SN/T 3277-2012
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标准简介
SN/T 3277-2012.Detection and identification of avocado sunblotch viroid.
1范围
SN/T 3277规定了进境植物检疫中对鳄梨日斑类病毒的RT-PCR、往返聚丙烯酰胺凝胶电泳和生物学测定三种检疫鉴定方法。
SN/T 3277适用于进出境鳄梨种苗中鳄梨日斑类病毒的检疫鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 2122进出境植物及植物产品检疫抽样规则
3原理
鳄梨日斑类病毒(avocado sunblotch viroid,ASBVd)属于鳄梨日斑类病毒科( Avsunviroidae)鳄梨日斑类病毒属(Arusunviroid)。该类病毒的分子生物学和生物学特性(参见附录A)是检疫鉴定的主要依据。
4仪器设备及设施、用具及试剂
4.1 仪器设备及设施
天平(感量,1/10 000 g)、pH计、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、隔离检疫温室恒温水浴、
低温冰箱等。
微量移液器(2μL,10μL,20μL.100μL,200μL,1000μL)、研钵、离心管、花盆、消毒土等。
4.2 RT-PCR 检测试剂
见附录B。
4.3往返聚丙烯酰胺凝胶电泳检测试剂
见附录C。
1范围
SN/T 3277规定了进境植物检疫中对鳄梨日斑类病毒的RT-PCR、往返聚丙烯酰胺凝胶电泳和生物学测定三种检疫鉴定方法。
SN/T 3277适用于进出境鳄梨种苗中鳄梨日斑类病毒的检疫鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 2122进出境植物及植物产品检疫抽样规则
3原理
鳄梨日斑类病毒(avocado sunblotch viroid,ASBVd)属于鳄梨日斑类病毒科( Avsunviroidae)鳄梨日斑类病毒属(Arusunviroid)。该类病毒的分子生物学和生物学特性(参见附录A)是检疫鉴定的主要依据。
4仪器设备及设施、用具及试剂
4.1 仪器设备及设施
天平(感量,1/10 000 g)、pH计、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、隔离检疫温室恒温水浴、
低温冰箱等。
微量移液器(2μL,10μL,20μL.100μL,200μL,1000μL)、研钵、离心管、花盆、消毒土等。
4.2 RT-PCR 检测试剂
见附录B。
4.3往返聚丙烯酰胺凝胶电泳检测试剂
见附录C。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3277—2012
鳄梨日斑类病毒检疫鉴定方法
Detection and identification of avocado sunblotch viroid2012-10-23发布
中华人民共利国
国家质量监督检验检疫总局
2013-05-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。SN/T3277--2012
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中国检验检疫科学研究院。
本标准半要起草人：郑耘、陈枝楠、张永江、卢小雨、冯建军、汪荣、李一农、刘新娇。1范围
鳄梨日斑类病毒检疫鉴定方法
SN/T3277-2012
本标准规定了进境植物检疫中对鳄梨日斑类病毒的RT-PCR，往返聚丙烯酰胺凝胶电泳和生物学测定三种检疫鉴定方法。
本标准适用于进出境鳄梨种苗中鳄梨日斑类病毒的检疫鉴定2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样规则3原理
鳄梨日斑类病毒（avocado sunblotchviroid，ASBVd）属于鳄梨日斑类病毒科（Avsunviroidae）鳄梨日斑类病毒属（Ausunuiroid）。该类病毒的分子生物学和生物学特性（参见附录A）是检疫鉴定的主要依据。
