SN/T 1204-2016
基本信息
标准号： SN/T 1204-2016
中文名称：植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.zip .pdf
相关标签： 植物 加工 产品 转基因 成分 实时 荧光 PCR 定性 检验 方法
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 1204-2016.Protocol of the real-time PCR method for detecting genetically modified plants and their derived products.
1范围
SN/T 1204规定了植物及其加工产品中转基因成分筛选和品系鉴定实时荧光PCR检测方法。
SN/T 1204适用于大豆、玉米、油菜籽、水稻棉花、马铃薯、亚麻、甜菜、苜蓿、番茄、木瓜、苹果、菊苣、剪股颖、烟草、李子、甜瓜小麦、茄子和桉树转基因筛选检测,也适用于大豆、玉米、油菜、水稻、棉花、马铃薯、亚麻和甜菜等作物的品系特异性实时荧光PCR检验。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 19495.2转基因产品检测实验室技 术要求
GB/T 19495.3转 基因产品检测核酸 提取纯化方法
GB/T 19495.7转 基因产品检测抽样和制样方法
GB/T 27403实验室质量控制规范 食品分 子生物学检测
3术语、定义和缩 略语
3.1 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1转基因transgene
将物种本身不具有的、来源于其他物种的功能DNA序列,通过生物工程技术,使其在该物种中进行表达,以便使该物种获得新的品种特征。
3.1.2实时荧光PCRreal-time polymerase chain reaction
实时荧光聚合酶链式反应。是指在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,荧光信号的强弱直接反映模板数量。
1范围
SN/T 1204规定了植物及其加工产品中转基因成分筛选和品系鉴定实时荧光PCR检测方法。
SN/T 1204适用于大豆、玉米、油菜籽、水稻棉花、马铃薯、亚麻、甜菜、苜蓿、番茄、木瓜、苹果、菊苣、剪股颖、烟草、李子、甜瓜小麦、茄子和桉树转基因筛选检测,也适用于大豆、玉米、油菜、水稻、棉花、马铃薯、亚麻和甜菜等作物的品系特异性实时荧光PCR检验。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 19495.2转基因产品检测实验室技 术要求
GB/T 19495.3转 基因产品检测核酸 提取纯化方法
GB/T 19495.7转 基因产品检测抽样和制样方法
GB/T 27403实验室质量控制规范 食品分 子生物学检测
3术语、定义和缩 略语
3.1 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1转基因transgene
将物种本身不具有的、来源于其他物种的功能DNA序列,通过生物工程技术,使其在该物种中进行表达,以便使该物种获得新的品种特征。
3.1.2实时荧光PCRreal-time polymerase chain reaction
实时荧光聚合酶链式反应。是指在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,荧光信号的强弱直接反映模板数量。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1204—2016
代替SN/T1204—2003
植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法
Protocol of the real-time PCR method for detecting genetically modifiedplantsandtheirderivedproducts2016-06-28发布
中华人民共和国免费标准下载网bzxz
国家质量监督检验检疫总局
刮涂屋套真你
2017-02-01实施
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法
SV/T1204—2016
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010)68533533
网址spc.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16印张1.5
字数42千字
2017年10月第一版
2017年10月第一次印刷
印数1-1100
5定价24.00元
书号：1550662-31325
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。SN/T1204—2016
本标准代替SN/T1204一2003《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》。本标准与SN/T1204一2003相比，主要修改如下：-增加了植物内源基因的检测方法。增加了转基因植物筛选基因的检测方法。增加了大豆、玉米、油菜、棉花、水稻、马铃薯、亚麻、甜菜等作物的品系特异性检测方法本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准主要起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局，深圳市检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：黄新、朱水芳、高宏伟、李想、潘良文、陈洪俊、陈枝楠。本标准所代替标准历次版本发布情况为：-SN/T1204—2003。
1范围
植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法
SN/T1204—2016
本标准规定了植物及其加工产品中转基因成分筛选和品系鉴定实时荧光PCR检测方法本标准适用于大豆、玉米、油菜籽、水稻、棉花、马铃薯、亚麻、甜菜、首猎、番茄、木瓜、苹果、菊苣、剪股颖、烟草、李子、甜瓜、小麦、茄子和桉树转基因筛选检测，也适用于大豆、玉米、油菜、水稻、棉花、马铃薯、亚麻和甜菜等作物的品系特异性实时荧光PCR检验。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法GB/T27403实验室质量控制规范
