SN/T 3960-2014
基本信息
标准号： SN/T 3960-2014
中文名称：蓝莓矮化植原体检疫鉴定方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3960-2014.Detection and identification of Blueberry stunt phytoplasma.
1范围
SN/T 3960规定了蓝莓矮化植原体的检疫和鉴定方法。
SN/T 3960适用于进出境蓝莓树苗木及蓝莓产品中蓝莓矮化植原体的检疫和鉴定。
2蓝莓矮化植原体基本信息
英文名:Blueberry stunt phytoplasma
分类地位:软壁菌门(Tenericutes)，柔膜菌纲(Mollieutes)，非固醇菌原体目(Acholeplasmatales)，非固醇菌原体科(Acholeplasmataceae)，植原体属(Phytoplasma),16Sr I植原体组D亚组。
蓝莓矮化植原体的其他信息参见附录A。
3方法原理
蓝莓矮化植原体生物学特性和基因特性作为本标准鉴定方法的主要依据。
DAPI染色后的形态学观察为初步筛查方法;以植原体核糖体1I6SrDNA通用引物进行PCR扩增、测序及限制性内切酶指纹图谱为主要的判定依据。
4仪器用具和主要 试剂
4.1 仪器
PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、制冰机、台式冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、涡旋振荡器、微量进样器、电泳仪凝胶成像系统、荧光显微镜、透射电子显微镜、超薄切片机等。
4.2 用具
移液器、研钵、离心管、PCR管、量筒、烧杯、酒精灯、镊子等
1范围
SN/T 3960规定了蓝莓矮化植原体的检疫和鉴定方法。
SN/T 3960适用于进出境蓝莓树苗木及蓝莓产品中蓝莓矮化植原体的检疫和鉴定。
2蓝莓矮化植原体基本信息
英文名:Blueberry stunt phytoplasma
分类地位:软壁菌门(Tenericutes)，柔膜菌纲(Mollieutes)，非固醇菌原体目(Acholeplasmatales)，非固醇菌原体科(Acholeplasmataceae)，植原体属(Phytoplasma),16Sr I植原体组D亚组。
蓝莓矮化植原体的其他信息参见附录A。
3方法原理
蓝莓矮化植原体生物学特性和基因特性作为本标准鉴定方法的主要依据。
DAPI染色后的形态学观察为初步筛查方法;以植原体核糖体1I6SrDNA通用引物进行PCR扩增、测序及限制性内切酶指纹图谱为主要的判定依据。
4仪器用具和主要 试剂
4.1 仪器
PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、制冰机、台式冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、涡旋振荡器、微量进样器、电泳仪凝胶成像系统、荧光显微镜、透射电子显微镜、超薄切片机等。
4.2 用具
移液器、研钵、离心管、PCR管、量筒、烧杯、酒精灯、镊子等
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3960—2014
蓝莓矮化植原体检疫鉴定方法
Detection and identification of Blueberry stunt phytoplasma2014-04-09 发布
华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-11-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起节。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/13960—2014
