SN/T 3289-2012
基本信息
标准号： SN/T 3289-2012
中文名称：苹果果腐病菌检疫鉴定方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3289-2012.Detection and identification of Dia porthe perniciosa Marchal& E. J. Marchal.
1范围
SN/T 3289规定了苹果果腐病菌( Dia porthe perniciosa Marchal &. E. J. Marchal)的检疫鉴定方法。
SN/T 3289适用于相关寄主苗木和新鲜果实的苹果果腐病菌的检疫鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T1538.1培养基制备指南第1部分:实验室培养基制备质量保证通则
SN/T2077进出境苹果检疫规程
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
3. 1子实体fruiting body
无性繁殖或有性繁殖、结构简单的或复杂的真菌产孢结构,统称为子实体。
3.2子座stroma
由真菌组织形成的、可产生孢子等繁殖器官的垫状或头状组织。
3.3子囊壳perithecia
子囊菌亚门真菌形成的一种产生子囊孢子、包被有固定的孔口的子实体(子囊果)。
3.4分生孢子器pycnidia
半知菌球壳孢目真菌形成的一种子实体,与子囊菌的子囊壳相似，球形或瓶形,但产生分生孢子。
3.5 α型、β型分生孢子alpha conidia , beta conidia
拟茎点霉属(Phomopsissp.)分生孢子器中产生的两种类型分生孢子,α型分生孢子为卵圆形至纺锤形,能萌发,β型分生孢子为线型,不能萌发。
3.6分生孢子cirrus
从成熟分生孢子器中涌出的大量分生孢子,呈黏稠状堆集。
1范围
SN/T 3289规定了苹果果腐病菌( Dia porthe perniciosa Marchal &. E. J. Marchal)的检疫鉴定方法。
SN/T 3289适用于相关寄主苗木和新鲜果实的苹果果腐病菌的检疫鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T1538.1培养基制备指南第1部分:实验室培养基制备质量保证通则
SN/T2077进出境苹果检疫规程
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
3. 1子实体fruiting body
无性繁殖或有性繁殖、结构简单的或复杂的真菌产孢结构,统称为子实体。
3.2子座stroma
由真菌组织形成的、可产生孢子等繁殖器官的垫状或头状组织。
3.3子囊壳perithecia
子囊菌亚门真菌形成的一种产生子囊孢子、包被有固定的孔口的子实体(子囊果)。
3.4分生孢子器pycnidia
半知菌球壳孢目真菌形成的一种子实体,与子囊菌的子囊壳相似，球形或瓶形,但产生分生孢子。
3.5 α型、β型分生孢子alpha conidia , beta conidia
拟茎点霉属(Phomopsissp.)分生孢子器中产生的两种类型分生孢子,α型分生孢子为卵圆形至纺锤形,能萌发,β型分生孢子为线型,不能萌发。
3.6分生孢子cirrus
从成熟分生孢子器中涌出的大量分生孢子,呈黏稠状堆集。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3289—2012
苹果果腐病菌检疫鉴定方法
Detection and identification of Diaporthe perniciosa Marchai & E. J. Marchal2012-10-23发布
中华人民共和国
国家质量警检验检疫总局
2013-05-01实施
本标准按照GB/T 1,1--2009 给出的规则越草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3289--2012
本标准起草单位：中华人民其和国广东出人境检验检疫尚、中华人民共和国嘉兴出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国烟台出人境检验检疫局。本标准主要起草人：于卫芳、胡佳、张建成、程颖慧、栾晶。1范围
苹果果腐病菌检疫鉴定方法
SN/T 3289—2012