食品分子生物学检测
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1.1
转基因
transgene
将物种本身不具有的、来源于其他物种的功能DNA序列，通过生物工程技术，使其在该物种中进行表达，以便使该物种获得新的品种特征。3.1.2
实时荧光PCR
real-timepolymerasechainreaction实时荧光聚合酶链式反应。是指在聚合酶链式反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，荧光信号的强弱直接反映模板数量。3.1.3
内源基因
endogenous gene
在检测物种中拷贝数恒定的、不显示等位基因变化的基因。该基因可用于判定物种特异性。3.1.4
外源基因
exogenous gene
利用生物工程技术转人的其他生物基因，使该生物品种表现新的生物学性状。rKAoNrKAca
SN/T1204—2016
Ct值 cycle threshold
每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
CTAB：十六烷基三甲基漠化铵（cetyltrithylammoniumbromide）dATP：脱氧腺三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate）dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate）dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate）DNA：脱氧核糖核酸（dcoxyribonucleicacid）dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate)dUTP：脱氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphospbate)EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetbp：碱基对（basepair）
aceticacid
Tris：三（羟甲基）氨基甲烷（tris(hydroxymethyl）aminomethane）UDG：尿嘧啶DNA-糖基酶（uracilDNAglycosyla(uracil-N-glycosylase)
UNG酶：尿嘧啶N糖基化酶
nerase chain reaction)
PCR：聚合酶链式反应（polym
SDS：十二烷基酸钠（sodiumdodecylsulfate）Tag：DNA聚合酶（TagDNApolymerase)TE:Tris-HCI、EDTA缓冲液
PE3PEPcase：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（Phosphoenilpyruvate-Carboxylasc)tRNALeu：植物叶绿体基因
BARNASE：来源于解淀粉芽孢杆菌的核糖核酸酶基因（ribonucleasegenefronBacillusamyloliquefaciens)
BARSTAR：来源丁解淀粉芽孢杆菌的BARNASE基因的特异抑制基因（specific inhibitorof thebarnasegene from Bacillusamyloliquefaciens)BXN：来源于肺炎克雷伯杆菌臭鼻亚种的晴水解酶基因（nitrilaseenzymegcncfromKlehsiellapneumoniae subsp.Oxaenae)
CryIA（b）：苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白cryIA（b）基因（Asyntheticgeneencodesthefirst648amino acids,insccticidal-active ftruncated product identical to that of cry IA (b)gene of Bacillusthuringiensis subsp)
18srRNA：真核生物18s核糖体RNA基因HMGI/Y：高移动性蛋白家族基因（Highmobilitygroupproteingene）PEP：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（phosphoenolpyruvatecarboxylasegene）CruA：油菜种子储藏蛋白基因（CruciferinAgene)adhl：乙醇脱氢酶（alcoholdehydrogenase）zSSIIb：编码米淀粉合酶异构体zSTSII2的基因（zeinstarchsynthase，granuleboundstarchsynthase)
Lectin：植物凝集素基因
LAT52：番茄花药（粉）特性表达基因SPS：蔗糖合成酶（sucrosephosphatesynthase）2
TrKAoNiKAca
PLD：磷脂酶D家族基因（phospholipaseDfamily）GOX：草甘膦氧化还原酶基因（glyphosate-oxidoreductasegene）SN/T1204—2016
UGPase：尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucosepyrophosphorylase（cytoplasmmarker)）SAH7：陆地棉的SAH7基因（SAH7proteingcncofGossypiumhirsutum)GLuA3：大米谷蛋白基因（riceGlutelinGene）GAG56：一种醇溶蛋白基因（oneof-gliadingenes）Wxo12：编码小麦蜡质基因（Waxywheatgenes）Alfalfa-Acc：（百猎乙酰辅酶a羧化酶）AlfalfaAcetyl-CoAcarboxylasepCaMV35S：花椰菜花叶病毒35S启动子（35Spromotcrfromcauliflowermosaicvirus）pFMV35S：玄参花叶病毒35S启动子（35Spromoterfromamodifiedfigwortmosaicvirus)tNOS：来源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子（terminatorofnopalinesynthasegenefromAgrobacteriumtumefaciens)