4仪器设备及设施、用具及试剂
仪器设备及设施
天平（感量，1/10000g）、pH计、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、隔离检疫温室、恒温水浴、低温冰箱等
微量移液器（2μ，10μ，20，100，200，1000）、研钵、离心管、花盆、消毒土等。4.2RT-PCR检测试剂
见附录B。
4.3往返聚丙烯酰胺凝胶电泳检测试剂见附录C。
5样品制备
抽样按照SN/T2122的规定执行。5.1种子类
随机抽取100粒种子，将其分为五组，在适宜的发芽温度（20℃～28℃）条件下催芽，直至长出第一对真叶。随机抽取20株苗叶片，每株取1g叶片，制备成一个样品。1
SN/T3277-20.12
5.2苗木类
将架苗木等繁殖材料种精在隔离温室中，于25℃牛长并观察症状。取1g表现症状和光症状植株的片（或花芽），制备成-个样品。6检测方法
6.1RT-PCR检测
方法见附录B
6.2往返聚丙两烯酰胺凝胶电泳测定方法见附录C。
6.3生物学测定
方法附录
7结果判定
如RT-PCR检测结果为阳性，往返聚丙烯酰胺凝胶电泳測定.或生物学测定地为阳性，可判定待检样品带有鳄梨口斑类病毒。如RT-PCR检测结果为阴性，往返聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，或生物学测定结果也为阴性，则可判定待检样品不带有鳄梨H斑类病毒，如RT-PCR检测结果、生物学测定结果，或往返紧丙烯酰胺凝胶电泳测定中，任意一个为阳性，而其余为为阴性，则需重做实验。8样品和档案保存
8.1样品保存
经检测确定带鳄梨日斑类病毒的样品十燥后在-80 ℃冰箱保存 1年。在鳄梨繁殖材料中发现该类病毒的，采集叶片、花芽等类病毒浓度较高的材料十燥处理保存。检测原始记录、照片等文档按有关规定做好登记、标记利存档，以便必要时复核。8.2结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、登记时间、实验地点、检测方法和结果等，并要有经于人和实验人员的签字。RT-PCR检测应有电泳结果和往返聚丙烯酰胺凝胶电泳测定需有图片，生物学测定应有鉴别肾主的症状照片。
rKAoNiKAca
A, 1病原及其特性
附录A
（资料性附）
鳄梨日斑类病毒生物学特性
SN/T 3277—2012
ASBVd 为棒状结构,是一条共价闭合的单链环状 RNA分子;由长度为 247个核苷酸残基组成,柜对分子质量为0.8XI0’da。ASBVcl 序列独特,富含 A-U 碱苯,与其他类病毒的同源率低，具有白我切割的特性。ASBVd在寄主的叶绿休内增殖和积累，滴度很高,有时与寄主 5S RNA 的浓度相当。A,2奇主范围
裔主范围仪限于科鳄梨属植物，表明其与寄≠植物具有高度的特另性。A. 3病害症状
受ASBVd侵染的鳄梨（Persea americara Mil.）.树势夜弱，在果实上叶现黄色、门色或粉红色的斑纹，有时水果上能形成下陷的火山状病斑，病斑可为英色，绿色和深红色，受害果实市场价值降低；还可以在茎、子叶上引起黄色、橙色或户色的下陷的斑或点；在叶片上引起褪绿和扭曲，受植株比康植株稍矮，但较难区分。口间ASBVd 的典型症状是枝权表皮上的条纹和斑点。ASBVd侵染鳄梨后，造成严重的经济损失。病果树与健康果树相比，产果数最减少，量下降30为以上，树干矮小，枝十朝地面弯曲.树形扁平状，平伸的树形增加了暴露日光的面积，易被强阳光灼伤。果实！的条纹影响了鳞的市场价值，A.4分布地区
在狠多种植鳄梨的国家都有该病的发生，包括澳大利亚、以色列、秘鲁、南非、美国及委内瑞拉。A.5传播方式
ASBVd可通过嫁接、种了，花粉和机械等方式传播，但至今尚无昆虫传播的报道。该类病毒可通过嫁接方式在樟科植物之间传播，也能通过花芽、接穗，树皮等嫁接方式传播，白然的根接也能传播。潜伏侵染的植株极易种子传播，种传率为80%～100头,被传播的后代植株也不表现症状；而显症的植株种传率较低，常小于5%，被传播的后代植株也衣现症状。在实验条件下，甲虫（Apmelzfera）能导致低频率(1.8%~-3.3%)的花粉传播。3
KAoNiKAca
SN/T 3277—2012
B.1试剂
B.1.1RNA抽提
采用Trizol法提取总RNA
