SN/T 3391-2012
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标准简介
SN/T 3391-2012.Codes of examination of Babesia at frontier port.
1范围
SN/T 3391规定了国境口岸巴贝西原虫检验对象、方法、结果报告、生物安全要求及结果判定。
SN/T 3391适用于国境口岸人、蜱、宿主动物感染巴贝西原虫的检验。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB19489实验室生物安全通用要求
SN/T1312国境口岸森林脑炎监测规程
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1巴贝西原虫Babesia parasites
是一种隶属巴贝西属、寄生于血液红细胞中的原生动物，可由蜱或输血传播,引起人和动物巴贝西原虫病。
4实验室生物安全防护
检测样本的采集和处理应符合无菌操作原则，进行标本检测的实验室应符合GB 19489中生物安全二级实验室要求。
5对象
5.1疑似感染巴贝西原虫的入出境人员、口岸边境人群的血液样本和其他组织样本。
5.2蜱及宿主动物标本。
6试剂及器材
试剂及器材参见附录A,或购买符合要求的商品化试剂盒。
7标本的采集和处理
参照附录B的方法进行
1范围
SN/T 3391规定了国境口岸巴贝西原虫检验对象、方法、结果报告、生物安全要求及结果判定。
SN/T 3391适用于国境口岸人、蜱、宿主动物感染巴贝西原虫的检验。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB19489实验室生物安全通用要求
SN/T1312国境口岸森林脑炎监测规程
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1巴贝西原虫Babesia parasites
是一种隶属巴贝西属、寄生于血液红细胞中的原生动物，可由蜱或输血传播,引起人和动物巴贝西原虫病。
4实验室生物安全防护
检测样本的采集和处理应符合无菌操作原则，进行标本检测的实验室应符合GB 19489中生物安全二级实验室要求。
5对象
5.1疑似感染巴贝西原虫的入出境人员、口岸边境人群的血液样本和其他组织样本。
5.2蜱及宿主动物标本。
6试剂及器材
试剂及器材参见附录A,或购买符合要求的商品化试剂盒。
7标本的采集和处理
参照附录B的方法进行
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3391—2012
国境口岸巴贝西原虫检验规程
Codes of examination of Babesia at frontier port2012-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-07-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草SN/T3391—2012
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、军事医学科学院微生物流行病研究所。
本标准主要起草人：付维明、瀚文东、孙毅、杨德文、徐宁、包力、程成、王艳梅、丁淑丽。1
1范围
国境口岸巴贝西原虫检验规程
SN/T3391—2012
本标准规定了国境口岸巴贝西原虫检验对象、方法、结果报告、生物安全要求及结果判定。本标准适用于国境口岸人、蜱、宿主动物感染巴贝西原虫的检验。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少！儿是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1312国境口岸森林脑炎监测规程3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