NPTⅡ：新霉素-3°-磷酸转移酶基因（neomycin-3-phosphotransferasegene)
BAR：磷化麦黄酮乙酰转移酶基因（phosphinothricinacctyltransferasegene）PAT：草丁麟乙酰转移酶基因（Phosphinothricin acetyltransferasegene）GOX：葡糖氧化酶基因（glucoseodasegene)
CP4-EPSPS：根癌农杆菌CP4蛋白基因和5-荞草酸-3-磷酸合成酶基因（Agrobacteriumtumefaciens strain CP4Product:herbicide tolerant form of 5-enolpyruvulshikimate-3-phosphate synthase)
EPSPS：5-荞草酸-3-磷酸合成酶基因（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthasegcne）Cry3A：抗虫毒蛋白，选择性毒杀科罗拉多马铃尊甲虫（Coloratopotatobeetlelarvae)（B.thuringiensis subsp.Tenebrionis(B.t.t.)strain B1 256-82)
pNOS：来源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因启动子（promoter0
Agrobacterium tumefaciens)
pSSuAra：来自拟南芥的小亚基启动nopalinesynthase genefrom
F(thesmall sub
ofArabidopsis)
hunitpromoter
pTA29：来源于烟草的花蕊特异性TA29基因的发育调节启动子（developmentallyregulatedpro-moter from anther specific TA29penetr
icotiang
pUbi：玉米泛素基因的启动子（promoterofmaizetabacu
Ubiquitin)
t35S：花椰菜花叶病毒终止子（CauliflowerMosaicVirus35teminator)
Te9：为来源于豌豆二磷酸核酮糖羧化酶基因的终止子tOCS：章鱼碱合成酶终止子（terminatorofoctopinesynthase）tg7：谷氨酰胺转移酶7（Transglutaminase7gene）PMI：6-磷酸甘露糖异构酶基因（Phosphomannoseisomerase）4方法提要
提取样品DNA后，采用实时荧光PCR技术对样品DNA筛选基因或品系特异性片段扩增，根据实时荧光扩增曲线，判断该样品中是否含有转基因成分。对外源基因检测阳性的样品，或已知为转基因阳性的样品，如需进一步进行品系鉴定，则采用品系特异性实时荧光PCR扩增品系特性片段，根据PCR扩增结果（实时荧光扩增曲线），判定该样品中含有哪(些)种转基因品系成分。
-TTKAONKAca
SN/T1204—2016
5仪器设备
实时荧光PCR仪。
样品粉碎仪或研磨机：
天平：感量0.01g。
5.4水浴锅或恒温孵育器，
5.5冷冻离心机。
5.6高压灭菌锅。
涡旋振荡器。
生物安全柜。
pH计。
核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。微量移液器（2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL）。6试剂和材料
除特别说明外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T6682中，级水的规格。6.1实时荧光PCR预混液
TagDNA聚合酶（5U/μL）、PCR反应缓冲液、氯化镁、dNTPs（含dATP，dUTP，dCTP，dGTP）和UNG酶按比例配制的溶液。
2荧光校正试剂（ROX）
50倍。
6.3引物和探针
6.3.1筛选检测
对于不知道是否为转基因产品的样品，按照表1选用筛选基因进行检测。基因的引物和探针按照附录A中序列合成，加超纯水配制成100μmol/L储备液，实时荧光PCR扩增的引物和探针工作液浓度为10μmol/L。
转基因筛选检测基因选用
大豆及其加工品
玉米及其加工品
油菜及其加工品
选用基因
内源基因，pCaMV35SpFMV35S，tNOS，BAR，PAT.GOX.CP4-EPSPS.CTP2-CP4-EPSPS.tE9
内源基因.pCaMV35S,pFMV35S.NOS，NPTI，BAR，PAT,GOX，CP4-EPSPS.CTP2CP4-EPSPS.Cry3A,tCaMV35S,PMI,CrylA(b),CryIAc.pRice-Eactin内源基因.pCaMV35S，pFMV35S.NOS，NPTI，BAR，PAT，GOX，CP4-EPSPSCTP2CP4-EPSPS,pNOSpSsuAra,pTA29,tCaMV35S,tE9,tOCS,tg7-TKAoNiKAca
水稻及其加工品
棉花及其加工品
马铃薯及其加工品
亚麻及其加工品
甜菜及其加工品
首猎及其加工品
剪股赖
品系特异性检测
表1（续）
选用基因
内源基因，pCaMV35S，tNOS，BAR.CrylA(b)，CryIAcSN/T1204—2016
内源基因，pCaMV35S，pFMV35S.tNOS,NPTI，BAR，PAT,CP4-EPSPS.pUbi，tE9，CryIA(b),CrylAc
内源基因，pCaMV35S，pFMV35S，tNOS,NPTII，CP4-EPSPS.Cry3A，pNOS内源基因，pCaMV35S，pFMV35S,tNOSNPTI内源基因.pCaMV35S.pFMV35StNOS.NPTI，PAT.CP4-EPSPS.CTP2-CP4-EPSPS内源基因，pFMV35S.CTP2-CP4-EPSPS，tE9pCaMV35S.pFMV35S,tNOS,NPTI,CryIAcpCaMV35S,pFMV35StNOS,NPTI
pCaMV35S.pFMV35StNOS,BAR,NPTpCaMV35S.pFMV35StNOS.CP4-EPSPSpCaMV35S.pFMV35S.tNOS,NPTI
