SN/T 3971-2014.Immunochromatographic assay of colloidal gold for detection of peste des petits ruminants.
1范围
SN/T 3971规定了小反刍兽疫免疫胶体金试纸卡检测方法。
SN/T 3971适用于小反刍兽疫抗体的快速检测。
2规范性引 用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
SN/T2123出人境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BSA:牛血清白蛋白
ICS:免疫层析试纸
PBS:磷酸缓冲液
PPR:小反刍兽疫
PPRV:小反刍兽疫病毒
SPG:链球菌G蛋白
4主要设备
4.1恒温箱。
4.2 电子天平:精确值0.0001g。
4.3台式冷 冻离心机:最大离心力15000g。
4.4 pH 计。
4.5试纸喷膜 仪。
4.6试纸 条切割机:可连续切割出2mm~5mm宽试纸。
5主要试剂和材料
除特别说明外,本标准所用试剂均为分析纯。试验用水为符合GB/T 6682规定的三级水。
5.1PBS:配方见附录A。
5.2 PPRV N蛋白:为基因工程表达蛋白抗原。
5.3链球菌G蛋白(SPG)。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3971—2014
小反兽疫免疫胶体金试纸卡检测方法Immunochromatographic assay of colloidal gold for detection of peste des petitsruminants
2014-07-14发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-03-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3971—2014
本标准起草单位：中华人民共和国西藏出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国云南出人境检验检疫局。本标准主要起草人：杨俊兴、刘忠清、杨云庆、赤列加措、花群义、吕建强、祝贺、孙洁、艾军、唐金明。I
1范围
小反鱼兽疫免疫胶体金试纸卡检测方法本标准规定了小反含兽疫免疫胶体金试纸卡检测方法。本标准适用于小反么兽疫抗体的快速检测。2规范性引用文件
SN/T3971—2014
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T2123出人境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BSA：牛血清白蛋白
ICS：免疫层析试纸
PBS:磷酸缓冲液
PPR:小反乌兽疫
PPRV：小反兽疫病毒
SPG：链球菌G蛋白
4主要设备
4.1恒温箱免费标准bzxz.net
4.2电子天平：精确值0.0001g。4.3台式冷冻离心机：最大离心力15000g。4.4 pH计。
4.5试纸喷膜仪。
试纸条切割机：可连续切割出2mm~5m宽试纸。4.6
主要试剂和材料
除特别说明外，本标准所用试剂均为分析纯。试验用水为符合GB/T6682规定的三级水。5.11%氯金酸溶液（AuCl·HCI·3H2O)。5.2PBS：配方见附录A。
5.3PPRVN蛋白：为基因工程表达蛋白抗原。5.4链球菌G蛋白（SPG)。
SN/T3971—2014
5.51%柠檬酸钠溶液。
5.61%碳酸钾溶液（K.CO.）：配方见附录A。5.7
抗SPG多克隆抗体。
5.8牛血清白蛋白。
硝酸纤维素膜。
玻璃纤维棉纸。
干燥剂。
PPRV阳性血清，由指定单位提供。PPRV阴性血清，由指定单位提供。6检测原理
将胶体金标记的SPG固定于金标垫，检测线为纯化的PPRVN蛋自，对照线为免抗SPG。检测时，阳性样品中的抗PPRV抗体与胶体金标记SPG特异性地结合·在AC膜上移动时，被检测线上的PPRVN蛋白捕获，胶体金颗粒聚集于此，形成红色的条带.即检测线。相反，阴性样品中不含抗PPRV抗体，在检测线处不形成红色条带，对照线试剂免抗SPG与胶体金标记SPG结合，捕获金标复合物，形成对照线。
7免疫胶体金试纸卡的组装
7.1金标SPG及金标垫的制备
