SN/T 3961-2014.Detection and identification of Canna yellow mottle virus.
1范围
SN/T 3961规定了美人蕉黄斑驳病毒检测的程序和方法。
SN/T 3961适用于进出境植物及其产品中美人蕉黄斑驳病毒的检测。
2原理
美人蕉黄斑驳病毒的基因组特征是制定本检疫鉴定方法的主要依据。美人蕉黄斑驳病毒的分类地位、寄主范围、病害症状、分布地区、传播途径、粒体形态、基因组等参见附录A。
3仪器设备、用具及试剂
3.1仪器设备
高速冷冻离心机、电子天平(1/1000 g)、实时荧光PCR、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、-20 °C低温、冰箱和-80℃超低温冰箱凝胶成像分析系统、pH计、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台等。
3.2 用具
各种量程的可调移液器(1000uL、200μI、100μL、20μL、10μL、2μL)、PCR反应管、离心管(1.5 mL)、研钵等。
3..3试剂
巢式PCR试剂见附录B,实时荧光PCR试剂见附录C。
4检测与鉴定
4.1巢式PCR .
具体方法见附录B。
4.2实时荧光 PCR
具体方法见附录C。
5结果判定与记录
5.1 结果判定
——当巢式PCR、实时荧光PCR两种检测方法的检测结果均呈阳性时,则判定为检出CaYMV。
——当巢式PCR、实时荧光PCR两种检测方法的检测结果均呈阴性时,则判定为未检出CaYMV。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3961—2014
美人蕉黄斑驳病毒的检疫鉴定方法Detection and identification of Canna yellow mottle virus2014-04-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-11-01实施
本标准按照GB/T1.1
2009给出的规则起草。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T 3961-2014
本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院.福建农林大学。本标推主要起草人：沈建国、黄伙水、陈劲松、李、廖富荣、张水江、蔡伟、闫诚、翁瑞泉、吴祖建。1范围
美人蕉黄斑驳病毒的检疫鉴定方法本标准规定了美人蕉黄斑驳病毒检测的程序和方法本标准适用于进出境植物及其产品中美人蕉黄斑驳病毒的检测。2原理
美人蕉黄斑驳病毒的基因组特征是制定本检疫SN/T3961—2014
定方法的主要依据。美人蕉黄斑驳病毒的分类地位、寄主范围、病害症状、分布地区、传播途径、粒体形态、基因组等参见附录A。3仪器设备、用具及试剂
仪器设备
高速冷冻离心机、电子天平（1/1000g）、实时荧光PCR.PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、一20℃低温冰箱和一80℃超低温冰箱、凝胶成像分析系统、pH计、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台等。
3.2用具
各种量程的可调移液器（1000uL2200100
（1.5mL）、研钵等。
3.3试剂
巢式PCR试剂见附录B，实时荧光PCR试剂见附录C4检测与鉴定
巢式PCR
具体方法见附录B。
4.2实时荧光PCR
具体方法见附录C。
5结果判定与记录
5.1结果判定
、IOML、2uL)、PCR反应管、离心管当巢式PCR，实时荧光PCR两种检测方法的检测结果均呈阳性时，则判定为检出CaYMV当巢式PCR、实时荧光PCR两种检测方法的检测结果均呈阴性时，则判定为未检出CaYMVSN/T 3961—2014
一若巢式 PCR或实时荧光 PCR 为阳性;则需进·步采用电镜鉴定或 PCR产物序列测定等方法进行鉴定。
结果记录
记录好各项实验数据，包括样品来源，种类、时间，实验的时间、地点、力法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。分子尘物学检测结果保留电泳照片，序列测定结果保留测序报告图，6样品的保存
经检测绪果判定为阳性的择品应要善保存在一20 汇～一80 ℃:超低温冰箱下,并作好登记和标记工作，以备复核用bzxz.net
riKAoNKAca
A.1分类地位
中文名：美人蕉黄斑驳病毒
附录A
（资料性附录）
美人蕉黄斑驳病毒的背景资料
学名：Cannayellowmottlevirus缩写：CaYMV
SN/T3961-—2014
分类地位：花椰菜花叶病毒科（Caulimouiridae），杆状DNA病毒属（Badnavirus）。A.2
寄主范围
已报道的自然寄主为美人蕉。
病害症状
侵染美人焦后可以产生多种症状，典型症状包括叶脉黄化、叶片产生褪绿斑、茎杆和花上出现条斑（见图A.1)。
图A.1CaYMV典型症状
A.4分布地区
主要分布于日本、美国、意大利、荷兰等国家。A.5
传播途径
主要通过无性殖材料传播。该病毒的传播介体尚未明确，3
ikAoNrKAca
SN/T3961—2014
粒体形态
病毒粒体呈杆状，长约120 nm-~130 nm,直径约28 I1。病毒基因组
基凶组为环状双链IDNA,含有3个ORF，-TTKAONiKAca
B.1试剂
附录B
（规范性附录）
巢式PCR检测方法