本标准起草单位；中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准士要起草人：李鑫、林长军、王有福、姜一、曹冬梅、胡强、刘卉秋，江秀芬、徐凤敏、牟海背。1范围
蓝莓矮化植原体检疫鉴定方法
本标准规定了蓝莓矮化植原体的检疫和鉴定方法本标准适用于进出境蓝莓树苗木及蓝莓产品中蓝莓矮化植原体的检疫和鉴定。2蓝莓矮化植原体基本信息
英文名：BlueberrystuntphytoplasmeSN/T3960-2014
分类地位：软壁菌门（Tenericutes），柔膜菌纲（Mollieutes），非固醇菌原体目（Acholeplasmatales），非固醇菌原体科（Acholeplasmataceae），植原体属（Phytoplasma），loSrI植原体组D亚组。蓝莓矮化植原体的其他信息参见附录A。3方法原理
蓝莓矮化植原体生物学特性和基固特性作为本标准鉴定方法的主要依据DAPI染色后的形态学观察为初步筛查方法：以植原体核糖体16SrDNA通用引物进行PCR扩增、测序及限制性内切酶指纹图谱为主要的判定依据。4仪器用具和主要试剂
4.1仪器
PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、制冰机、台式冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰凝胶成
箱、涡旋振荡器、微量进样器、电泳仪4.2用具
统、荧光显微镜、透射电子显微镜、超薄切片机等。移液器、研钵、离心管、PCR管、量简、烧杯、酒精灯、镊子等4.3主要试剂
CTAB缓冲液
Tris-HCl
PVP-40
100mmol/L(pH8.0)
20mmol/L(pH8.0)
4.3.2PBS缓冲液（0.2mol/LpH7.4）无水NaH,PO
SN/T 3960-2014
加水定穿至1000ml。
4.3.3其他试剂
DAPI.巴比妥钠乙酸钠、2%酸水溶液、戊二醛、0.1mol/L盐酸苯酚、三氯甲烷、异戊醇、异闪醇、乙醇,琼脂糖,Goldview核酸染料,PCR缓冲液,MgCldXTP,Tar DNA聚合酶,引物等。5检测鉴定方法
5.1症状观察
5.1.1现场查验
现场对监莓苗木进行观察，症状描述参见附求A，选取可疑症状植株样品利随机样品带回实验室检测。
5.1.2DAPI染色
选取约嫩组织<新叶叶桢、枝销，蒸杆及根部韧皮部组织），切片，用1ug/mI.DAPI溶液（4，6-二晰基-2-苯基吲哚）染色，在46)111激发条件，荧光显微镜观察，代韧皮部筛管部位有明显的监色炭光信号表明有植原体存在。因植株内植原体分布不均，故每个样品应选取不同部位的幼嫩材料进行检测。5.1.3透射电镜观察
将采集的样品制备超薄划片，通过电子显微镜观察植物韧皮部是否存在植原体拉体。具体力法见附录 B。
5.2INA提取
处理样品的方法主要为植物组中植原体基凶组DNA提取方法，收C.18样品置于预冷的研钵中，在液氮中将样品研磨成粉木状，并迅速转人1.5mI的离心管中。加人800ul.65预热的(TAB提取缓冲液-涡旋振荡充分混勾，65℃水浴5Crin,每隔10min轻轻颠倒混勺一次，冷却至室湿，加入等体积的的三氛甲烷：异戊醇（24：[），轻轻颠倒混匀静置10min，4℃10000r/min离心10min，取上消液，重复一次，加人等体积异闪醇或2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻颠倒混匀，出现DNA絮状沉淀，在冰「:放置30min沉淀DNA,4℃12000r/min离心10rnin弃1清液.离心管倒置滤纸上燥，用80070※冰乙醇清洗沉淀两次，以除去盐离子等。加人800±170%冰乙醇后，轻轻颠倒离心管几次，将沉淀于底部的DA弹起，放置离心管10min,1℃10000/min离心1min，弃上清液，重复一次，风于L除乙醇。可重复上还步骤一次。最后在沉淀中加人200ul.TE溶解TNA沉淀，一20℃保存备用，