首先用1%碳酸钠溶液调胶体金溶液的H值为溶液，空温搅拌30min，缓慢加入10BSA
5.向50mL胶体金溶液中缓慢地加入适量SPG至其终浓度为1%（质量放度），继续搅拌30min。4℃4000g离心10min，将上清转移至另离心（即1/10原体积）PBS（pH7.0）重悬沉淀0.02%，用试纸喷膜仪将胶体金溶液喷于抽干，于4℃干燥保存备用。
7.2检测线和对照线的制备
412000g离心30min，小心弃去上清。用5mL管中
1%（质量浓度）的叠氮钠（NaN）溶液至终浓度为上，速度为50uL/cm，并于4℃真空mm玻璃纤维棉
用纯化的浓度为2mg/mL的PPRVN蛋和免抗SPGIgG分别作为检测线和对照线试剂。用试纸喷膜仪将两种试剂分别点在硝酸红维膜上，点样速度为0.75L/cm。37℃干燥2h，4℃密封保存备用。
7.3试纸卡的组装
按图B.1所示，将背衬、样品垫、吸水垫、硝酸纤维膜、金标垫粘在一起，并用试纸条切割机将其切成3.5mm宽的试纸条，将试纸条放入试纸卡中，将试纸卡放人含有干燥剂的密封袋内，密封后于2℃8℃保存备用。
8样品采集、处理和保存
采集动物血样，室温静置约30min，使血液自然凝固。5000g离心10min，收集上清液转移至另一离心管中，于56℃水浴中作用30min后，待血清样品恢复室温后用于检测。血清样品也可放4℃暂时保存（不超过7d)或一70℃长期保存。样品的运输按SV/T2123执行。2
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9样品检测
9.1从2℃~8℃冰箱中取出带包装的试纸卡，在室温放置约30min。SN/T3971—2014
9.2样品稀释，分别用样品稀释液（见附录A）将PPRV阳性血清、PPRV阴性血清和待检血清样品稀释5倍，即向80稀释液加人20血清，用加样器混匀9.3打开试纸卡的密封包装袋，检查试纸卡是否正常。如试纸条已变形、变色或受潮则不能使用。9.4将试纸卡平放于操作台面，加样孔朝上，向加样孔中加人约100μL5倍稀释的血清样品室温静置5min~20min。整个检测过程在室温（20℃～25℃）进行。10
结果判定
根据图B.2所示进行结果判定，如果对照线和检测线均显色，则为阳性：如果仅对照线显色，而检10.1
测线不显色，则为阴性；如果对照线不显色，则检测无效应换用另一根试纸卡再次检测。10.2结果判定应在加样后20min内进行商品化试纸卡检测
可使用等效商品化胶体金试纸卡检测PPRV血清抗体，接相关说明书进行检测和结果判定。S
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SN/T 3971—2014
磷酸缓冲液（PBS)
氯化钠（NaCI)）
磷酸二氢钾（KH2PO.）
磷酸氢二钠（Na,HPO）
氯化钾（KCD
蒸馏水
21%柠檬酸钠溶液
附录A
（规范性附录）
试剂配制
1000ml
取柠檬酸三钠1g，加入100ml蒸馏水中，充分振荡：使其完全溶解，并用0.22μm滤膜过滤。该溶液需现用现配。
1%碳酸钾溶液
取柠碳酸钾1g，加人100mL蒸馏水中，充分振荡，使其完全溶解，并用0.22um滤膜过滤。该溶液需现用现配。
410%BSA溶液
取1gBSA粉末，加人10mL蒸馏水，充分振荡使其全部溶解，并用0.22um滤膜过滤。分装成1mL/管，于一70℃保存备用。
胶体金溶液的制备
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液。向99mL蒸馏水中加人1mL1%熟金酸溶液，加热至沸腾，迅速加人2.4mL新鲜配制的1%（质量浓度）柠檬酸三钠溶液，并充分混匀，继续加热约5min~10min，溶液颜色由蓝色变为红色即可。冷却至空温后，用0.22μm滤膜过滤，分装后4℃避光保存备用。
样品稀释液（含有0.5%BSA的PBS）向100mLPBS(见A.1)中加人0.5gBSA粉剂，混勾。iKAoNiKAca
样品垫
对照线
检测线
加样孔
附录B
（规范性附录）
试纸条结构示意图和结果判定方法图样品流向
检测线
金标垫
对照线
硝酸纤维素膜
小反兽疫胶体金试纸结构示意图阳性
e）无效
d）无效
2小反兽疫胶体金试纸卡检测结果判定示意图图B.2
SN/T3971--2014
吸水垫
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