pCaMV35S.pFMV35S,tNOS.NPTII
pCaMV35S.pFMV35S.tNOS.NPTI
pCaMV35S.pFMV35S.tNOS.NPT
pCaMV35S,pFMV35S.tNOS,CP4-EPSPSpCaMV35S.pFMV35S,tNOS.NPTIl.CRYIAcpCaMV35S,pFMV35S,tNOS,NPT
根据需要检测的品系.按照附录B中给出的序列合成引物和探针，加超纯水配制成100umol/1储备液，实时荧光PCR扩增的引物和探针工作液浓度为10μmol/L。检测步骤
取样和制样
按照GB/T19495.7中规定的方法执行。样品DNA的提取与纯化
按照GB/T19495.3的方法或采用具有相同效果的植物基因组DVA提取试剂盒进行DNA提取，DNA浓度测定和定量
样品DNA用紫外分光光度计测定260nm和280nm处吸收值，分别计算核酸的纯度和浓度，计算公式如下：
DNA纯度=OD20/OD280
DNA浓度（mg/mL）=50XOD250
-TTKAONIKAca
SN/T1204—2016
DNA的纯度比值应在1.71.9之间，浓度不低于20ng/uL.。7.4
实时荧光PCR检测
7.4.1实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系配制见表2每个样品设置2个平行重复表2实时荧光PCR检测体系
10×PCR缓冲液
MgCl溶液
dNTP(含dUTP)
UNG酶
上游引物
下游引物
DA模板
超纯水
注1：可选用含有PCR缘冲液、MgCl：dVIP和Tag脑实时荧光PCR扩增。
储液浓度
25mmal/1
10pmal/1
1oumol/l
10μmol/L
终浓度
2.5mmol/L
0.2mmol/L
0.075U/μL
见附录A、附录B
见附录A、附录B
见录A、附录B
50ng250ng
补足至25μL
的基于Taqman探针的实时荧光PCR预混液进行注2：ROX荧光试剂仅在具有ROX校止通道的实时荧光PCR仪上进行扩增时添加，否则用超纯水补足。注3：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。7.4.2实时荧光PCR反应程序
实时荧光PCR反应参数为：50
/10min.95℃/1
155；60℃/60s40个循环。
注：95℃/10min的专门适用了化学变构的热启动Taq酶。以上参数可根据不同型号实时荧光PCR仪和所选PCR扩增试剂体系不同作调整
仪器检测通道的选择
设置PCR反应管荧光信号收集条件，应与探针标记的报告基团一致。具体设置方法可参照仪器使用说明书。
实验对照的设立
每个样品应有2个平行实验，同时每次检测必须设立3个对照：阳性对照，为对应的转基因植物样品品系或含有相应外源基因的转基因植物样品基因组DNA，或含有上述片段的质粒标准分子DNA；阴性对照，非转基因植物样品DNA：空白对照，设两个，一是提取DNA时设置的提取空白对照（以水代替样品），二是PCR反应的空白对照（以水代替DNA模板）。6
8质量控制
SN/T1204—2016
空白对照：内源基因检测Ct值大于或等于40，外源基因或品系特异性检测Ct值大于或等于40；阴性对照：内源基因检测Ct值小于或等于30，转化事件特异性检测Ct值大于或等于40阳性对照：内源基因检测Ct值小于或等于30，转化事件特异性检测Ct值小于或等于35；上述指标有一项不符合者，说明PCR反应体系不正常，应重新进行实时PCR扩地。9结果判定及表述
9.1实时荧光PCR结果判定
测试样品检测Ct值大于或等于40.内源基因检测Ct值小于或等于30，则可判定该样品不含所检基因或品系。
测试样品检测Ct值小于或等于36，内源基因检测Ct值小于或等于30，判定该样品含有所检基因或品系。
测试样品检测Ct值在36～40之间.应调整模板浓度，重做实时荧光PCR。再次扩增后的外源基因检测Ct值仍小于40，则可判定为核样品含有所检其因或品系于或等于40，则可判定为该样品不含所检基因或品系。9.2结果表述
结果为阳性的，表述为“检出×××外源基因”或“检出×结果为阴性的，表述为“未检出×10防污染措施
外源基因”或“未检出》
再次扩增后的外源基因检测Ct值大转基因品系”；
X转基因品系”。
检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403和GB/T19495.2中的规定执行。11最低检出限
各基因片段的实时荧光PCR扩增的最低检出限（LOD）为0.01%SN/T1204-2016
基因/品系
18SrRNA
HMGI/Y
Lectin
Lectin-KVM
附录A
（规范性附录）
植物转基因成分检测实时荧光PCR检测引物和探针表A.1
植物转基因成分检测实时荧光PCR检测引物和探针终浓度
引物/探针序列（5°3°）
cctgagaaacggctacca
cgtgtcaggattgggtaat
FAM-tgcgcgcctgcigccttcet-BHQIggtcgtcctcctaaggegaaag
cttcttcggcggtegtccac
FAM-cggagceacteggtgccgcaactt-BHQ1ccettgtgaagetcgecatc
ettgtcetctgaccatetttgt
FAM-ccgaccgtcacaccgatgtttaga-BHQ1ggccagggtttccgtgat
ccgtegttgtagaaccattgg
FAM-agtccttatgtgctccactttetggtgca-BHQ1cgtcgicccaletcttectce
ccactecgagaccctcagtc
FAM-uatcagggctcatttetcgctcctca-BHQIctc ccu atc ctt tga cat ctg ctcg atr tct cie ttg gtg aca ggFAMagc aa gtc aga gcg crg caa tgca-TAMRAcctcctcgggaaagttacaa
gggeatagaaggtgaagtt
FAM-ccctegtctettggtcgcgccctct-BHQ1cacctttctcgcaccaattgace
tcaaactcaacagcgacgac
FAM-ccacauacacatgcaggttatcttgg BHQIagaccacgagaacgatatttgc
ftctrgccttttcatatceagaca
FAM-ctctttgcagtectcccttgggct-BHQ1nmol/L