本标准规定『苹果果腐病菌（DiaporthepernicioxaMarchal&E.J.Marchal)的检疫鉴定方法。本标准适用丁相关寄主苗木和新鲜果实的苹果果腐病菌的检疫鉴定。2规范性引用文件
下列文件对丁本文件的成用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注口期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修收单)适用丁本文件，SN/T 1538.1培养基制备指南第1部分;实验室培养基制备质量保证通则SV/T2077进山境苹果检疫规程
3术语和定义
下列术语和定义适用丁本文件
子实体fruiting body
尤性繁殖或有性繁殖、结构简单的或复杂的真菌产疱结构.统称为子实体。3.2
子座stroma
出真菌组织形成的、可产生子等繁殖器官的垫状或头状组织。3.3
子龚壳perithecia
子變菌亚门真蘭形成的一种产尘了襄孢子、包被有固定的孔口的子实体（十囊果），3.4
分生抱子器Pycnidia
半知菌球壳孢目真菌形成的一种了实体，与子囊菌的子粪壳相似，球形或瓶形、但产生分牛孢子。3.5
a型、β型分生孢子alphaennidia，hctaconidia拟落点需属（Phomopsissp.)分生孢子器中产生的两种类型分生孢了，α型分生孢子为卵圆形至纺锤形，能萌发，3型分生孢了为线型，不能明发，3.6
分生孢子角
cirrus
从成熟分生拖了器中涌出的大量分牛孢子，呈黏稠状堆集。4检疫鉴定原理
节果果腐病菌分类、分布放寄主鑫见附录A。其既能在果园为害枝条枝十，又能为害采后果实，引SN/T3289—2012
起运期果实腐烂。在田间，该病6，7月份开始发生，通常在小枝上尤其是树冠下部的小枝上开始发病。
本标准以寄主上的症状特点、病菌形态学特征、培养特性（参见附录B和附录C)作为苹果果腐病菌的主要检疫鉴定依据，致病性测定及病菌ITS序列分析结果作为草果果腐病菌的辅助检疫鉴定依据。5设备及用具
5.1仪器设备
体视显微镜、生物显微镜、电子天平（感量0.01g）、高压灭菌器、超净工作台、生物培养箱（带黑光灯）高速离心机、PCR仪、凝胶成像系统5.2实验用具
标签、定性滤纸、样品袋、保鲜袋、手持放大镜、锻子、解韵刀、酒精灯、接种针、培养皿、烧杯、量筒、三角瓶、载玻片、盖玻片、微量移液器（可调式范围：2.5L~1000mL）。6试剂和培养基
6.1试剂
1%NaOCI溶液、无水乙醇70%乙醇、无菌双热水，2%CTAB提取缓冲液，10%SDS溶液、3mol/LTee）苯酚、三氯甲烷、异戊醇、Tris-HCI.EDTA、琼醋酸钠溶液，PCR试剂（包括Taq聚合酶、dNTP，buff脂糖、DNA相对分子质量标准，TBE电泳缓冲液6.2培养基
马铃薯葡葡糖琼脂培养基PDA（参见附录D）配制培养基时按照SN/T1538.1的要求。7抽样
口岸现场查验时，按照SN工2077进行抽样与取样8检疫鉴定方法
8.1现场查验
8.1:1苗木检验
重点查验枝条和枝干，从树冠下部开始·逐渐向树冠上部观察。观察枝条表面是否有突起的坏死组织，枝干，主干上是否有凹陷的溃疡或者环割和坏死病斑，坏死组织剖面是否褐变，树皮坏死部位是否有树胶分泌，叶片是否变黄，或部分萎為。8.1.2果实检验
仔细检查果实的果柄基部、萼部、果面是否腐烂，腐烂组织是否有汁液流出，病部是否有病菌的子实体。
标注品名、数量、生产国及取样地点、取样人和取样日期等样品信息，将可疑苗木和果实样品带回实2
KAoNIKAca
验室作进一步检验。
8.2实验室检验
8.2.1直接镜检
SN/T3289—2012
如果病枝或病果有明显病征，直接进行显微镜检查，在体视显微镜下挑取病部子实体制成玻片，置于生物显微镜下镜检，观察记录分生孢子座、分生孢子器、分生孢子及子囊壳、子囊，子囊孢子的形态特征，进行显微计测，同时分离病原菌8.2.2保湿培养
如病枝或病果上只有可疑病状而无明显病征，则将病枝（裁成5cm）或病果置于样品袋中，于20℃～25℃下保湿培养，每天观察症状的变化，并分离病原菌8.2.3分离培养
直接挑取病部的子实体或孢于，或切取病健交界的数块组织（大小约5mm×5mm），用1%NaOCl进行表面消毒3min，无菌水冲洗3次，置于PDA平板上于25℃24h黑暗培养14d，然后转到20℃24h荧光条件下培养10d，观察记录菌落的培养性状和形态学特征，包括菌落的形态、颜色、大小及子实体、分生孢子的形态和大小，疑似菌株转到PDA平板上纯化二次，保存备用。8.2.4致病性测定