植原体基因组DNA提取方法也可采用商品化试剂盒提取。5.3通用引物 PCR 扩增及序列测定用2对引物避行巢式PCR反应及凝胶电泳检测.扩增植原体16SrDNA序列，方法见附录C。5.4序列分析鉴定
将第_轮PCR产物（引物P1A/16S-SR，产物大小为152bp)进行序列测定，在Gcnebank1进行序列比对：
riKAONiKAca
5RFLP分析
SN/T 3960—2014
应用软件(iPhyClassifier)对植原体16S rDNA序列进行分析。分析图谱见附录D。6结果判定
6.1形态学鉴定
表现症状与 A,1捕述一致且 5.1.2 检测实验中 DAPI 染色观察结果显示蓝色荧光,或 5.1.3 中通过电子显微镜观察，发现韧皮部筛管中含有直径为500m～1000m的形.椭圆形，不规则形状等的菌原体，可初步判定为植原体。6.2分子生物学鉴定
在 5.5 中,若巢氏 PCR扩增后的序列经 17 种限制性内切酶酶切后与附录 D中图谱一致,可判定该样品携带蓝莓矮化植原体。
7样品保存与复核
7.1样品保存与处理
样品经登记和经手人签字后妥善保存，对检出蓝每矮化植原体的样品应保存于一20冰箱中，以备复核。该类样品保存期满6个月后，应经商压灭菌后方可处理。2结果记录与资料保存
完整的实验记录包括样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点，方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳照片，并附DNVA测序原始图谱及限制性内切酶指纹图谱。3
rKAoNrKAca
SN/T3960—2014
A.1 表现症状
附录A
（资料性附录）
蓝莓矮化植原体资料
该病原物可侵染蓝莓，感病植株症状因生长时期、染病树龄及品种而异。染病植株可发生矮化、节间变短、丛枝及活力下降等症状，在6月中句和9月下旬表现明显。小而向下卷曲的叶片沿着叶边缘和侧脉间变黄，呈黄绿斑驳状，这些斑驳区域在晚秋时过早地变成鲜红色，但中脉仍为深蓝绿色。结果少而硬、口味不佳、成熟晚，较健康果实附着树丛时间更长A.2寄主范围
该病原物寄主范围广泛，蓝莓树是主要的寄主还可侵染草莓（Fragariaananassa）、洋葱（AlliumcepaLinn）、芹菜（Apiumgraveolens）油菜（Brassica胡萝卜（Daucuscarota）等。
A.3传播途径
ampestrisL.）甘蓝（BrussincaoleraceaBail.)近距离传播主要由取食植株韧皮部的个体昆虫传播，如叶蝉（Fieberiellaflorii）等；种苗的调运可以使植原体进行远距离传播。
A.4地理分布
地都有分布
在欧洲北美、亚洲、墨西哥和巴西等-rKAoNiKAca
B.1试剂试材
B.1.1钱酸固定液
附录B
（规范性附录）
电子显微观察
巴比妥-乙酸缓冲液的1%钱酸固定液的配制如下巴比妥钠
乙酸钠
加双蒸馏水至100mL形成溶液
2%钱酸水溶液
溶液?
0.1 mol/L盐酸
SN/T3960-—2014
加双蒸馏水至25.0mL，混合后用0.1mol/L盐酸调节pH至7.2.即为1%钱酸固定液，在冰箱保存备用。
戊二醛固定液
般为25%戊二醛水溶液。可在除巴比妥以外的任何缓冲液中使用，终浓度为25%。B.1.3 环氧树脂
Epon812
顺丁烯二酸酐（DDSA）
邻苯二甲酸二丁酯（D.B.P)
二乙基苯胺（D.M.P-30）
将Epon812倒入烧杯中，置80