B.1.250XTAE
冰醋酸
NaEDTA-2H,0
附录B
（规范性附录）
RT-PCR检测
加去离子水定容至1L。用时加水稀释至B.1,36×加样缓冲液
溴酚蓝
薰糖水溶液
B.2试验步骤
总RNA提取
B.2.1.1取样
40%（质量浓度）
鳄梨苗木取叶片部分，花取花劳，果实取表现症状的果皮B.2.1.2RNA抽提
称取鳄梨苗木的叶片、或花芽、或更皮样品（被检测样品、阳性样品为带有鳄梨日斑类病毒的植物材料、阴性样品为不带有鳄梨日斑类病毒的材料>0.1g，液氮充分研磨。加入1mLTrizol，混勾，倒人1.5mL离心管中。加入0.2mL三氯甲烷，剧烈振荡15s，4℃条件下12000g离心10min，小心吸取上层水相至新离心管中。加入等体积异丙醇，混匀，一20℃静止10min，4℃条件下12000g离心15min，弃上层水相。加人1mL75%乙醇，重悬沉淀，4℃条件下8000g离心10min，弃上层乙醇相，干燥沉淀。加人30pLDEPC-H，置于50C条件下5min溶解沉淀.存于一80℃条件下备用。也可采用供应商推荐的试剂盒抽提RNA。B.2.2RT-PCR反应
B.2.2. 1引物
根据鳄梨日斑类病毒基因上游保守序列设计特异性引物对，上游引物（PAB-FP)与第68至87个核苷酸序列一致，下游引物（PAB-RP）与第88至104个核苷酸序列互补，具体序列如下：PABFP.5-AAGTCGAAACTCAGAGTCGG3'4
KAoNiKAca
PAB-RP:5-GTGAGAGAAGGAGGAGT-3B.2.2.2CDNA合成
SN/T3277—2012
按下列组分见表B1）制备RT反应混合液20L反应条件：25℃温育20min，42℃反转录1.5h，95℃灭活2min~3min
表B.1组分
试剂名称
模板RNA
反向引物（20μmol/L）
5XAMV缓冲液
dNTP(10 mmol/L)
AMV反转录酶（5U/μL）
RNA酶抑制剂（40U/μL)
DEPC处理过的H20
B.2.2.3反应程序
在冰上依次将下列组分（见表B，加样量/uL
充分混与后进入热循环反应：94℃变性1min，55℃复性2min，72℃延伸3min，共40个循环最后72表B.2
试剂名称
10×PCR反应缓冲液
氯化镁（MμCl）
正向引物
反向引物
补加水至总体积
琼脂糖电泳
制备凝胶
胜备液浓技
25mmol/L
10mmal
pmol/LbZxz.net
20mol/L
5U/μL
繁浓度
4min。
加样量/μL
2.0mmol/L
mmol/i
Q.2amal/L
1.5U/test
加人TAE配置质量浓度为2%的琼脂糖，在微波炉中熔化混匀，冷却至55℃左右。B.2.3.2
加入溴化乙镜
加人浓度为0.5u/mL的溴化乙锭，混匀，倒人已封好的凝胶平台上，插入样品梳。待凝胶凝固后，拔出梳子，加人足够量的TAE（缓冲液盖过凝胶表面约1mm）。5
irKAoNiiKAca
SN/T 3277-2012
B. 2. 3. 3
吸取10μL反应液，加人2μL.6×加样缓冲液混合均匀-将其和适合的DNA相对分子质量标准物分别加入到样品孔中。电泳结束后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统下观察并保留结果。B. 3
结果判断
阳性对照在247bp处有扩增片段-阴性对照和空白对照无特另性扩增，待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带，可判定为阳性。结果达到质控要求，且待测样品在247bp处无扩增条带，判定结果为阴性。
KAoNiKAca
C.1试剂
C. 1,1RNA 的抽提
采用Trizol法提最总RNA。
C. 1.210 × TBE
附录C
（规范性附录）
往返聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
890 rimol/1
890 mal/L.
乙二胺四乙酸二钠（CHN0Naz·2HzO)调 pH至 8. 3,加双蒸水定容至 1 L.。3加样缓冲液
溴酚蓝
二中苯
C. 1. 4固定液
冰醋酸
C.1.5染色液
1 g硝酸银加双蒸水定容至500mL。c. 1. 6
6显色液
氢氧化钠
0. 4 mol/L.