将纯分离物作为供试菌株，水品富士苹果鲜果为供试材料，接种方法为伤口接种。供试菌株在PDA平板上，于25℃、24h黑暗下培养14d，然后转到2024b荧光条件下培养10d，挑取菌落上的，并将施子终浓度调整为
分生孢子角，用无菌水配制成孢子影浮液
用70%乙醇涂抹供试苹果
表面毒
X10*/mL
用无菌刀片在果身切出宽1cm左右的浅伤痕，将无菌水做对照将无菌湿润的滤纸盖在伤口处保湿，放人样品袋中，置于30l孢子悬浮液注人伤口内
25℃下保湿培养，每个菌株接种苹果不少于10个8.2.3方法分离病菌，对病菌形态鉴定8.2.5分子生物学鉴定
定期观察接种果实的发病情况，发病后按照前述在形态学鉴定的基础上，辅助采用分于生物学鉴定，检测务析病菌基因组中的ITS基因序列。DNA提取方法、引物序列、PCR扩增及产物测序分析等见附录E。9鉴定特征
9.1症状
苗木症状及果实症状文字描述及图片参见B.1.C.1(1-4)。9.2病菌培养性状
病菌培养性状文字描述和图片参见B.2、C.2(1-2)9.3病菌形态特征
无性态形态特征和有性态形态特征文字描述和图片参见B.3、C.23.6）。KAoNiKAca
SN/T32892012
9.4致病性测定
病菌分离物得到柯赫法则验证，即以苹果果实为接种材料，采用分离物接种10后，苹果果实即出现祸腐、软化并流出褐色汁液等症状「参见附录（、I（)」、从病部得到的分肉物培养特征、形态特征与供试接种菌株一致，
9.5T'TS序列扩增和分析
经1%琼脂糖凝胶电泳分析.PCR扩增产物的片断大小大540hp。序列定后与Genbunks中已知的苹果果病菊标准菌株（AmericanTypeCultureCollectiun[ATCC]No.38578)ITS序列（登录号A13302254)进行BLAST比对分析，间源性为100%，10结果判定
以病！症状、病菌分离物的培养性状及形态学鉴定为主要判断特征，致病性测定和ITS序列分析作为辅助判定特征，符合下列任种情况均将病菌判定为苹果果腐病菌（Dicportheper\niciuso）：如果病部有明显的病状和病征，其症状特点与病菌形态学特征与鉴定特征：9.1-~9.3吻合，护增得到的 ITS序列与 9. 5 相符。如果病部有病状似无病征，经保泥培养和(或)分离培养所产生病菊的培养性状.形态学特征[
与鉴定特征 9. 1~5. 3吻合·致病性测定结果符合 9. 4.扩增得到的 1TS基因与 9. 5相符。11样品和资料的保存
11, 1.菌种和[>NA 样品的保藏
苹果果腐病菌纯分离物要标注菌株来源，寄主、分离时间、鉴定人；菌株在含30%甘油的冻存管中于一80℃保存或将菌株转接在PDA 斜而上培养待菌丝体长满斜面后，置于 4℃下保存，并定期（18Cd)转管。病菌基因组DNA样品于一20℃下保存11.2检验资料的保存
妥普保存检验资料以备复验、谈判和仲裁。检验报告应注明检验日期、方法、结果等.并有检验人签名：检验图片包括症状,病菌、电泳等。KAoNiKAca
A.1苹果果腐病菌的分类地位
（资料性附录）
苹果果腐病菌的分类，分布和寄主英文名：pathogenoffruitrotorlappleSN/T3289—2012
有性型：Diuporthe pernictosaMarchal&.E.J.Marchal1921.属于真菌界（Fungi)，子牵菌业门（Ascomycota），壳菌纲（Sordariotnycelex），间座壳（Diaporthales），间座壳科（Diaporthaceae）间座壳属(Dia porthe)
性型Phomapsisprumnrum（Cookc)Grove1917（异名：PhumopsismuliRobe，s.1921）.属于真菌界（Fungi），半知菌亚门（Dcuteromycotina），（Coelomycetes），球壳孢日（Sphacropsidale），球壳孢科（Sphaerapsidareae），拟茎点属（Phnmupsis)苹果果腐病英文名：Phmopis cankcr,Phnmopsis fruil dccayA,2 分布范围
亚洲：日本、韩国。
欧洲：保加利亚、塞浦路斯、英国、希腊。大洋洲：新西兰
关洲：加拿大，美国，巴西。
A.3寄主范园
可侵染1个科7个属的植物植株及果实。猕猴桃科（Actinidiaceae）：猕猴桃属（Acttnidiaspp.）科(Ebenaceae)柿属（Diospyrosspp.）：蒿薇科（Rosaceae）：槛属（Cydoniaspp.），苹果属（Malusspp.），李属（Prunusspp.）；梨属(Pyrus spp.);