适用范围
植物内源基因
油菜内源基因
玉米内源基因
大豆内源基因
番茄内源基因
基因/品系
UGPase
Alfalfa-Acc
GAG56D
pCaMV35S
表A.1（续）
引物/探针序列（5\-3\）
cacctttctcgcaccaattgaca
tcaaactcaacagcgacgac
FAM-tccgagcgtccgigcgte-BHQ1
iggtgagcgtlttgcagtct
elgatccactagcaggaggtcc
FAM-tgttgtgetgccaatgtggcctg-BHQ1tggtgagcgttttgcegtet
ctgatccactagcaggaggtcc
tgttgtgctgccaatgtggcctg
ggacatgtgaagagacggagc
cctacctctacccctecgc
FAM-ctaccaccattacctcgcacctcctca-BHQ1agtttgtaggtttgatgttacattgag
gcatctttgaaccgcctactg
FAM-aaacataaaatatgggaacaaccalgacatgt-BHQ1gacctccatattactgaaaggaag
gagteattgctccatcctgttea
FAM-ctacgaagttaaagtatgtgccgctc-BHQIgatcagtgaacttcgcaaagtac
caacgacgtgacactacaac
FAM-tgaatgctectgtgatetgcccatge-TAMRAcaacaattttctcagccccaaca
tettgcatgggttcacctgtt
FAM ttcccgcagcccaacaaccgc-BHQlgtcgcgggaacagaggtgt
ggtgttcctccattgcgaaa
FAM-caaggcggccgaaataagltgce-BHQ1gcctctgccgacagtggt
aagacgtggttggaacgtcttc
FAM-caaagatggacccccacccacg-BHQ1终浓度
nmol/L
SN/T1204—2016
适用范围
水稍内源基因
马铃薯内源基因
棉花内源基因
甜菜内源基因
苗著内源基因
小麦属内源基因
小麦种内源基因
转基因大豆、玉
米、油菜、棉花、
水稀、番茄、马铃
薯、木瓜、亚麻、
甜菜、苹果、菊
苣、剪股颖、烟
草、李子、甜瓜、
小麦、茄子和树
等外源筛选基因
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本标准代替SN/T1204一2003《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》。本标准与SN/T1204一2003相比，主要修改如下：-增加了植物内源基因的检测方法。增加了转基因植物筛选基因的检测方法。增加了大豆、玉米、油菜、棉花、水稻、马铃薯、亚麻、甜菜等作物的品系特异性检测方法本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准主要起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局，深圳市检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：黄新、朱水芳、高宏伟、李想、潘良文、陈洪俊、陈枝楠。本标准所代替标准历次版本发布情况为：-SN/T1204—2003。
1范围
植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法
SN/T1204—2016
本标准规定了植物及其加工产品中转基因成分筛选和品系鉴定实时荧光PCR检测方法本标准适用于大豆、玉米、油菜籽、水稻、棉花、马铃薯、亚麻、甜菜、首猎、番茄、木瓜、苹果、菊苣、剪股颖、烟草、李子、甜瓜、小麦、茄子和桉树转基因筛选检测，也适用于大豆、玉米、油菜、水稻、棉花、马铃薯、亚麻和甜菜等作物的品系特异性实时荧光PCR检验。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法GB/T27403实验室质量控制规范
食品分子生物学检测
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1.1
转基因
transgene
将物种本身不具有的、来源于其他物种的功能DNA序列，通过生物工程技术，使其在该物种中进行表达，以便使该物种获得新的品种特征。3.1.2
实时荧光PCR
real-timepolymerasechainreaction实时荧光聚合酶链式反应。是指在聚合酶链式反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，荧光信号的强弱直接反映模板数量。3.1.3
内源基因
endogenous gene
在检测物种中拷贝数恒定的、不显示等位基因变化的基因。该基因可用于判定物种特异性。3.1.4
外源基因
exogenous gene
利用生物工程技术转人的其他生物基因，使该生物品种表现新的生物学性状。rKAoNrKAca
SN/T1204—2016
Ct值 cycle threshold
每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
CTAB：十六烷基三甲基漠化铵（cetyltrithylammoniumbromide）dATP：脱氧腺三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate）dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate）dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate）DNA：脱氧核糖核酸（dcoxyribonucleicacid）dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate)dUTP：脱氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphospbate)EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetbp：碱基对（basepair）
aceticacid