巴贝西原虫Babesiaparasites
是一种隶属巴贝西属、寄生于血液红细胞中的原生动物，可由蜱或输血传播，引起人和动物巴贝西原虫病。
实验室生物安全防护
检测样本的采集和处理应符合无菌操作原则，进行标本检测的实验室应符合GB19489中生物安全二级实验室要求。
5对象
疑似感染巴贝西原虫的人出境人员、口岸边境人群的血液样本和其他组织样本。5.1
蜱及宿主动物标本。
试剂及器材
试剂及器材参见附录A，或购买符合要求的商品化试剂盒。7标本的采集和处理
参照附录B的方法进行。
SN/T3391—2012
8实验室检验方法
8.1形态学检验
8.1.1将染色的玻片置于低倍显微镜载物台十，对准焦距。在涂片1红细胞分散均勾的部分，滴加镜油一滴，在油镜下耐心仔细按顺序观察。8.1.2红细胞被染成红褐色，巴贝西原虫细胞质被染成蓝色，细胞核染成深蓝色，但并非任何一个蓝点或蓝环即为巴贝西原虫，因为可能有染液沉渣及其他异物混淆，区别异物的主要依据是掌握显微镜的细调节器，通过它的上下移动，若蓝点或蓝环与红细胞在同一平面，而且具有定的轮廊结构是巴贝西原虫，反之则为异物。
8.1.3当确定为巴贝西原虫后，进一步辨认它为红细胞内期的某个发育阶段，在薄血片中尚可找到其他白细胞或血小板。
8.1.4对于几种常见白细胞的形态应加以区别，以免混淆：环状体：被寄生的红细胞尚无改变，原虫形似宝石戒指。核呈深蓝色点状。细胞质为蓝色环状，其大小不等，约占红细胞的直径八分之一至四分之一左右。二分体：主要特征是细胞质有伪足伸展，并形成空泡，细胞核显著增大，呈典型对称的配对排列。
四联体：细胞质开始变为致密，失去空泡及伪足，呈规则的四联排列。8.2血清学检验
参照附录C规定的方法进行，使用符合条件商品化试剂。8.3聚合酶链反应(PCR)检验
参照附录D规定的方法进行。
8.4离体培养鉴定
按照附录E规定的方法进行。
9结果判定
9.1形态学检验
9.1.1而涂片中观察到典型的环形体或四联体，报告“观察到巴贝西原虫”。9.1.2血涂片中未观察到典型的环形体或四联休，报告“米检出巴贝西原虫”。9.2
血清学检验
血清学检验阳性，报告“巴贝西原虫抗体（或抗原)阳性”。血清学检验阴性，报告“巴贝西原虫抗体（或抗原）阴性”。9.2.2
9.3聚合酶链反应(PCR)检验
PCR检验阳性，报告“巴贝西原虫核酸检验阳性”。9.3.1
PCR检验阴性.报告“巴贝西原虫核酸检验阴性”。-iiKAoNiKAca
离体培养鉴定
9.4.1标本中培养出巴贝西原虫，报告“细胞培养检出巴贝西原虫”9.4.2
言传三代未见可疑巴贝西原虫，报告“细胞培养三代，未检出巴贝西原虫”。阳性结果处置
离体培养阳性结果应出具阳性报告单。离体培养阳性结果应向上级主管部门报告。10.2
SN/T3391-2012
-iKAoNiKAca
SN/T3391—2012
A.1主要试剂
姬姆萨（Gimsa）染液
姬姆萨染料
附录A
（资料性附录）
巴贝西原虫检验主要试剂及器材08g
将0.8g染料加到50mL甘油中，混勾，置602h，不时搅拌。取出凉至与室温相同时加入甲醇50mL，用磁力搅拌过夜。用滤纸过滤，滤液即为原液。应用时用PBS(1/15mol/L，pH6.4～6.8)或蒸馏水稀释十倍。
培养基的主要成分及制备方法
PRMI-1640培养液
RPMI1640溶液
RPMI1640
高纯水或去离子水
1mol/LHEPES缓冲液
高纯水或去离子水
1800mL
注：HEPES,N-2-hydroxyethylpiperagi238.2。
N\-2-cthanesullericacid为N2羟之基哌嗪-N'-2-乙磺酸，相对分子质量（3)将（1)和(2)分别溶解后混合在起，补充二蒸水至1920mL，Www.bzxZ.net
混合后用0.22um或更小孔径
的微孔滤膜过滤除菌。分装100mL/瓶，4℃保存A.1.2.2