葡萄科（Vitaceae）：葡萄属（Vitisspp.），5
TTKAoNiKAca
SN/T3289—2012
B.1症状
附录B
（资料性附录）
苹果果腐病症状、病菌培养性状与形态特征B.1.1苗木（枝条、枝干）症状
一年生的枝条最感病，小枝形成层变色区域的树皮表面出现突起的坏死组织，很少或没有树胶分泌，面竭变，褐变范围有几厘米，可至坏妮组织以外，以突起的死组织为中心向四周迅速扩展，产生狭长，凹陷的溃疡病斑，严重时引起小枝环割，导致枝条上部叶片黄化生长不良。有时大枝基至主千也受侵染，树皮病斑下陷，黑色，开裂，边缘不平整，最终形成粗皮后期树皮病部形成黑色颗粒状分生孢子器及黑色子囊壳，子囊壳的长喙突破病部皮层而外露呈毛发状，潮湿时溢出奶油色的分生孢子角B.1.2果实症状www.bzxz.net
侵染初期果实较硬，发病果实病部较软，果皮褐色。在果柄凹处常见多汁的渗出物、白色菌丝体和黑色颗粒状分生孢子器。开病果，可见果肉组织呈水浸状，软腐，颜色为浅褐色。发病后期，病果颜色呈黑褐色，病果剖面可见灰白色菌丝体B.2
病菌培养性状
分离物菌落在25C24h黑暗下PDA平板上的平均生长速率为4.5mm/d.菌落白色，菌丝致密，从平板背面观察，菌落背面无鱼。14后，菌落上形成黑色圆形的子座，转至20C24h荧光条件下培养，10d左右产生淡橘红色的生拖子角，在以上培养条件下病菌只产生无性态，而不产生有性态B.3
病菌形态特征
B.3.1无性态形态特征
子座黑色、圆形，直径1mm～2mm，最大可达5mm.分牛子器埋生在子座内，褐色至暗褐色，球形、烧瓶形或扁球状。分生孢子器产生两种类型的分生孢子，型分生孢子长卵圆形，五色，单胞，含多个油球：β型分生孢子丝状，无色，单胞，无油球，一端弯曲。α型β型分生孢子的大小分别为（7um～9.5μm)X(2.2μm~3.8μm),(20μm--34μm)X(1.1μm~1.5μm)(Marchal&.E.J.Marchal1921描述）(6.5μm~9.3μm）×(2.1μm~3.0μm)(26.1μm~33.0μm）)×(1.1μm~1.8μm）(DiaportheperniciosaATCCNo.38578菌株在20℃、24h荧光条件下培养）B.3.2有性态形态特征
子囊壳黑色，球形，埋生在子座中，具长而突出的像。子囊无柄、长棍棒状，壁薄易消溶，内含8个子囊孢子排列成斜两列。子囊孢子椭圆形，无色双细胞·分隔处稍缢缩。Marchal&E.J.Marchal1921描述的子囊、子囊孢子大小分别为（50um~64um）×（5μm~5.7μm）、（11.5μm14μm）×（3.2μm~4.2μm）。在8.2.3培养条件下.病菌不产生子囊壳。6
KAONiKAca
说明：
附录C
（资料性附录）
苹果果腐病症状、病原培养性状及形态特征图初期的褐变病枝及病枝剖面（引自http：//plant-elinic.bpp.oregonstate，edu/content）：后期的坏死凹陷，溃疡病枝（引自http：/égro.basf，it/it/dingnostie）：病果剖面初期呈现褐色腐烂状；病果面后期呈现黑褐色腐烂状
SN/T3289-—2012
病果剖面后期可见灰白色菌丝体（3-5引白fomesa.eomCalidadFactoresF03_11_1_08.htm）经伤口接种导致苹果褐腾（左：对照果，右：发病果，接种菌株：ATCCNo.38578）图C.1苹果果腐病菌的症状图
SN/T3289—2012
说明：
菌落上形成分生孢子座和分生孢于角：型长卵圆形分生孢子：
3型丝状分生孢子；
子囊壳”子囊”子囊孢子”
病枝上形成的子囊壳及其溢出的子囊孢子。注：1~4引自：DiaportheperniciosaATCCNo.38578菌棕在20、24h荧光条件下培养：5引自：http：//agro.basf.it/it/diagnostic/+6引自.http://dic,academic.u/dic.nsf/enciology/1976/图C.2苹果果腐病菌的培养性状和形态特征图,1
附录D
（资料性附录）
马铃萼葡萄糖琼脂培养基PDA的配制每升培养基中马铃薯、葡萄糖、琼脂的含量马铃薯
制方法
SN/T 32892012
称取洗净去皮的马铃薯200g-切成小块·加水煮沸301min，用四层纱布过滤，滤液加人葡萄糖20g、琼脂18名，继续加热搅拌混勺.稍冷知店定睿车1000ml、分装三角瓶，加塞、包扎，121高压灭菌20min.