Tris：三（羟甲基）氨基甲烷（tris(hydroxymethyl）aminomethane）UDG：尿嘧啶DNA-糖基酶（uracilDNAglycosyla(uracil-N-glycosylase)
UNG酶：尿嘧啶N糖基化酶
nerase chain reaction)
PCR：聚合酶链式反应（polym
SDS：十二烷基酸钠（sodiumdodecylsulfate）Tag：DNA聚合酶（TagDNApolymerase)TE:Tris-HCI、EDTA缓冲液
PE3PEPcase：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（Phosphoenilpyruvate-Carboxylasc)tRNALeu：植物叶绿体基因
BARNASE：来源于解淀粉芽孢杆菌的核糖核酸酶基因（ribonucleasegenefronBacillusamyloliquefaciens)
BARSTAR：来源丁解淀粉芽孢杆菌的BARNASE基因的特异抑制基因（specific inhibitorof thebarnasegene from Bacillusamyloliquefaciens)BXN：来源于肺炎克雷伯杆菌臭鼻亚种的晴水解酶基因（nitrilaseenzymegcncfromKlehsiellapneumoniae subsp.Oxaenae)
CryIA（b）：苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白cryIA（b）基因（Asyntheticgeneencodesthefirst648amino acids,insccticidal-active ftruncated product identical to that of cry IA (b)gene of Bacillusthuringiensis subsp)
18srRNA：真核生物18s核糖体RNA基因HMGI/Y：高移动性蛋白家族基因（Highmobilitygroupproteingene）PEP：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（phosphoenolpyruvatecarboxylasegene）CruA：油菜种子储藏蛋白基因（CruciferinAgene)adhl：乙醇脱氢酶（alcoholdehydrogenase）zSSIIb：编码米淀粉合酶异构体zSTSII2的基因（zeinstarchsynthase，granuleboundstarchsynthase)
Lectin：植物凝集素基因
LAT52：番茄花药（粉）特性表达基因SPS：蔗糖合成酶（sucrosephosphatesynthase）2
TrKAoNiKAca
PLD：磷脂酶D家族基因（phospholipaseDfamily）GOX：草甘膦氧化还原酶基因（glyphosate-oxidoreductasegene）SN/T1204—2016
UGPase：尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucosepyrophosphorylase（cytoplasmmarker)）SAH7：陆地棉的SAH7基因（SAH7proteingcncofGossypiumhirsutum)GLuA3：大米谷蛋白基因（riceGlutelinGene）GAG56：一种醇溶蛋白基因（oneof-gliadingenes）Wxo12：编码小麦蜡质基因（Waxywheatgenes）Alfalfa-Acc：（百猎乙酰辅酶a羧化酶）AlfalfaAcetyl-CoAcarboxylasepCaMV35S：花椰菜花叶病毒35S启动子（35Spromotcrfromcauliflowermosaicvirus）pFMV35S：玄参花叶病毒35S启动子（35Spromoterfromamodifiedfigwortmosaicvirus)tNOS：来源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子（terminatorofnopalinesynthasegenefromAgrobacteriumtumefaciens)
NPTⅡ：新霉素-3°-磷酸转移酶基因（neomycin-3-phosphotransferasegene)
BAR：磷化麦黄酮乙酰转移酶基因（phosphinothricinacctyltransferasegene）PAT：草丁麟乙酰转移酶基因（Phosphinothricin acetyltransferasegene）GOX：葡糖氧化酶基因（glucoseodasegene)
CP4-EPSPS：根癌农杆菌CP4蛋白基因和5-荞草酸-3-磷酸合成酶基因（Agrobacteriumtumefaciens strain CP4Product:herbicide tolerant form of 5-enolpyruvulshikimate-3-phosphate synthase)
EPSPS：5-荞草酸-3-磷酸合成酶基因（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthasegcne）Cry3A：抗虫毒蛋白，选择性毒杀科罗拉多马铃尊甲虫（Coloratopotatobeetlelarvae)（B.thuringiensis subsp.Tenebrionis(B.t.t.)strain B1 256-82)
pNOS：来源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因启动子（promoter0
Agrobacterium tumefaciens)
pSSuAra：来自拟南芥的小亚基启动nopalinesynthase genefrom
F(thesmall sub
ofArabidopsis)
hunitpromoter
pTA29：来源于烟草的花蕊特异性TA29基因的发育调节启动子（developmentallyregulatedpro-moter from anther specific TA29penetr
icotiang
pUbi：玉米泛素基因的启动子（promoterofmaizetabacu
Ubiquitin)
t35S：花椰菜花叶病毒终止子（CauliflowerMosaicVirus35teminator)