用双蒸水定容至11。
C.2聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE）C.2. 1RNA的提取
C. 2. 1. 1 取样
鳄梨苗木取叶片部分，花取花芽。20 mmol/L
SN/T 3277-2012
SN/T32772012
C.2.1.2抽提RNA
称取鳄梨苗木的叶片或花芽样品（被检测样品、阳性样品-带有鳄日斑类病毒的植物材料、阴性样品-不带有鳄梨日斑类病毒的材料)2g，液氮充分研磨。其余方法同C.2.1。C.2.2聚丙烯酰胺凝胶电泳
C.2.2.1凝胶制备
聚丙烯酰胺凝胶浓度为6%。在小烧杯中按顺序加人双蒸水20.77mL，30%凝胶储备液6mL，10×TBE缓冲液3mL，TEMED30μL10%过硫酸铵（现配现用）200μL.充分混匀后灌胶。然后插入样品梳。待胶完全凝聚后在电泳槽内加人1XTBE电极缓冲液，然后轻轻拔掉梳子。C.2.2.2预电泳
加样前进行预电泳，电压150V.10min。C.2.2.3加样
取10L提取的RNA样品（被检测样品、阳性样品、阴性样品），按1：1的比例加入加样缓冲液。C.2.2.4第一向电泳
电极缓冲液为TBE，电压150
C.2.2.5第二向电泳
V、当澳酚蓝移出凝胶板二甲苯蓝接近胶底部时.停止电泳。弃去第一向电泳的电极缓冲液，先将1×TBE缓冲液加热到
80℃，倒在电泳槽内，保持温度70℃~75℃，15min，使核酸完全变性，调转电极方向，电压为200V至二甲苯蓝示踪染料带迁移到胶顶部，停止电泳。
C.2.2.6固定
将胶先用双蒸水冲洗3次，每沃2ainC.2.2.7染色
喜min.然后用固定液固定60min。弃去固定液，用双蒸水冲洗3次，每次2min3min，然后加人染色液振荡染色30min。C.2.2.8显色
弃去染色液，用双蒸水冲洗3次，每次2min~3min，将胶转移至显色液中，振荡，直至显出淡褐色条带，弃去显色液，加人0.75mol/L的碳酸钠溶液。C.3结果判断
样品经往返聚丙烯胺凝胶电泳测定，如阴性对照不出现RNA环状分子条带，阳性对照出现RNA环状分子条带，待测样品实验结果观察到RNA环状分子条带.即可判定检测结果为阳性未观察到RNA环状分子条带，即可判定检测结果为阴性。8
嫁接接种
附录D
（规范性附录）
生物学测定
SN/T 3277—2012
将待测材料嫁接至鳄梨的幼苗上。剔除待材料砧木)生长点.用月片在其子叶下1cm处尚下呈20~30斜切，深度达茎粗=分之二为宜，切口长5mtn~6imm：接种鳄梨日斑类病毒至鳄梨（P.Amerrana)Iass品种的（接穗）幼带叶下2cm处，向上20°~30°斜切深度为举粗两分之一左右，切口长为5mm～6mm，将接穗与础木的舌形切口互相嵌接好，并用嫁接夹在切吻合处加以固定·使切口密切接合，并立即裁植在营养钵！，沿钵边缘浇足底水。D.2
寄主症状
将待测材料嫁接至鳃梨IIass品种的幼苗上，2个月到3年后，嫁接苗木的茎干、子叶上显示黄色、橙色或白色的斑纹或斑点，叶片上有时能显小花斑和扭面的症状。可利用胚胎嫁接或高温（30℃82 C)培择方法加快表现症状，
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鳄梨日斑类病毒检疫鉴定方法
Detection and identification of avocado sunblotch viroid2012-10-23发布
中华人民共利国
国家质量监督检验检疫总局
2013-05-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。SN/T3277--2012
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中国检验检疫科学研究院。
本标准半要起草人：郑耘、陈枝楠、张永江、卢小雨、冯建军、汪荣、李一农、刘新娇。1范围
鳄梨日斑类病毒检疫鉴定方法
SN/T3277-2012
本标准规定了进境植物检疫中对鳄梨日斑类病毒的RT-PCR，往返聚丙烯酰胺凝胶电泳和生物学测定三种检疫鉴定方法。
本标准适用于进出境鳄梨种苗中鳄梨日斑类病毒的检疫鉴定2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样规则3原理