SN/T3289—2012
E.1DNA提取—
-CTAB提取法
附录E
（规范性附录）
ITS序列测定
病菌在PDA，25℃黑暗条件下培养7d，从其菌落边缘挑取新鲜菌丝20mg或直接刮取病部的菌丝体及/或子实体，加人5702%
30min，加人600μl酚三氯甲烷液（酚三氟甲烧：异找醇25：24：12
DS溶液，充分研磨，65℃水浴
大力振荡至均一状态：11000g
常温离心5min，取上清液后再加人等体程酚三氟甲烷液进行抽提，，取上清液，加人十分之一体积3mol/L醋酸钠溶液和2倍体积无水min.11000g4C离心10min，
期国批室温静量20
弃上清液，沿离心管壁加入1mL70%乙醇溶液，上不颜倒数次，11e00g4℃离心5min，充上清液，加人40μTris-EDTA缓冲液溶解DNA沉淀，置于一20备用。也可用商品化的适合真菌基因组DNA提取试剂盒提取菌丝DNA。
E.2PCR引物
ITS4:5-TCCTCCGCTTATTGATATGO
E.3POR扩增及PCR产物检测分析
PCR反应总体积50μL，ddH0
GAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3
L.10PCR缓液（含MgCl2)5μl.dNTP(2.5mmol/LTaqDNA聚合酶(SU/μLo.25μlDNA模板1μL。each）4L，上下游引物（1oμmol/1各23min94℃变性45s.60℃退火45s.72℃延伸1min，30个循环：最PCR反应程序：94℃预变性3
后72℃延伸10min。
PCR产物在0.5XTBE电泳缓液中，1%晾脂糖灌胶电脉及凝胶成像分析。PCR产物纯化后测序，BLAST比对分析。
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苹果果腐病菌检疫鉴定方法
Detection and identification of Diaporthe perniciosa Marchai & E. J. Marchal2012-10-23发布
中华人民共和国
国家质量警检验检疫总局
2013-05-01实施
本标准按照GB/T 1,1--2009 给出的规则越草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3289--2012
本标准起草单位：中华人民其和国广东出人境检验检疫尚、中华人民共和国嘉兴出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国烟台出人境检验检疫局。本标准主要起草人：于卫芳、胡佳、张建成、程颖慧、栾晶。1范围
苹果果腐病菌检疫鉴定方法
SN/T 3289—2012
本标准规定『苹果果腐病菌（DiaporthepernicioxaMarchal&E.J.Marchal)的检疫鉴定方法。本标准适用丁相关寄主苗木和新鲜果实的苹果果腐病菌的检疫鉴定。2规范性引用文件
下列文件对丁本文件的成用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注口期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修收单)适用丁本文件，SN/T 1538.1培养基制备指南第1部分;实验室培养基制备质量保证通则SV/T2077进山境苹果检疫规程
3术语和定义
下列术语和定义适用丁本文件
子实体fruiting body
尤性繁殖或有性繁殖、结构简单的或复杂的真菌产疱结构.统称为子实体。3.2
子座stroma
出真菌组织形成的、可产生子等繁殖器官的垫状或头状组织。3.3
子龚壳perithecia
子變菌亚门真蘭形成的一种产尘了襄孢子、包被有固定的孔口的子实体（十囊果），3.4
分生抱子器Pycnidia
半知菌球壳孢目真菌形成的一种了实体，与子囊菌的子粪壳相似，球形或瓶形、但产生分牛孢子。3.5
a型、β型分生孢子alphaennidia，hctaconidia拟落点需属（Phomopsissp.)分生孢子器中产生的两种类型分生孢了，α型分生孢子为卵圆形至纺锤形，能萌发，3型分生孢了为线型，不能明发，3.6
分生孢子角
cirrus
从成熟分生拖了器中涌出的大量分牛孢子，呈黏稠状堆集。4检疫鉴定原理
节果果腐病菌分类、分布放寄主鑫见附录A。其既能在果园为害枝条枝十，又能为害采后果实，引SN/T3289—2012
起运期果实腐烂。在田间，该病6，7月份开始发生，通常在小枝上尤其是树冠下部的小枝上开始发病。