Te9：为来源于豌豆二磷酸核酮糖羧化酶基因的终止子tOCS：章鱼碱合成酶终止子（terminatorofoctopinesynthase）tg7：谷氨酰胺转移酶7（Transglutaminase7gene）PMI：6-磷酸甘露糖异构酶基因（Phosphomannoseisomerase）4方法提要
提取样品DNA后，采用实时荧光PCR技术对样品DNA筛选基因或品系特异性片段扩增，根据实时荧光扩增曲线，判断该样品中是否含有转基因成分。对外源基因检测阳性的样品，或已知为转基因阳性的样品，如需进一步进行品系鉴定，则采用品系特异性实时荧光PCR扩增品系特性片段，根据PCR扩增结果（实时荧光扩增曲线），判定该样品中含有哪(些)种转基因品系成分。
-TTKAONKAca
SN/T1204—2016
5仪器设备
实时荧光PCR仪。
样品粉碎仪或研磨机：
天平：感量0.01g。
5.4水浴锅或恒温孵育器，
5.5冷冻离心机。
5.6高压灭菌锅。
涡旋振荡器。
生物安全柜。
pH计。
核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。微量移液器（2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL）。6试剂和材料
除特别说明外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T6682中，级水的规格。6.1实时荧光PCR预混液
TagDNA聚合酶（5U/μL）、PCR反应缓冲液、氯化镁、dNTPs（含dATP，dUTP，dCTP，dGTP）和UNG酶按比例配制的溶液。
2荧光校正试剂（ROX）
50倍。
6.3引物和探针
6.3.1筛选检测
对于不知道是否为转基因产品的样品，按照表1选用筛选基因进行检测。基因的引物和探针按照附录A中序列合成，加超纯水配制成100μmol/L储备液，实时荧光PCR扩增的引物和探针工作液浓度为10μmol/L。
转基因筛选检测基因选用
大豆及其加工品
玉米及其加工品
油菜及其加工品
选用基因
内源基因，pCaMV35SpFMV35S，tNOS，BAR，PAT.GOX.CP4-EPSPS.CTP2-CP4-EPSPS.tE9
内源基因.pCaMV35S,pFMV35S.NOS，NPTI，BAR，PAT,GOX，CP4-EPSPS.CTP2CP4-EPSPS.Cry3A,tCaMV35S,PMI,CrylA(b),CryIAc.pRice-Eactin内源基因.pCaMV35S，pFMV35S.NOS，NPTI，BAR，PAT，GOX，CP4-EPSPSCTP2CP4-EPSPS,pNOSpSsuAra,pTA29,tCaMV35S,tE9,tOCS,tg7-TKAoNiKAca
水稻及其加工品
棉花及其加工品
马铃薯及其加工品
亚麻及其加工品
甜菜及其加工品
首猎及其加工品
剪股赖
品系特异性检测
表1（续）
选用基因
内源基因，pCaMV35S，tNOS，BAR.CrylA(b)，CryIAcSN/T1204—2016
内源基因，pCaMV35S，pFMV35S.tNOS,NPTI，BAR，PAT,CP4-EPSPS.pUbi，tE9，CryIA(b),CrylAc
内源基因，pCaMV35S，pFMV35S，tNOS,NPTII，CP4-EPSPS.Cry3A，pNOS内源基因，pCaMV35S，pFMV35S,tNOSNPTI内源基因.pCaMV35S.pFMV35StNOS.NPTI，PAT.CP4-EPSPS.CTP2-CP4-EPSPS内源基因，pFMV35S.CTP2-CP4-EPSPS，tE9pCaMV35S.pFMV35S,tNOS,NPTI,CryIAcpCaMV35S,pFMV35StNOS,NPTI
pCaMV35S.pFMV35StNOS,BAR,NPTpCaMV35S.pFMV35StNOS.CP4-EPSPSpCaMV35S.pFMV35S.tNOS,NPTI
pCaMV35S.pFMV35S,tNOS.NPTII
pCaMV35S.pFMV35S.tNOS.NPTI
pCaMV35S.pFMV35S.tNOS.NPT
pCaMV35S,pFMV35S.tNOS,CP4-EPSPSpCaMV35S.pFMV35S,tNOS.NPTIl.CRYIAcpCaMV35S,pFMV35S,tNOS,NPT
根据需要检测的品系.按照附录B中给出的序列合成引物和探针，加超纯水配制成100umol/1储备液，实时荧光PCR扩增的引物和探针工作液浓度为10μmol/L。检测步骤
取样和制样
按照GB/T19495.7中规定的方法执行。样品DNA的提取与纯化
按照GB/T19495.3的方法或采用具有相同效果的植物基因组DVA提取试剂盒进行DNA提取，DNA浓度测定和定量
样品DNA用紫外分光光度计测定260nm和280nm处吸收值，分别计算核酸的纯度和浓度，计算公式如下：
DNA纯度=OD20/OD280
DNA浓度（mg/mL）=50XOD250
-TTKAONIKAca
SN/T1204—2016
DNA的纯度比值应在1.71.9之间，浓度不低于20ng/uL.。7.4
实时荧光PCR检测
7.4.1实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系配制见表2每个样品设置2个平行重复表2实时荧光PCR检测体系
10×PCR缓冲液
MgCl溶液
dNTP(含dUTP)
UNG酶
上游引物
下游引物
DA模板
超纯水
注1：可选用含有PCR缘冲液、MgCl：dVIP和Tag脑实时荧光PCR扩增。
储液浓度
25mmal/1
10pmal/1
1oumol/l
10μmol/L
终浓度
2.5mmol/L
0.2mmol/L
0.075U/μL
见附录A、附录B
见附录A、附录B
见录A、附录B
50ng250ng
补足至25μL
的基于Taqman探针的实时荧光PCR预混液进行注2：ROX荧光试剂仅在具有ROX校止通道的实时荧光PCR仪上进行扩增时添加，否则用超纯水补足。注3：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。7.4.2实时荧光PCR反应程序
实时荧光PCR反应参数为：50
/10min.95℃/1
155；60℃/60s40个循环。
注：95℃/10min的专门适用了化学变构的热启动Taq酶。以上参数可根据不同型号实时荧光PCR仪和所选PCR扩增试剂体系不同作调整
