SN/T 0535-2016.Determination of gossypol in feed for import and export.
1范围
SN/T 0535规定了饲料中棉酚的两种测定方法,高效液相色谱法(HPLC法)和液相色谱-质谱/质谱法(LC-MS/MS法)。
SN/T 0535适用于棉籽饼(粕)、猪饲料和鸡饲料中棉酚的定量测定;液相色谱质谱/质谱法的定量确证。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3第一法高效液相色谱法(HPLC法)
3.1 原理
试样用丙酮水溶液提取,过滤膜,用高效液相色谱测定,外标法定量。
3.2试剂和材料
除特殊注明外,所有试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。
3.2.1丙酮 :色谱纯。
3.2.2甲醇:色谱纯。
3.2.3磷酸。
3..3 仪器和设备
3.3.1高效液相色谱(HPLC)仪:配有紫外检测器。
3.3.2电子天平:感量为0.01 g和0.0001 g。
3.3.3离心机:转速不低于 4 000 r/min。
3.3.4振摇仪:转速不低于300 r/ min。
3.3.5涡旋混匀器。
3.3.6 塑料离心管:50 mL。
3.3.7研钵。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 0535—2016
代替SN0535-1996
进出口饲料中棉酚的测定
Determination of gossypol in feed for import and export2016-08-23发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-03-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规划起草SN/T0535—2016
本标准代替SN0535—1996出口饲料中棉酚检验方法液相色谱法》。与SN0535—1996相比，除编辑性修改外主要技术变化如下：增加了确证方法；
技术指标满足多种基质和限量要求。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国浙江出人境检验检疫局检验检疫技术中心，中华人民共和国上海出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：张文华、黄超群、邹学权、陈玲玲、于卓然、童赞恺、陈丽、汤杭燕。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN0535-1996。
1范围
进出口饲料中棉酚的测定
SN/T0535-2016
本标准规定了饲料中棉酚的两种测定方法，高效液相色谱法（HPLC法）和液相色谱-质谱/质谱法(LC-MS/MS法）。
本标准适用于棉籽饼（粕）、猪饲料和鸡饲料中棉酚的定量测定：液相色谱-质谱/质谱法的定量确证。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法法高效液相色谱法（HPLC法）
3第一法
3.1原理
试样用内酮水溶液提取，过滤膜，用高效液相色谱测定，外标法定量。3.2试剂和材料
除特殊注明外，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。3.2.1丙酮：色谱纯。
3.2.2甲醇：色谱纯。
3.2.3磷酸。
3.2.4内酮-水溶液（70+30.体积比）：准确量取70mL丙酮（3.2.1）和30mL水，混勾后备用。3.2.50.1%磷酸溶液：1mL磷酸溶解水中，并定容至1L，混匀过滤（0.45μm）后备用。3.2.6
棉酚标准品：CA.S：303457纯度为90.5%。棉酚标准储备液：准确称取10mg（精确至0.1mg）棉酚标准品于10mL容量瓶中，用丙酮3.2.7
（3.2.1)溶解并定容至刻度，配制成浓度为1mg/mL的标准储备溶液，于4℃避光保存。3.2.8
微孔滤膜：0.22μm，有机系。
3.3仪器和设备
高效液相色谱（HPLC)仪：配有紫外检测器。电子天平：感量为0.01g和0.0001g。离心机：转速不低于4000r/min
振摇仪：转速不低于300r/min。3.3.4
涡旋混匀器。
塑料离心管：50mL。
研钵。
SN/T0535—2016
3.4试样处理
称取5g（精确至0.01g）试样于50mL离心管中，加人10mL水浸泡1h加入丙酮（3.2.1)至30mL，振摇20min。离心5min后，将上清液转移至50mL棕色容量瓶中，用10mL丙酮-水溶液（3.2.4）重复提取两次，用丙酮-水溶液（3.2.4）定容至50mL，静置5min，取上清液过微孔滤膜（3.2.8），供HPLC测定。
3.5高效液相色谱测定
3.5.1HPLC参考条件
HPLC参考条件如下：
色谱柱：Cl柱，250mm×4.6mm（内径），粒径5.0um，或功能相当者。a)
流动相：甲醇（3.2.2）磷酸溶液（3.2.5）（88+12，体积比），混匀。b)
流速：1.5mL/min。
波长：238nm。
柱温：25℃。
进样量：10μL。
3.5.2标准曲线绘制
用丙酮（3.2.1)将棉酚标准储备液逐级稀释得到的浓度为1μg/mL、2μg/mL4μg/mL.6μg/mL10ng/mL的标准工作液，浓度由低到高进样检测，以峰面积浓度作图，得到标准曲线回归方程棉酚的标准品色谱图参见附录A中图A.1.3.5.3定量测定
待测样液中棉酚的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。3.5.4空白试验
除不称取试样外，均按上述测定条件和步骤进行。3.5.5结果计算
试样中棉酚的含量由色谱数据处理软件或按式（1）计算获得CxVX1000
mX1000
式中：
试样中棉酚的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；从标准工作曲线得到的棉酚溶液浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）)；样液最终定容体积，单位为毫升（mL）：最终样液代表的试样量，单位为克（g）。注：计算结果需扣除空白。
3.6方法测定低限