其他组分
200mmol/LL-谷氨酰胺溶液
L-谷氨酰胺
高纯水
溶解后过滤除菌，分装10mL./瓶，一20℃保存。抗生素配制（1万单位/mL）
青霉素
链霉素
无菌高纯水
1000000U
1000000μg
溶解后无菌操作分装1mL/瓶，一20℃保存。两性霉素B配制（25g/mL)
两性素B
高纯水
rrKAoNiKAca
过滤除菌，分装1mL瓶，一20℃保存。A.1.2.3RPMI1640完全培养基
RPMI1640培养液
L-谷氨酰胺（200mmol/L）
抗生素（青、链霉素）
两性霉素B(25μg/L）
7.5%NaHCO
灭活小牛血清
过滤除菌，分装1mL/瓶，一20℃保存A：1.2.4阿氏（Alsever）血液保存液葡萄糖
柠檬酸钠·5H,0
柠檬酸·H,O
氯化钠
加蒸馏水至100mL，溶解后过滤，分装，115体积分数1/1~1/2
A.1.2.5原虫冻存液（水溶剂，以下为体积分数）甘油
山梨醇
氯化钠
A.1.2.6原虫复苏液（水溶剂，以下为体积分数山梨醇
氯化钠
A,1.3PCR试剂
SN/T3391—2012
灭菌10min，4℃保存。血液与阿氏液混合比例为A.1.3.1TRIS-HCI(pH8.8):187g/LTRIS(三羟甲基氨基甲烷），浓盐酸（HCI)调整pH值。A.1.3.2TE缓冲液：10mmol/LTRIS-HC(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)。A.1.3.310×PCR缓冲液：500mmol/L氯化钾（KCI），40mmol/L氯化镁（MgClg），100mmol/LTRIS-HCI,pH 8.5。
A.1.3.4电泳缓冲液：242gTris碱.57.1ml.冰乙酸，100mL0.5mol/LEDTA（pH8.0），加蒸馏水至1000mL，使用时十倍稀释。
A.1.3.520×SSC缓冲液：在800mL蒸馏水中溶解175.3g氯化钠（NaCI)和88.2g柠檬酸钠，加人数滴10mol/L氢氧化钠（NaOH)溶液调节pH值至7.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌。A.1.3.6琼脂糖：电泳级。
A.2器材
A.2.1离体培养器材
24孔细胞培养板：滤膜滤器；旋涡振荡器：离心机；暗视野光学显微镜：解剖显微镜：全排式生物安5
-TTKAONTKACE
SN/T3391—2012
全柜：CO恒温培养箱：0.22μm除菌滤膜：高压蒸汽灭菌器：玻璃吸管（2ml.、5mL）、量筒（50ml、200mL）、三角烧瓶（200mL、100ml）；电子天平（精确到0.001g）；普通冰箱。A.2.2
PCR器材
离心机；PCR仪，电泳仪；可调移液器：1mL10μL、2μL~20uL、20μL~200μ、100mL~1000L；凝胶成像仪。
TYKAONKAca
疑似感染者标本的采集
附录B
（资料性附录）
标本的采集和处理
SN/T3391—2012
疑似感染者的血液（末梢血、静脉血、骨髓）、其他组织的印片可进行病原学检测，常规采样后立B.1.1
即送检。
2无菌方法采集血液，EDTA抗凝后无菌试管4C保存，立即送检B.1.2
3用未抗凝的真空管采集患者急性期（发病三天内）、第三周、第六周血清，用于血清学检测、B.1.3
B.2疑似感染者标本的处理
制作血涂片
B.2.1.1血液标本取1uL～3uL，置于一张洁净载玻片（甲片）的一端，涂片时用左手在拇指及食指持握该片的两端。
B.2.1.2另取一张载玻片作推片（乙片）：将其一端接触甲片血滴使血滴沿推片向两侧展开，两片之间保持45°的夹角。
B.2.1.3将乙片紧靠甲片，沿着甲片的表面轻而迅速地向前推动，直到甲片的另一端为止。推片时注意保持一定的速度和两片间的角度，切忌过分用力或中间停顿，否则将使血球破碎或涂布不勾。质量好的薄血膜应呈舌形，血细胞分布均匀。B.2.1.4将制好的血片置于空气中干燥，用甲醇一到两滴置于血片上，均勾散开，固定血膜，干透后再染色。