0温箱融化备用，按上述比例，顺序力加人顺丁烯二酸酐，充分搅拌，待溶化呈透明，至室温，再加人邻莱未二甲较一了酯，仔细搅拌，然后慢慢逐滴加入二乙基苯胺，边加边搅拌，至包埋剂呈红棕色。
B.1.4Formvar膜
将聚乙烯醇缩甲醛溶于三氯甲烷，配成0.2%3%溶液，存于冰箱备用，制膜时取一块干净玻璃片插人溶液中，取出倾斜待三氯甲烷挥发，用镊子沿玻璃边划痕，再将玻璃倾斜浸人蒸馏水中，薄膜即从玻璃上脱落下来漂浮于水面，取干净的铜网摆上，压紧，在用一块滤纸覆盖其上，捞起后置于培养血干煤备用。
B.2实验步骤
B.2.1取材
选取呈现症状的叶片或者幼嫩茎，用刀片切取叶脉、叶柄或者幼嫩枝条，大小为3mm。取健康叶片作为阴性对照。
-TKAONKAca
SN/T 3960 --2014
B.2.2固定
采用成二醛-饿酸双固定法。样品在25%戊二醛迹行前固定2h后，PBS(0.2I1p1/I.，pH7.4)清洗3次。然后用1%钱酸后固定2 h,PBS清洗3次。B.2.3脱水
采用乙醇和系列梯度脱水。30%乙醇/15min-50%乙醇/15tnin-→70%乙醇/15min→80%丙酮/15 min-90%内酮/15 min→100%内/15 min，样品可在70%乙醇中停留过夜。B.2.4渗透
脱水后的组织块在内酮/树脂(11)中渗透 3 d,再在全树脂中渗透24 h。B.2.5包埋
用环氧树脂做包埋剂。将组织块放在胶囊中央，滴人包埋剂。于37℃下24h,15℃下24h.60℃下24 h。
B,2.,6切片
在超薄切片机上将固化的组织块作切片。选择好的切片，将切片用二中苯蒸发展开，用载有Formvar膜的铜网捞起，置培养血内十燥，保存。B,2.7切片染色
采用乙酸双氰铀和柠像酸铅双染色。取染色蜡盘数个，将乙酸双氧铀染色滴人蜡盘上。取带切片的铜网，人染色滴中，染20Inin～30min,然后取出铺网，蒸馏水洗去多余染羧滤纸吸干。将铜网再放入另~-蜡盘，滴人柠機酸铅染液，使匍网翻扣在染色液滴上，20min-~30min,再用0.1mol/L氢氧化钠漂洗「净，滤纸吸「。
B.2.8显微镜观察
透射电子显微镜观察植原体形态，观察韧皮部筛管中是否含有直径为500[m~1000m的圆形、椭圆形、不规则形状等的菌原体.茗有可初步判定为植原体。6
-TKAONKAca
C,1引物序列(见表 C,1)
第-轮 PCR
第二轮 PCR
引物名称
PCR 反应体系及参数
附录C
（规范性附录）
PCR凝胶电泳检测
表 C,1 引物序列
引物序列3
AAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG GAT TCGT CGT TCA TCG GCT CTT
AAC CCT GGC GGC GCG CCT AAT ACGHGT CTG TCA AAA CTG AAG ATGPCK反应体系（见表C.2)
试剂名称
10×PCR缓冲液
2.5 mmol/I, dNJP
10 μmol/1. 上游引物
10 umol/1.下游引物
5UiuLTg DNA华合酶
1C8μL模板DNA
双蕉水
总体积
PCR反应体系
加样/uT.Www.bzxZ.net
$N/T 3960—2014
扩增产物长度
i525bp
注：INA模板的取量应根据DNA的提取浓度、纯度而调节；第·轮与第纶PCR购采川此体系。C.2,2阴性对照,阳性对照和空白对照的设置阴性对照：以键康的叶片DNA为模板；阳性对照：以携带有蓝莓矮化植原体16SrDVA序列的质粒或DVA为模板；PCR反应的空白对照：以灭荫去离了水代替DNVA模板。C.2.3PCR的反应条件
用引物P1/P7进行第-轮PCR，反应条件为：95℃/8min:95℃/605.55℃/605.72℃/995,
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蓝莓矮化植原体检疫鉴定方法