鳄梨日斑类病毒（avocado sunblotchviroid，ASBVd）属于鳄梨日斑类病毒科（Avsunviroidae）鳄梨日斑类病毒属（Ausunuiroid）。该类病毒的分子生物学和生物学特性（参见附录A）是检疫鉴定的主要依据。
4仪器设备及设施、用具及试剂
仪器设备及设施
天平（感量，1/10000g）、pH计、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、隔离检疫温室、恒温水浴、低温冰箱等
微量移液器（2μ，10μ，20，100，200，1000）、研钵、离心管、花盆、消毒土等。4.2RT-PCR检测试剂
见附录B。
4.3往返聚丙烯酰胺凝胶电泳检测试剂见附录C。
5样品制备
抽样按照SN/T2122的规定执行。5.1种子类
随机抽取100粒种子，将其分为五组，在适宜的发芽温度（20℃～28℃）条件下催芽，直至长出第一对真叶。随机抽取20株苗叶片，每株取1g叶片，制备成一个样品。1
SN/T3277-20.12
5.2苗木类
将架苗木等繁殖材料种精在隔离温室中，于25℃牛长并观察症状。取1g表现症状和光症状植株的片（或花芽），制备成-个样品。6检测方法
6.1RT-PCR检测
方法见附录B
6.2往返聚丙两烯酰胺凝胶电泳测定方法见附录C。
6.3生物学测定
方法附录
7结果判定
如RT-PCR检测结果为阳性，往返聚丙烯酰胺凝胶电泳測定.或生物学测定地为阳性，可判定待检样品带有鳄梨口斑类病毒。如RT-PCR检测结果为阴性，往返聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，或生物学测定结果也为阴性，则可判定待检样品不带有鳄梨H斑类病毒，如RT-PCR检测结果、生物学测定结果，或往返紧丙烯酰胺凝胶电泳测定中，任意一个为阳性，而其余为为阴性，则需重做实验。8样品和档案保存
8.1样品保存
经检测确定带鳄梨日斑类病毒的样品十燥后在-80 ℃冰箱保存 1年。在鳄梨繁殖材料中发现该类病毒的，采集叶片、花芽等类病毒浓度较高的材料十燥处理保存。检测原始记录、照片等文档按有关规定做好登记、标记利存档，以便必要时复核。8.2结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、登记时间、实验地点、检测方法和结果等，并要有经于人和实验人员的签字。RT-PCR检测应有电泳结果和往返聚丙烯酰胺凝胶电泳测定需有图片，生物学测定应有鉴别肾主的症状照片。
rKAoNiKAca
A, 1病原及其特性
附录A
（资料性附）
鳄梨日斑类病毒生物学特性
SN/T 3277—2012
ASBVd 为棒状结构,是一条共价闭合的单链环状 RNA分子;由长度为 247个核苷酸残基组成,柜对分子质量为0.8XI0’da。ASBVcl 序列独特,富含 A-U 碱苯,与其他类病毒的同源率低，具有白我切割的特性。ASBVd在寄主的叶绿休内增殖和积累，滴度很高,有时与寄主 5S RNA 的浓度相当。A,2奇主范围
裔主范围仪限于科鳄梨属植物，表明其与寄≠植物具有高度的特另性。A. 3病害症状
受ASBVd侵染的鳄梨（Persea americara Mil.）.树势夜弱，在果实上叶现黄色、门色或粉红色的斑纹，有时水果上能形成下陷的火山状病斑，病斑可为英色，绿色和深红色，受害果实市场价值降低；还可以在茎、子叶上引起黄色、橙色或户色的下陷的斑或点；在叶片上引起褪绿和扭曲，受植株比康植株稍矮，但较难区分。口间ASBVd 的典型症状是枝权表皮上的条纹和斑点。ASBVd侵染鳄梨后，造成严重的经济损失。病果树与健康果树相比，产果数最减少，量下降30为以上，树干矮小，枝十朝地面弯曲.树形扁平状，平伸的树形增加了暴露日光的面积，易被强阳光灼伤。果实！的条纹影响了鳞的市场价值，A.4分布地区
在狠多种植鳄梨的国家都有该病的发生，包括澳大利亚、以色列、秘鲁、南非、美国及委内瑞拉。A.5传播方式
ASBVd可通过嫁接、种了，花粉和机械等方式传播，但至今尚无昆虫传播的报道。该类病毒可通过嫁接方式在樟科植物之间传播，也能通过花芽、接穗，树皮等嫁接方式传播，白然的根接也能传播。潜伏侵染的植株极易种子传播，种传率为80%～100头,被传播的后代植株也不表现症状；而显症的植株种传率较低，常小于5%，被传播的后代植株也衣现症状。在实验条件下，甲虫（Apmelzfera）能导致低频率(1.8%~-3.3%)的花粉传播。3