本方法的测定低限为10mg/kg。
3.7回收率和精密度
饲料基质中不同添加浓度水平下的回收率范围见表1。2
（1）
iKAoNiKAca
化合物
表1饲料中棉酚添加回收率与精密度试验（n=6)添加水平
/(mg/kg）
3.8阳性试样的重现性实验
三种阳性棉籽粕试样的重现性实验，结果见表2表2
被测试样
棉籽粕1
棉籽粕2
棉籽粕3
第二法
回收率范围
82.8~90.3
82.3~-87.1
测定不同阳性试样的重现性与精密度试验（n=6）测定值/mg/kg
液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS82.61
平均值
SN/T0535—2016
相对标准偏差
相对标准偏差
试样用丙酮水溶液提取，过滤膜，用液相色谱-质谱/质谱法测定和确证，外标法定量。4.2
试剂和材料
除特殊注明外，所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的一级水。4.2.1
甲酸：色谱纯。
乙睛：色谱纯。
0.1%甲酸溶液：准确量取1mL甲酸于11.容量瓶中，加水并定容至刻度，混勾后备用。其他同3.2。
仪器和设备
液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS)仪：配有电喷雾离子源（ESI）。其他同3.3。
试样处理
称取1g（精确至0.01g）试样于50mL离心管中，加人10mL水浸泡1h，加人丙酮（3.2.1）至30mL，振摇20min。离心5min后，将上清液转移至100mL棕色容量瓶中，用30mL丙酮-水溶液(3.2.4)重复提取两次，用丙酮-水溶液（3.2.4）定容至100mL。静置5min，取上清液过微孔滤膜（3.2.8），供LC-MS/MS测定。
irkAoNiKca
SN/T0535—2016
4.5液相色谱-质谱/质谱测定
LC参考条件
LC参考条件如下：
色谱柱：Cls，100mm×2.1mm（内径）；粒径3.5μm，或功能相当者。流动相：乙腈（4.2.2)-甲酸溶液（4.2.3），梯度洗脱程序参见表3。流速：0.30mL/min或根据仪器条件优化进样量：5uL，
表3梯度洗脱程序
时间/min
MS/MS参考条件
MS/MS参考条件如下：
电离方式：电喷雾离子源，负离子。电喷雾电压（IS)：3500V。
鞘气：高纯氮气，6.5L/min。
辅助气：高纯氮气，5.0L/min。碰撞气：高纯氩气，0.2Pa。
0.1%甲醇溶液/%
乙腈/%
扫描模式：多反应监测（MRM），母离子m/517.1，定量离子m/230.9，定性离子m/2471.1。
离子源温度：300℃。
毛细管温度：270℃。
碰撞能量：m/517.1>230.9为43V，m/517.1>471.1为35V。标准曲线绘制
取空白试样按照4.4处理。用所得的试样溶液将棉酚储备液（3.2.7）逐级稀释得到的浓度为0.01g/mL、0.02μg/mL、0.04μg/mL、0.06μg/mL、0.1ug/mL的标准工作液，浓度由低到高进样检测，以定量离子峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。基质匹配加标棉酚的标准溶液LC-MS/MS多反应监测质量色谱图参见附录A中的图A.2。4.5.4定量测定
待测样液中棉酚的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。4.5.5
定性测定
按照上述条件测定样液和标准工作溶液，如果样液中待测物的色谱峰保留时间与标准溶液一致（变4
rKAoNrKAca
SN/T0535—2016
化范围在土2.5%之内），试样中日标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表4的规定，则可判断试样中存在棉酚。表4定性离子相对丰度的最大允许偏差相对离子丰度
允许的相对偏差
结果计算
同3.5.4。
4.6空白实验
>20%至50%
除不称取试样外，均按上述测定条件和步骤进行。方法测定低限
本方法的测定低限为1mg/kg。
回收率和精密度
饲料基质中不同添加浓度水平下的回收率范围见表5。>10%至20%
表5饲料中棉酚添加回收率与精密度试验（n=6）化合物
添加水平
/(mg/kg)
回收率范围
88.0~102.0
83.3~90.2
82.4~86.3
≤10%
相对标准偏差
TTKAONIKAca
SN/T0535—2016
附录A
（资料性附录）
棉酚标准品色谱图
图A.1和图A.2给出广棉酚标准溶液的HPLC色谱图和多反应监测图mAu
棉酚标准溶液的HPLC色谱图（1μg/mL）12
保留时间/min
-TTKAONTKAca
517.1>230.9
517.1>471.1bzxZ.net
2棉酚标准溶液的多反应监测图（10ng/mL）图A.2
SN/T 0535—2016
保留时间/min
SN/T0535-2016
Foreword
This standard is drafted according to GB/T 1.1-2009 \Directives for standardization Part 1Structureanddrafting of standardsprinciple.This standard is used to replace of SN05351996\Method for the determinationof gossypol in fod-ders for Export-Liquid chromatographic method\.The main improvement from SN 0535-1996LC-MS/MSisperformedasaconfirmatorymethodThemethod is suitableforvariousmatrixes and limitsSome parts of the standardmay have relationshipwith some patents.The releasedepartment hasnoresponsibility to recognize these patentsThis standard was proposed by and is underthe charged of the Certification and Accreditation andAdministrationofthePeople'sRepublicofChinaThis standard was drafted by Zhejiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau of the People'sRepublicofChina