Detection and identification of Blueberry stunt phytoplasma2014-04-09 发布
华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-11-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起节。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/13960—2014
本标准起草单位；中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准士要起草人：李鑫、林长军、王有福、姜一、曹冬梅、胡强、刘卉秋，江秀芬、徐凤敏、牟海背。1范围
蓝莓矮化植原体检疫鉴定方法
本标准规定了蓝莓矮化植原体的检疫和鉴定方法本标准适用于进出境蓝莓树苗木及蓝莓产品中蓝莓矮化植原体的检疫和鉴定。2蓝莓矮化植原体基本信息
英文名：BlueberrystuntphytoplasmeSN/T3960-2014
分类地位：软壁菌门（Tenericutes），柔膜菌纲（Mollieutes），非固醇菌原体目（Acholeplasmatales），非固醇菌原体科（Acholeplasmataceae），植原体属（Phytoplasma），loSrI植原体组D亚组。蓝莓矮化植原体的其他信息参见附录A。3方法原理
蓝莓矮化植原体生物学特性和基固特性作为本标准鉴定方法的主要依据DAPI染色后的形态学观察为初步筛查方法：以植原体核糖体16SrDNA通用引物进行PCR扩增、测序及限制性内切酶指纹图谱为主要的判定依据。4仪器用具和主要试剂
4.1仪器
PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、制冰机、台式冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰凝胶成
箱、涡旋振荡器、微量进样器、电泳仪4.2用具
统、荧光显微镜、透射电子显微镜、超薄切片机等。移液器、研钵、离心管、PCR管、量简、烧杯、酒精灯、镊子等4.3主要试剂
CTAB缓冲液
Tris-HCl
PVP-40
100mmol/L(pH8.0)
20mmol/L(pH8.0)
4.3.2PBS缓冲液（0.2mol/LpH7.4）无水NaH,PO
SN/T 3960-2014
加水定穿至1000ml。
4.3.3其他试剂
DAPI.巴比妥钠乙酸钠、2%酸水溶液、戊二醛、0.1mol/L盐酸苯酚、三氯甲烷、异戊醇、异闪醇、乙醇,琼脂糖,Goldview核酸染料,PCR缓冲液,MgCldXTP,Tar DNA聚合酶,引物等。5检测鉴定方法
5.1症状观察
5.1.1现场查验
现场对监莓苗木进行观察，症状描述参见附求A，选取可疑症状植株样品利随机样品带回实验室检测。
5.1.2DAPI染色
选取约嫩组织<新叶叶桢、枝销，蒸杆及根部韧皮部组织），切片，用1ug/mI.DAPI溶液（4，6-二晰基-2-苯基吲哚）染色，在46)111激发条件，荧光显微镜观察，代韧皮部筛管部位有明显的监色炭光信号表明有植原体存在。因植株内植原体分布不均，故每个样品应选取不同部位的幼嫩材料进行检测。5.1.3透射电镜观察
将采集的样品制备超薄划片，通过电子显微镜观察植物韧皮部是否存在植原体拉体。具体力法见附录 B。
5.2INA提取
