min，30个循环，最后个循坏结束后72℃继续延伸10min。表 C.2第三次 PCR反应体系
玩剂名称
第一次 PCR 反应产物
TagI3NA聚合酶（2U/rL）
dNTP, (1C mmol/1.)
10× PCR缓冲泼（不含Mg\+）
MgCl (25 rmmol/L)
NLSYV1 (10 μmol/L)
NLSYV2 (10 μmol/L)
总休积
加样量
SN/T 3962—2014
C.2.4琼脂糖凝胶电泳
制备1.5%的琼脂糖凝胶.对PCR产物进行电泳，电泳结束后，在漠化乙锭（EB，浓度为0.5 产g/InL)溶液中染色10 min,再在凝胶成像系统中观察是否扩增出预期的特异性DNA电泳带,拍照并做记录。
C.2.5结果判断
如果阴性对照和空自对照无特异性扩增，阳性对照在539bp大小处有扩增条带，待测样品出现与阳性对照致的扩增条带，则判定为阳性。如果阴性对照和空白对照光特异性护增，阳性对照在539bp大小处有扩增条带，待测样品未出现与阳性对照
致的扩增条带，则判定为阴性。
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