仪器检测通道的选择
设置PCR反应管荧光信号收集条件，应与探针标记的报告基团一致。具体设置方法可参照仪器使用说明书。
实验对照的设立
每个样品应有2个平行实验，同时每次检测必须设立3个对照：阳性对照，为对应的转基因植物样品品系或含有相应外源基因的转基因植物样品基因组DNA，或含有上述片段的质粒标准分子DNA；阴性对照，非转基因植物样品DNA：空白对照，设两个，一是提取DNA时设置的提取空白对照（以水代替样品），二是PCR反应的空白对照（以水代替DNA模板）。6
8质量控制
SN/T1204—2016
空白对照：内源基因检测Ct值大于或等于40，外源基因或品系特异性检测Ct值大于或等于40；阴性对照：内源基因检测Ct值小于或等于30，转化事件特异性检测Ct值大于或等于40阳性对照：内源基因检测Ct值小于或等于30，转化事件特异性检测Ct值小于或等于35；上述指标有一项不符合者，说明PCR反应体系不正常，应重新进行实时PCR扩地。9结果判定及表述
9.1实时荧光PCR结果判定
测试样品检测Ct值大于或等于40.内源基因检测Ct值小于或等于30，则可判定该样品不含所检基因或品系。
测试样品检测Ct值小于或等于36，内源基因检测Ct值小于或等于30，判定该样品含有所检基因或品系。
测试样品检测Ct值在36～40之间.应调整模板浓度，重做实时荧光PCR。再次扩增后的外源基因检测Ct值仍小于40，则可判定为核样品含有所检其因或品系于或等于40，则可判定为该样品不含所检基因或品系。9.2结果表述
结果为阳性的，表述为“检出×××外源基因”或“检出×结果为阴性的，表述为“未检出×10防污染措施
外源基因”或“未检出》
再次扩增后的外源基因检测Ct值大转基因品系”；
X转基因品系”。
检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403和GB/T19495.2中的规定执行。11最低检出限
各基因片段的实时荧光PCR扩增的最低检出限（LOD）为0.01%SN/T1204-2016
基因/品系
18SrRNA
HMGI/Y
Lectin
Lectin-KVM
附录A
（规范性附录）
植物转基因成分检测实时荧光PCR检测引物和探针表A.1
植物转基因成分检测实时荧光PCR检测引物和探针终浓度
引物/探针序列（5°3°）
cctgagaaacggctacca
cgtgtcaggattgggtaat
FAM-tgcgcgcctgcigccttcet-BHQIggtcgtcctcctaaggegaaag
cttcttcggcggtegtccac
FAM-cggagceacteggtgccgcaactt-BHQ1ccettgtgaagetcgecatc
ettgtcetctgaccatetttgt
FAM-ccgaccgtcacaccgatgtttaga-BHQ1ggccagggtttccgtgat
ccgtegttgtagaaccattgg
FAM-agtccttatgtgctccactttetggtgca-BHQ1cgtcgicccaletcttectce
ccactecgagaccctcagtc
FAM-uatcagggctcatttetcgctcctca-BHQIctc ccu atc ctt tga cat ctg ctcg atr tct cie ttg gtg aca ggFAMagc aa gtc aga gcg crg caa tgca-TAMRAcctcctcgggaaagttacaa
gggeatagaaggtgaagtt
FAM-ccctegtctettggtcgcgccctct-BHQ1cacctttctcgcaccaattgace
tcaaactcaacagcgacgac
FAM-ccacauacacatgcaggttatcttgg BHQIagaccacgagaacgatatttgc
ftctrgccttttcatatceagaca
FAM-ctctttgcagtectcccttgggct-BHQ1nmol/L
适用范围
植物内源基因
油菜内源基因
玉米内源基因
大豆内源基因
番茄内源基因
基因/品系
UGPase
Alfalfa-Acc
GAG56D
pCaMV35S
表A.1（续）
引物/探针序列（5\-3\）
cacctttctcgcaccaattgaca
tcaaactcaacagcgacgac
FAM-tccgagcgtccgigcgte-BHQ1
iggtgagcgtlttgcagtct
elgatccactagcaggaggtcc
FAM-tgttgtgetgccaatgtggcctg-BHQ1tggtgagcgttttgcegtet
ctgatccactagcaggaggtcc
tgttgtgctgccaatgtggcctg
ggacatgtgaagagacggagc
cctacctctacccctecgc
FAM-ctaccaccattacctcgcacctcctca-BHQ1agtttgtaggtttgatgttacattgag
gcatctttgaaccgcctactg
FAM-aaacataaaatatgggaacaaccalgacatgt-BHQ1gacctccatattactgaaaggaag
gagteattgctccatcctgttea
FAM-ctacgaagttaaagtatgtgccgctc-BHQIgatcagtgaacttcgcaaagtac
caacgacgtgacactacaac
FAM-tgaatgctectgtgatetgcccatge-TAMRAcaacaattttctcagccccaaca
tettgcatgggttcacctgtt
FAM ttcccgcagcccaacaaccgc-BHQlgtcgcgggaacagaggtgt
ggtgttcctccattgcgaaa
FAM-caaggcggccgaaataagltgce-BHQ1gcctctgccgacagtggt
aagacgtggttggaacgtcttc
FAM-caaagatggacccccacccacg-BHQ1终浓度
nmol/L
SN/T1204—2016
适用范围
水稍内源基因
马铃薯内源基因
棉花内源基因
甜菜内源基因
苗著内源基因
小麦属内源基因
小麦种内源基因
转基因大豆、玉
米、油菜、棉花、
水稀、番茄、马铃
薯、木瓜、亚麻、
甜菜、苹果、菊
苣、剪股颖、烟
草、李子、甜瓜、
小麦、茄子和树
等外源筛选基因
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