处理样品的方法主要为植物组中植原体基凶组DNA提取方法，收C.18样品置于预冷的研钵中，在液氮中将样品研磨成粉木状，并迅速转人1.5mI的离心管中。加人800ul.65预热的(TAB提取缓冲液-涡旋振荡充分混勾，65℃水浴5Crin,每隔10min轻轻颠倒混勺一次，冷却至室湿，加入等体积的的三氛甲烷：异戊醇（24：[），轻轻颠倒混匀静置10min，4℃10000r/min离心10min，取上消液，重复一次，加人等体积异闪醇或2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻颠倒混匀，出现DNA絮状沉淀，在冰「:放置30min沉淀DNA,4℃12000r/min离心10rnin弃1清液.离心管倒置滤纸上燥，用80070※冰乙醇清洗沉淀两次，以除去盐离子等。加人800±170%冰乙醇后，轻轻颠倒离心管几次，将沉淀于底部的DA弹起，放置离心管10min,1℃10000/min离心1min，弃上清液，重复一次，风于L除乙醇。可重复上还步骤一次。最后在沉淀中加人200ul.TE溶解TNA沉淀，一20℃保存备用，
植原体基因组DNA提取方法也可采用商品化试剂盒提取。5.3通用引物 PCR 扩增及序列测定用2对引物避行巢式PCR反应及凝胶电泳检测.扩增植原体16SrDNA序列，方法见附录C。5.4序列分析鉴定
将第_轮PCR产物（引物P1A/16S-SR，产物大小为152bp)进行序列测定，在Gcnebank1进行序列比对：
riKAONiKAca
5RFLP分析
SN/T 3960—2014
应用软件(iPhyClassifier)对植原体16S rDNA序列进行分析。分析图谱见附录D。6结果判定
6.1形态学鉴定
表现症状与 A,1捕述一致且 5.1.2 检测实验中 DAPI 染色观察结果显示蓝色荧光,或 5.1.3 中通过电子显微镜观察，发现韧皮部筛管中含有直径为500m～1000m的形.椭圆形，不规则形状等的菌原体，可初步判定为植原体。6.2分子生物学鉴定
在 5.5 中,若巢氏 PCR扩增后的序列经 17 种限制性内切酶酶切后与附录 D中图谱一致,可判定该样品携带蓝莓矮化植原体。
7样品保存与复核
7.1样品保存与处理
样品经登记和经手人签字后妥善保存，对检出蓝每矮化植原体的样品应保存于一20冰箱中，以备复核。该类样品保存期满6个月后，应经商压灭菌后方可处理。2结果记录与资料保存
完整的实验记录包括样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点，方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳照片，并附DNVA测序原始图谱及限制性内切酶指纹图谱。3
rKAoNrKAca
SN/T3960—2014
A.1 表现症状
附录A
（资料性附录）
蓝莓矮化植原体资料
该病原物可侵染蓝莓，感病植株症状因生长时期、染病树龄及品种而异。染病植株可发生矮化、节间变短、丛枝及活力下降等症状，在6月中句和9月下旬表现明显。小而向下卷曲的叶片沿着叶边缘和侧脉间变黄，呈黄绿斑驳状，这些斑驳区域在晚秋时过早地变成鲜红色，但中脉仍为深蓝绿色。结果少而硬、口味不佳、成熟晚，较健康果实附着树丛时间更长A.2寄主范围
该病原物寄主范围广泛，蓝莓树是主要的寄主还可侵染草莓（Fragariaananassa）、洋葱（AlliumcepaLinn）、芹菜（Apiumgraveolens）油菜（Brassica胡萝卜（Daucuscarota）等。
A.3传播途径
ampestrisL.）甘蓝（BrussincaoleraceaBail.)近距离传播主要由取食植株韧皮部的个体昆虫传播，如叶蝉（Fieberiellaflorii）等；种苗的调运可以使植原体进行远距离传播。
A.4地理分布
地都有分布
在欧洲北美、亚洲、墨西哥和巴西等-rKAoNiKAca
B.1试剂试材
B.1.1钱酸固定液
附录B
（规范性附录）
电子显微观察
巴比妥-乙酸缓冲液的1%钱酸固定液的配制如下巴比妥钠
乙酸钠
加双蒸馏水至100mL形成溶液
2%钱酸水溶液
溶液?