本标准以寄主上的症状特点、病菌形态学特征、培养特性（参见附录B和附录C)作为苹果果腐病菌的主要检疫鉴定依据，致病性测定及病菌ITS序列分析结果作为草果果腐病菌的辅助检疫鉴定依据。5设备及用具
5.1仪器设备
体视显微镜、生物显微镜、电子天平（感量0.01g）、高压灭菌器、超净工作台、生物培养箱（带黑光灯）高速离心机、PCR仪、凝胶成像系统5.2实验用具
标签、定性滤纸、样品袋、保鲜袋、手持放大镜、锻子、解韵刀、酒精灯、接种针、培养皿、烧杯、量筒、三角瓶、载玻片、盖玻片、微量移液器（可调式范围：2.5L~1000mL）。6试剂和培养基
6.1试剂
1%NaOCI溶液、无水乙醇70%乙醇、无菌双热水，2%CTAB提取缓冲液，10%SDS溶液、3mol/LTee）苯酚、三氯甲烷、异戊醇、Tris-HCI.EDTA、琼醋酸钠溶液，PCR试剂（包括Taq聚合酶、dNTP，buff脂糖、DNA相对分子质量标准，TBE电泳缓冲液6.2培养基
马铃薯葡葡糖琼脂培养基PDA（参见附录D）配制培养基时按照SN/T1538.1的要求。7抽样
口岸现场查验时，按照SN工2077进行抽样与取样8检疫鉴定方法
8.1现场查验
8.1:1苗木检验
重点查验枝条和枝干，从树冠下部开始·逐渐向树冠上部观察。观察枝条表面是否有突起的坏死组织，枝干，主干上是否有凹陷的溃疡或者环割和坏死病斑，坏死组织剖面是否褐变，树皮坏死部位是否有树胶分泌，叶片是否变黄，或部分萎為。8.1.2果实检验
仔细检查果实的果柄基部、萼部、果面是否腐烂，腐烂组织是否有汁液流出，病部是否有病菌的子实体。
标注品名、数量、生产国及取样地点、取样人和取样日期等样品信息，将可疑苗木和果实样品带回实2
KAoNIKAca
验室作进一步检验。
8.2实验室检验
8.2.1直接镜检
SN/T3289—2012
如果病枝或病果有明显病征，直接进行显微镜检查，在体视显微镜下挑取病部子实体制成玻片，置于生物显微镜下镜检，观察记录分生孢子座、分生孢子器、分生孢子及子囊壳、子囊，子囊孢子的形态特征，进行显微计测，同时分离病原菌8.2.2保湿培养
如病枝或病果上只有可疑病状而无明显病征，则将病枝（裁成5cm）或病果置于样品袋中，于20℃～25℃下保湿培养，每天观察症状的变化，并分离病原菌8.2.3分离培养
直接挑取病部的子实体或孢于，或切取病健交界的数块组织（大小约5mm×5mm），用1%NaOCl进行表面消毒3min，无菌水冲洗3次，置于PDA平板上于25℃24h黑暗培养14d，然后转到20℃24h荧光条件下培养10d，观察记录菌落的培养性状和形态学特征，包括菌落的形态、颜色、大小及子实体、分生孢子的形态和大小，疑似菌株转到PDA平板上纯化二次，保存备用。8.2.4致病性测定
将纯分离物作为供试菌株，水品富士苹果鲜果为供试材料，接种方法为伤口接种。供试菌株在PDA平板上，于25℃、24h黑暗下培养14d，然后转到2024b荧光条件下培养10d，挑取菌落上的，并将施子终浓度调整为
分生孢子角，用无菌水配制成孢子影浮液
用70%乙醇涂抹供试苹果
表面毒
X10*/mL
用无菌刀片在果身切出宽1cm左右的浅伤痕，将无菌水做对照将无菌湿润的滤纸盖在伤口处保湿，放人样品袋中，置于30l孢子悬浮液注人伤口内
25℃下保湿培养，每个菌株接种苹果不少于10个8.2.3方法分离病菌，对病菌形态鉴定8.2.5分子生物学鉴定
定期观察接种果实的发病情况，发病后按照前述在形态学鉴定的基础上，辅助采用分于生物学鉴定，检测务析病菌基因组中的ITS基因序列。DNA提取方法、引物序列、PCR扩增及产物测序分析等见附录E。9鉴定特征
9.1症状
苗木症状及果实症状文字描述及图片参见B.1.C.1(1-4)。9.2病菌培养性状
病菌培养性状文字描述和图片参见B.2、C.2(1-2)9.3病菌形态特征
无性态形态特征和有性态形态特征文字描述和图片参见B.3、C.23.6）。KAoNiKAca
SN/T32892012
9.4致病性测定
病菌分离物得到柯赫法则验证，即以苹果果实为接种材料，采用分离物接种10后，苹果果实即出现祸腐、软化并流出褐色汁液等症状「参见附录（、I（)」、从病部得到的分肉物培养特征、形态特征与供试接种菌株一致，
9.5T'TS序列扩增和分析
经1%琼脂糖凝胶电泳分析.PCR扩增产物的片断大小大540hp。序列定后与Genbunks中已知的苹果果病菊标准菌株（AmericanTypeCultureCollectiun[ATCC]No.38578)ITS序列（登录号A13302254)进行BLAST比对分析，间源性为100%，10结果判定