This standard is mainly drafted byZhang Wenhua,Huang Chaoqun,Zou Xuequan,Chen Lingling,YuZhuoran,TongYunkai,ChenLi,TangHangyan.This part replaced the previous version of the release of the standard as follows.—-SN0535-1996
Determination of gossypol infeedforimportandexport
SN/T0535—2016
This standard specifies two kinds of determination methods,high performanceliguid
chromatography(HPLC)and liquidchromatography-tandemmassspectrometry（LC-MS/MS)This standard is applicable to the determination and confirmation of gossypol in cottonseed cake(meal)pigfeedandchickenfeed.2
Normativereferences
The following documents are necessary for this standard. For dated references,only dated editionsshall apply to this standard. For undated references, the latest edition of the normative document(including subsequentamendments）referredto applies.GB/T6682specificationandtestmethodforwaterused inanalytical lab.3HPLC method
3.1Principle
Gossypol is extractedfromthe samplewithacetone-water(70+30,v/v),afterdilutionandfiltration,the extract is determined by HPLC, and quantified byexternal standardmethod3.2 Reagent and materials
Unless otherwise specified,all the reagents used should be analytical grade.\water\is first-gradewaterprescribedbyGB/T6682.
3.2.1Acetone:HPLC grade.
Methanol:HPLCgrade.
Phosphoricacid.
SN/T0535-—2016
Acetone-water(70+30,v/v):Dissolve70mLof acetoneto final volumeof 100mLwithwater.
3.2.50.1%phosphoricacid solution:Dissolve1mLphosphoric acid tofinal volumeof 1000mLwithwater.
Standards:gossypol,CaoHaoOg，CAsNo.:303-45-7purity90.5%.3.2.6
Stockstandardsolution:accuratelyweigh0.01±0.0001gofgossypol standardanddissolve3.2.7
withacetonetomakethe standardstock solution of1.0 mg/mL.This solution is stored ina refrigera-torat4c.
3.2.8Membranefilter：o.22umorganicphase.3.3
Apparatus and equipment
HPLC with ultraviolet detector3.3.1
Electronicbalance：Accurateo.01gand0.0001g.Centrifuge：4ooor/minequippedVibrator: 300 r/min equippedVortexmixer.
Plastic centrifuge tube:50mLMortar.
Procedure
Weigh5±0.01gof thetestsample intoa50mLpolypropylenebottle,add10mLof water,standfor1hDissolveinacetone（3.2.1)tomakethefinal volumetobe30mL,blendfor20minwithvibrator(3.3.4),transfertheabovesolutionto50mLbrownvolumetricflask,extracttheresiduewith10mLacetone-water(3.2.4)twice more,dilute exactlythe extract solution to final volume of 50 mLwithacetone-water (3.2.4),stand for5 min.After filtration,collect 1mL fordetermination.3.5HPLCdetermination
3.5.1HPLCcondition
HPLCconditionisasfollows:
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