TES:100mmol/LTris(pH8.0),10mmol/LEDTA,2%SDS。B.1.1
SN/T3961-—2014
B.1.2CTAB提取缓冲液:20g/LCTAB,1.4mol/LNaCl,0.1mol/LTris-HCl,20mmol/LEDTA(pH8.0)。
三氯甲烷。
异丙醇。
异戊醇。
无水乙醇。
70%乙醇。
蛋白酶K。
引物序列：
根据已报道的CaYMV基因组序列设计2对用于特异性扩增的引物外侧物CaYMV1.5-TAGGGCAGTCAAGGATTAAGC3外侧引物CaYMV2:5-CAATCTTGGCGTAGAACGAG3内侧引物CaYMV3：5-ACTGCGTCAGTTTCTCGC内侧引物CaYMV4:5'-GGCCTGGATCTCAGCATCTA-3外侧引物PCR产物大小540bp，内侧引物PCR产物大小352bpB.2检测
B.2.1DNA提取
1.5mL高心管，加人500μLTES，50μg~取病叶50mg～100mg，用液氧充分研磨后，转置100μg蛋白酶K，56℃温育0.5h～1h，期间轻轻摇动混匀：加入一定体积10mol/LNaCl使之终浓度为1.4mol/L），1/10倍体积10%CTAB，65℃温育min；加
倍体积三氯甲烷/异戊醇（24：1），轻摇混勾，置冰上30min，4℃下12000r/min离心10min；取上请液，加人225μLNH.AC（5mol/L），混匀，放置冰上1h，4℃下12000r/min离心10min；取上清液，加3μLRnase，37℃温育15min，4℃下12000r/min离心10min；取上清液，加0.5倍体积异内醇，置冰上15min～30min，4℃下12000r/min离心10min：奔上清液，沉淀用70%乙醇（预冷）洗涤2次，干燥后溶解于50μLTE中，一20℃冷冻保存备用。
B.2.2PCR扩增
第一次PCR反应体系见表B.1，每个反应设置2个重复。检测时以含有病毒目标片段的质粒或含病毒材料作为阳性对照，以不含病毒的健康植物组织作为阴性对照，同时以水代替模板作为空白对照。第一次PCR反应条件：94℃预变性3min，然后94℃变性30$、53℃退火45s、72℃延伸1min，35个循环，最后一个循环结束后72℃继续延伸10min。5
-KAONKAca
SN/T 3961—2014
试剂名称
Tag DNA 案合酶(2.5 L/μL)
tINTPs(10 nmol/L)
10×『C缓冲波（不含Mg’）
MgCl, (25 mmal/L)
Ca YMV I(10 mol/L)
CaYMV 2(10 μmoi/1.)
总体积
第一次 PCR 反应体系
第二次PCR反虚体系见表B,2.收第一次PCR反应产物作为模板。加样量
25 μL
第二次PCR反应条件，94℃预变性3min，然后94℃变性30、54℃退火45、72℃延仲1min，30个循环，最后-个循坏结束后72℃继续延伸10 min。表B.2第二次PCR反应体系
试剂名称
第一次 PCR反应产物
Tan NA 聚合(2.5 U/μl.)
dNTP:(10 mmol/L)
10×PCR缓冲腋（不含Mg）
MgCl; (25 mmol/L)
CaYMV3(JU pμmol/L)
CaYMV4(10 μmol/1.)
总体积
B.2.3琼脂糖凝胶电泳
加梓量
制备1.5%的琼脂糖凝胶，对PCR产物进行电泳。电泳结束后，在溴化乙键(EB,浓度为 0.5 g/mL)溶羧染色 1C min,再在凝胶成像系统中观察是否扩增出预期的特异性 DNA 电泳带,拍照并做记录
B,2.4结果判断
如果阴性对照和空白对照,特开性扩增，阳性对照在352bp大小处有扩增条带，待测样品出现与6
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阳性对照一致的扩增条带，则判定为阳性。SN/T3961—2014
如果阴性对照和空白对照无特异性扩增，阳性对照在352 bp大小处有扩增条带，待测样品未出现与阳性对照一致的扩增条带，则判定为阴性。B,2.5序刻测定
PCR产物纯化、回收后，进行克隆、测序，或者直接测序。把测序所得到的核苷酸序列与已知的CaYMV相应序列进行比对(利用NCBI 网站上的BLAST软件进行比对，网址为http;//www,nchi.nlm.nih.gov/BLAST/)。
SN/T 3961—2014
C.1引物和探针
引物序列：CaYMVF
CaYMVR
附录心
（规范性附录）
实时荧光PCR检测方法
3'-TGCGAACCTGCCTGAAATG-3
5'ATACATCCGTCTGTTTCAAGTACCAT-3探针序列:CaYMV-Proh5FAM-AATTACCCCCCAGGGACGCCG-TAMRA-3C.2
实时荧光PCR检测
DNA提取见I3.2.1，然后迹行实时荧光PCR检测。在25μl.的反应体系中加人：12.5μL2×Premix Ex Taq,0.75 μl, CaYMV-F(10 μmol/1.),0.75 μL CaYMV-R(10 μmol/1.),0.5 μl. CaYMV-Probe(10μmol/L）、3μlDNA7.5μLddH0。反应条件为：95℃预变性30*，然后05℃5s.60℃30%，共40个循环。
实时荧光PCR结果判定
如果阳性对照（t值35.且山现典型的扩增西线，阴性对照和空白对照的（t值≥40，且无护增曲线：
待测样品（1值35时，且出现典型的扩增曲线，则判定为附性：-待测样品35Ct.值~40时，应重新进行测试，若重新测试35小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。