以病！症状、病菌分离物的培养性状及形态学鉴定为主要判断特征，致病性测定和ITS序列分析作为辅助判定特征，符合下列任种情况均将病菌判定为苹果果腐病菌（Dicportheper\niciuso）：如果病部有明显的病状和病征，其症状特点与病菌形态学特征与鉴定特征：9.1-~9.3吻合，护增得到的 ITS序列与 9. 5 相符。如果病部有病状似无病征，经保泥培养和(或)分离培养所产生病菊的培养性状.形态学特征[
与鉴定特征 9. 1~5. 3吻合·致病性测定结果符合 9. 4.扩增得到的 1TS基因与 9. 5相符。11样品和资料的保存
11, 1.菌种和[>NA 样品的保藏
苹果果腐病菌纯分离物要标注菌株来源，寄主、分离时间、鉴定人；菌株在含30%甘油的冻存管中于一80℃保存或将菌株转接在PDA 斜而上培养待菌丝体长满斜面后，置于 4℃下保存，并定期（18Cd)转管。病菌基因组DNA样品于一20℃下保存11.2检验资料的保存
妥普保存检验资料以备复验、谈判和仲裁。检验报告应注明检验日期、方法、结果等.并有检验人签名：检验图片包括症状,病菌、电泳等。KAoNiKAca
A.1苹果果腐病菌的分类地位
（资料性附录）
苹果果腐病菌的分类，分布和寄主英文名：pathogenoffruitrotorlappleSN/T3289—2012
有性型：Diuporthe pernictosaMarchal&.E.J.Marchal1921.属于真菌界（Fungi)，子牵菌业门（Ascomycota），壳菌纲（Sordariotnycelex），间座壳（Diaporthales），间座壳科（Diaporthaceae）间座壳属(Dia porthe)
性型Phomapsisprumnrum（Cookc)Grove1917（异名：PhumopsismuliRobe，s.1921）.属于真菌界（Fungi），半知菌亚门（Dcuteromycotina），（Coelomycetes），球壳孢日（Sphacropsidale），球壳孢科（Sphaerapsidareae），拟茎点属（Phnmupsis)苹果果腐病英文名：Phmopis cankcr,Phnmopsis fruil dccayA,2 分布范围
亚洲：日本、韩国。
欧洲：保加利亚、塞浦路斯、英国、希腊。大洋洲：新西兰
关洲：加拿大，美国，巴西。
A.3寄主范园
可侵染1个科7个属的植物植株及果实。猕猴桃科（Actinidiaceae）：猕猴桃属（Acttnidiaspp.）科(Ebenaceae)柿属（Diospyrosspp.）：蒿薇科（Rosaceae）：槛属（Cydoniaspp.），苹果属（Malusspp.），李属（Prunusspp.）；梨属(Pyrus spp.);
葡萄科（Vitaceae）：葡萄属（Vitisspp.），5
TTKAoNiKAca
SN/T3289—2012
B.1症状
附录B
（资料性附录）
苹果果腐病症状、病菌培养性状与形态特征B.1.1苗木（枝条、枝干）症状
一年生的枝条最感病，小枝形成层变色区域的树皮表面出现突起的坏死组织，很少或没有树胶分泌，面竭变，褐变范围有几厘米，可至坏妮组织以外，以突起的死组织为中心向四周迅速扩展，产生狭长，凹陷的溃疡病斑，严重时引起小枝环割，导致枝条上部叶片黄化生长不良。有时大枝基至主千也受侵染，树皮病斑下陷，黑色，开裂，边缘不平整，最终形成粗皮后期树皮病部形成黑色颗粒状分生孢子器及黑色子囊壳，子囊壳的长喙突破病部皮层而外露呈毛发状，潮湿时溢出奶油色的分生孢子角B.1.2果实症状www.bzxz.net
侵染初期果实较硬，发病果实病部较软，果皮褐色。在果柄凹处常见多汁的渗出物、白色菌丝体和黑色颗粒状分生孢子器。开病果，可见果肉组织呈水浸状，软腐，颜色为浅褐色。发病后期，病果颜色呈黑褐色，病果剖面可见灰白色菌丝体B.2
病菌培养性状
分离物菌落在25C24h黑暗下PDA平板上的平均生长速率为4.5mm/d.菌落白色，菌丝致密，从平板背面观察，菌落背面无鱼。14后，菌落上形成黑色圆形的子座，转至20C24h荧光条件下培养，10d左右产生淡橘红色的生拖子角，在以上培养条件下病菌只产生无性态，而不产生有性态B.3
病菌形态特征
B.3.1无性态形态特征