KAoNiKAca
SN/T 3277—2012
B.1试剂
B.1.1RNA抽提
采用Trizol法提取总RNA
B.1.250XTAE
冰醋酸
NaEDTA-2H,0
附录B
（规范性附录）
RT-PCR检测
加去离子水定容至1L。用时加水稀释至B.1,36×加样缓冲液
溴酚蓝
薰糖水溶液
B.2试验步骤
总RNA提取
B.2.1.1取样
40%（质量浓度）
鳄梨苗木取叶片部分，花取花劳，果实取表现症状的果皮B.2.1.2RNA抽提
称取鳄梨苗木的叶片、或花芽、或更皮样品（被检测样品、阳性样品为带有鳄梨日斑类病毒的植物材料、阴性样品为不带有鳄梨日斑类病毒的材料>0.1g，液氮充分研磨。加入1mLTrizol，混勾，倒人1.5mL离心管中。加入0.2mL三氯甲烷，剧烈振荡15s，4℃条件下12000g离心10min，小心吸取上层水相至新离心管中。加入等体积异丙醇，混匀，一20℃静止10min，4℃条件下12000g离心15min，弃上层水相。加人1mL75%乙醇，重悬沉淀，4℃条件下8000g离心10min，弃上层乙醇相，干燥沉淀。加人30pLDEPC-H，置于50C条件下5min溶解沉淀.存于一80℃条件下备用。也可采用供应商推荐的试剂盒抽提RNA。B.2.2RT-PCR反应
B.2.2. 1引物
根据鳄梨日斑类病毒基因上游保守序列设计特异性引物对，上游引物（PAB-FP)与第68至87个核苷酸序列一致，下游引物（PAB-RP）与第88至104个核苷酸序列互补，具体序列如下：PABFP.5-AAGTCGAAACTCAGAGTCGG3'4
KAoNiKAca
PAB-RP:5-GTGAGAGAAGGAGGAGT-3B.2.2.2CDNA合成
SN/T3277—2012
按下列组分见表B1）制备RT反应混合液20L反应条件：25℃温育20min，42℃反转录1.5h，95℃灭活2min~3min
表B.1组分
试剂名称
模板RNA
反向引物（20μmol/L）
5XAMV缓冲液
dNTP(10 mmol/L)
AMV反转录酶（5U/μL）
RNA酶抑制剂（40U/μL)
DEPC处理过的H20
B.2.2.3反应程序
在冰上依次将下列组分（见表B，加样量/uL
充分混与后进入热循环反应：94℃变性1min，55℃复性2min，72℃延伸3min，共40个循环最后72表B.2
试剂名称
10×PCR反应缓冲液
氯化镁（MμCl）
正向引物
反向引物
补加水至总体积
琼脂糖电泳
制备凝胶
胜备液浓技
25mmol/L
10mmal
pmol/LbZxz.net
20mol/L
5U/μL
繁浓度
4min。
加样量/μL
2.0mmol/L
mmol/i
Q.2amal/L
1.5U/test
加人TAE配置质量浓度为2%的琼脂糖，在微波炉中熔化混匀，冷却至55℃左右。B.2.3.2
加入溴化乙镜
加人浓度为0.5u/mL的溴化乙锭，混匀，倒人已封好的凝胶平台上，插入样品梳。待凝胶凝固后，拔出梳子，加人足够量的TAE（缓冲液盖过凝胶表面约1mm）。5
irKAoNiiKAca
SN/T 3277-2012
B. 2. 3. 3
吸取10μL反应液，加人2μL.6×加样缓冲液混合均匀-将其和适合的DNA相对分子质量标准物分别加入到样品孔中。电泳结束后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统下观察并保留结果。B. 3
结果判断
阳性对照在247bp处有扩增片段-阴性对照和空白对照无特另性扩增，待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带，可判定为阳性。结果达到质控要求，且待测样品在247bp处无扩增条带，判定结果为阴性。
KAoNiKAca
C.1试剂
C. 1,1RNA 的抽提
采用Trizol法提最总RNA。
C. 1.210 × TBE
附录C
（规范性附录）
往返聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
890 rimol/1
890 mal/L.