0.1 mol/L盐酸
SN/T3960-—2014
加双蒸馏水至25.0mL，混合后用0.1mol/L盐酸调节pH至7.2.即为1%钱酸固定液，在冰箱保存备用。
戊二醛固定液
般为25%戊二醛水溶液。可在除巴比妥以外的任何缓冲液中使用，终浓度为25%。B.1.3 环氧树脂
Epon812
顺丁烯二酸酐（DDSA）
邻苯二甲酸二丁酯（D.B.P)
二乙基苯胺（D.M.P-30）
将Epon812倒入烧杯中，置80
0温箱融化备用，按上述比例，顺序力加人顺丁烯二酸酐，充分搅拌，待溶化呈透明，至室温，再加人邻莱未二甲较一了酯，仔细搅拌，然后慢慢逐滴加入二乙基苯胺，边加边搅拌，至包埋剂呈红棕色。
B.1.4Formvar膜
将聚乙烯醇缩甲醛溶于三氯甲烷，配成0.2%3%溶液，存于冰箱备用，制膜时取一块干净玻璃片插人溶液中，取出倾斜待三氯甲烷挥发，用镊子沿玻璃边划痕，再将玻璃倾斜浸人蒸馏水中，薄膜即从玻璃上脱落下来漂浮于水面，取干净的铜网摆上，压紧，在用一块滤纸覆盖其上，捞起后置于培养血干煤备用。
B.2实验步骤
B.2.1取材
选取呈现症状的叶片或者幼嫩茎，用刀片切取叶脉、叶柄或者幼嫩枝条，大小为3mm。取健康叶片作为阴性对照。
-TKAONKAca
SN/T 3960 --2014
B.2.2固定
采用成二醛-饿酸双固定法。样品在25%戊二醛迹行前固定2h后，PBS(0.2I1p1/I.，pH7.4)清洗3次。然后用1%钱酸后固定2 h,PBS清洗3次。B.2.3脱水
采用乙醇和系列梯度脱水。30%乙醇/15min-50%乙醇/15tnin-→70%乙醇/15min→80%丙酮/15 min-90%内酮/15 min→100%内/15 min，样品可在70%乙醇中停留过夜。B.2.4渗透
脱水后的组织块在内酮/树脂(11)中渗透 3 d,再在全树脂中渗透24 h。B.2.5包埋
用环氧树脂做包埋剂。将组织块放在胶囊中央，滴人包埋剂。于37℃下24h,15℃下24h.60℃下24 h。
B,2.,6切片
在超薄切片机上将固化的组织块作切片。选择好的切片，将切片用二中苯蒸发展开，用载有Formvar膜的铜网捞起，置培养血内十燥，保存。B,2.7切片染色
采用乙酸双氰铀和柠像酸铅双染色。取染色蜡盘数个，将乙酸双氧铀染色滴人蜡盘上。取带切片的铜网，人染色滴中，染20Inin～30min,然后取出铺网，蒸馏水洗去多余染羧滤纸吸干。将铜网再放入另~-蜡盘，滴人柠機酸铅染液，使匍网翻扣在染色液滴上，20min-~30min,再用0.1mol/L氢氧化钠漂洗「净，滤纸吸「。
B.2.8显微镜观察
透射电子显微镜观察植原体形态，观察韧皮部筛管中是否含有直径为500[m~1000m的圆形、椭圆形、不规则形状等的菌原体.茗有可初步判定为植原体。6
-TKAONKAca
C,1引物序列(见表 C,1)
第-轮 PCR
第二轮 PCR
引物名称
PCR 反应体系及参数
附录C
（规范性附录）
PCR凝胶电泳检测
表 C,1 引物序列
引物序列3
AAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG GAT TCGT CGT TCA TCG GCT CTT
AAC CCT GGC GGC GCG CCT AAT ACGHGT CTG TCA AAA CTG AAG ATGPCK反应体系（见表C.2)
试剂名称
10×PCR缓冲液
2.5 mmol/I, dNJP
10 μmol/1. 上游引物
10 umol/1.下游引物
5UiuLTg DNA华合酶
1C8μL模板DNA
双蕉水
总体积
PCR反应体系
加样/uT.Www.bzxZ.net
$N/T 3960—2014
扩增产物长度
i525bp
注：INA模板的取量应根据DNA的提取浓度、纯度而调节；第·轮与第纶PCR购采川此体系。C.2,2阴性对照,阳性对照和空白对照的设置阴性对照：以键康的叶片DNA为模板；阳性对照：以携带有蓝莓矮化植原体16SrDVA序列的质粒或DVA为模板；PCR反应的空白对照：以灭荫去离了水代替DNVA模板。C.2.3PCR的反应条件
用引物P1/P7进行第-轮PCR，反应条件为：95℃/8min:95℃/605.55℃/605.72℃/995,
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