子座黑色、圆形，直径1mm～2mm，最大可达5mm.分牛子器埋生在子座内，褐色至暗褐色，球形、烧瓶形或扁球状。分生孢子器产生两种类型的分生孢子，型分生孢子长卵圆形，五色，单胞，含多个油球：β型分生孢子丝状，无色，单胞，无油球，一端弯曲。α型β型分生孢子的大小分别为（7um～9.5μm)X(2.2μm~3.8μm),(20μm--34μm)X(1.1μm~1.5μm)(Marchal&.E.J.Marchal1921描述）(6.5μm~9.3μm）×(2.1μm~3.0μm)(26.1μm~33.0μm）)×(1.1μm~1.8μm）(DiaportheperniciosaATCCNo.38578菌株在20℃、24h荧光条件下培养）B.3.2有性态形态特征
子囊壳黑色，球形，埋生在子座中，具长而突出的像。子囊无柄、长棍棒状，壁薄易消溶，内含8个子囊孢子排列成斜两列。子囊孢子椭圆形，无色双细胞·分隔处稍缢缩。Marchal&E.J.Marchal1921描述的子囊、子囊孢子大小分别为（50um~64um）×（5μm~5.7μm）、（11.5μm14μm）×（3.2μm~4.2μm）。在8.2.3培养条件下.病菌不产生子囊壳。6
KAONiKAca
说明：
附录C
（资料性附录）
苹果果腐病症状、病原培养性状及形态特征图初期的褐变病枝及病枝剖面（引自http：//plant-elinic.bpp.oregonstate，edu/content）：后期的坏死凹陷，溃疡病枝（引自http：/égro.basf，it/it/dingnostie）：病果剖面初期呈现褐色腐烂状；病果面后期呈现黑褐色腐烂状
SN/T3289-—2012
病果剖面后期可见灰白色菌丝体（3-5引白fomesa.eomCalidadFactoresF03_11_1_08.htm）经伤口接种导致苹果褐腾（左：对照果，右：发病果，接种菌株：ATCCNo.38578）图C.1苹果果腐病菌的症状图
SN/T3289—2012
说明：
菌落上形成分生孢子座和分生孢于角：型长卵圆形分生孢子：
3型丝状分生孢子；
子囊壳”子囊”子囊孢子”
病枝上形成的子囊壳及其溢出的子囊孢子。注：1~4引自：DiaportheperniciosaATCCNo.38578菌棕在20、24h荧光条件下培养：5引自：http：//agro.basf.it/it/diagnostic/+6引自.http://dic,academic.u/dic.nsf/enciology/1976/图C.2苹果果腐病菌的培养性状和形态特征图,1
附录D
（资料性附录）
马铃萼葡萄糖琼脂培养基PDA的配制每升培养基中马铃薯、葡萄糖、琼脂的含量马铃薯
制方法
SN/T 32892012
称取洗净去皮的马铃薯200g-切成小块·加水煮沸301min，用四层纱布过滤，滤液加人葡萄糖20g、琼脂18名，继续加热搅拌混勺.稍冷知店定睿车1000ml、分装三角瓶，加塞、包扎，121高压灭菌20min.
SN/T3289—2012
E.1DNA提取—
-CTAB提取法
附录E
（规范性附录）
ITS序列测定
病菌在PDA，25℃黑暗条件下培养7d，从其菌落边缘挑取新鲜菌丝20mg或直接刮取病部的菌丝体及/或子实体，加人5702%
30min，加人600μl酚三氯甲烷液（酚三氟甲烧：异找醇25：24：12
DS溶液，充分研磨，65℃水浴
大力振荡至均一状态：11000g
常温离心5min，取上清液后再加人等体程酚三氟甲烷液进行抽提，，取上清液，加人十分之一体积3mol/L醋酸钠溶液和2倍体积无水min.11000g4C离心10min，
期国批室温静量20
弃上清液，沿离心管壁加入1mL70%乙醇溶液，上不颜倒数次，11e00g4℃离心5min，充上清液，加人40μTris-EDTA缓冲液溶解DNA沉淀，置于一20备用。也可用商品化的适合真菌基因组DNA提取试剂盒提取菌丝DNA。
E.2PCR引物
ITS4:5-TCCTCCGCTTATTGATATGO
E.3POR扩增及PCR产物检测分析
PCR反应总体积50μL，ddH0
GAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3
L.10PCR缓液（含MgCl2)5μl.dNTP(2.5mmol/LTaqDNA聚合酶(SU/μLo.25μlDNA模板1μL。each）4L，上下游引物（1oμmol/1各23min94℃变性45s.60℃退火45s.72℃延伸1min，30个循环：最PCR反应程序：94℃预变性3
后72℃延伸10min。
PCR产物在0.5XTBE电泳缓液中，1%晾脂糖灌胶电脉及凝胶成像分析。PCR产物纯化后测序，BLAST比对分析。
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