乙二胺四乙酸二钠（CHN0Naz·2HzO)调 pH至 8. 3,加双蒸水定容至 1 L.。3加样缓冲液
溴酚蓝
二中苯
C. 1. 4固定液
冰醋酸
C.1.5染色液
1 g硝酸银加双蒸水定容至500mL。c. 1. 6
6显色液
氢氧化钠
0. 4 mol/L.
用双蒸水定容至11。
C.2聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE）C.2. 1RNA的提取
C. 2. 1. 1 取样
鳄梨苗木取叶片部分，花取花芽。20 mmol/L
SN/T 3277-2012
SN/T32772012
C.2.1.2抽提RNA
称取鳄梨苗木的叶片或花芽样品（被检测样品、阳性样品-带有鳄日斑类病毒的植物材料、阴性样品-不带有鳄梨日斑类病毒的材料)2g，液氮充分研磨。其余方法同C.2.1。C.2.2聚丙烯酰胺凝胶电泳
C.2.2.1凝胶制备
聚丙烯酰胺凝胶浓度为6%。在小烧杯中按顺序加人双蒸水20.77mL，30%凝胶储备液6mL，10×TBE缓冲液3mL，TEMED30μL10%过硫酸铵（现配现用）200μL.充分混匀后灌胶。然后插入样品梳。待胶完全凝聚后在电泳槽内加人1XTBE电极缓冲液，然后轻轻拔掉梳子。C.2.2.2预电泳
加样前进行预电泳，电压150V.10min。C.2.2.3加样
取10L提取的RNA样品（被检测样品、阳性样品、阴性样品），按1：1的比例加入加样缓冲液。C.2.2.4第一向电泳
电极缓冲液为TBE，电压150
C.2.2.5第二向电泳
V、当澳酚蓝移出凝胶板二甲苯蓝接近胶底部时.停止电泳。弃去第一向电泳的电极缓冲液，先将1×TBE缓冲液加热到
80℃，倒在电泳槽内，保持温度70℃~75℃，15min，使核酸完全变性，调转电极方向，电压为200V至二甲苯蓝示踪染料带迁移到胶顶部，停止电泳。
C.2.2.6固定
将胶先用双蒸水冲洗3次，每沃2ainC.2.2.7染色
喜min.然后用固定液固定60min。弃去固定液，用双蒸水冲洗3次，每次2min3min，然后加人染色液振荡染色30min。C.2.2.8显色
弃去染色液，用双蒸水冲洗3次，每次2min~3min，将胶转移至显色液中，振荡，直至显出淡褐色条带，弃去显色液，加人0.75mol/L的碳酸钠溶液。C.3结果判断
样品经往返聚丙烯胺凝胶电泳测定，如阴性对照不出现RNA环状分子条带，阳性对照出现RNA环状分子条带，待测样品实验结果观察到RNA环状分子条带.即可判定检测结果为阳性未观察到RNA环状分子条带，即可判定检测结果为阴性。8
嫁接接种
附录D
（规范性附录）
生物学测定
SN/T 3277—2012
将待测材料嫁接至鳄梨的幼苗上。剔除待材料砧木)生长点.用月片在其子叶下1cm处尚下呈20~30斜切，深度达茎粗=分之二为宜，切口长5mtn~6imm：接种鳄梨日斑类病毒至鳄梨（P.Amerrana)Iass品种的（接穗）幼带叶下2cm处，向上20°~30°斜切深度为举粗两分之一左右，切口长为5mm～6mm，将接穗与础木的舌形切口互相嵌接好，并用嫁接夹在切吻合处加以固定·使切口密切接合，并立即裁植在营养钵！，沿钵边缘浇足底水。D.2
寄主症状
将待测材料嫁接至鳃梨IIass品种的幼苗上，2个月到3年后，嫁接苗木的茎干、子叶上显示黄色、橙色或白色的斑纹或斑点，叶片上有时能显小花斑和扭面的症状。可利用胚胎嫁接或高温（30℃82 C)培择方法加快表现症状，
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