B.2.2血涂片染色方法
血涂片染色采用国际通用的Gimsa染液进行（1：10）稀释后（现稀释现用），染色30min，清洗，自然风十后观察。
B.2.3用于血清学试验的血液处理采集后的血液以相对离心力300g离心5min，分离出血清。3蜱及宿主动物标本采集
蜱及宿主动物采集，参照SN/T1312进行。宿主动物血液标本，应常规无菌取样，用有盖无菌或不抗凝的真空管采集保存。
蜱及宿主动物标本处理
B.4.1参照B.2.1、B.2.2、B.2.3制作血涂片。B.4.2血液采集后以相对离心力300g离心5min，分离出血清。7
SN/T3391—2012
C.1血清抗原检验
C.1.1原理
附录C
（资料性附录）
巴贝西原虫血清学检验
使用抗Babesia单克隆抗体或多克降抗体，利用阳性抗体血清与抗原的结合，通过间接免疫荧光（IFA)方法，检测病人或宿主动物或蜱中巴贝西原虫。C.1.2操作步骤
C.1.2.1将患者的血液按B.2.1方法制作薄血涂片.风于后，两酮固定15min，晾干备用。将阳性抗体血清10μL～20μL覆盖于薄血片上，37℃湿盒孵育45min。甩去多余血清，用PBSpH7.2洗涤2~3次，风干。
C.1.2.2将FTIC标记的酶标二抗-10pL-~20uL覆盖于满血片上37℃湿盒孵育45min。甩去多
余血清，用PBS(pH7.2）洗涤23次-风干后用荧光显微镜观察。C.1.3结果判断
阴性结果：荧光显微镜观察，红细胞内部或细胞间未见特异性荧光。阳性结果：荧光显微镜观察，红细胞内部或细胞间可见，呈环状体或四联体状特异性绿色较强荧光。C.2血清抗体检验
C.2.1原理
利用抗体血清与阳性抗原的结合，通过间接免疫荧光（IFA）方法.检测病人或宿主动物中巴贝西原虫抗体。
C.2.2操作步骤
C.2.2.1将患者的血液按B.2.3方法制备血清，或直接采血置于紫帽促凝血清分离管中分离血清。C.2.2.2将患者血清10μL～20μL覆盖于阳性抗原片上.37℃湿盒孵育45min。甩去多余血清，用PBS(pH7.2)洗涤2~3次.风十。
C.2.2.3将FTIC标记的酶标二抗.10μl20μL覆盖于阳性抗原片上，37℃湿盒孵育45min。甩去多余血清，用PBS(pH7.2)洗涤2~3次，风干，风干后用荧光显微镜观察。C.2.3结果判断
阴性结果：荧光显微镜观察，未见特异性荧光。阳性结果：荧光显微镜观察，可见特异性荧光呈环状体或四联体，如阳性荧光太强可将患者血清梯度稀释测定其抗体滴度。
D.1扩增引物
附录D
（资料性附录）
巴贝西原虫聚合酶链反应检验
SN/T3391—2012
下列是根据巴贝西原虫基因18SrRNA设计的-对引物，在GenBank中参考序列号为M93660，具有高度特异性，供使用时参考。阳性标本可扩增出154bp的片即外引物
上游引物：5-CTTAGTATAAGCTTTTATACAGC-3下游引物：5-ATAGGTCAGAAAGTTGAATGATACA-3内引物
上游引物：5-GTTATAGTTTATTTGATGTTCGTT下游引物：5'-AAGCCATGCGATTCGCTAAT-3D.2
模板制备
原虫虫株的模板制备
D. 2. 1. 1
待测。
溶于90μLTE缓冲液中。
取原虫虫株感染率超过10%的红细胞10L加人溶菌酶（20g/L)10μl
C水浴30mina
SDS)10L.60℃水浴10
加入10%十二烷基硫酸钠溶液
加人蛋白酶K（10g/L）10μL3
加人RNA酶（10g/L10
加人150L酚、三氯甲烷、
30mina
戊醇混勾液，抽提三次
min（变清为止），室温冷却。
加人冰乙醇，12000r/min离心10min，弃上水相，自然干爆，加入1×SSC100μL，4℃保存临床标本的模板制备
取血2mL5000r/min，5min.弃上清液，加TE缓冲液300uL100℃煮沸30min，室温冷却。
加人RNA酶（10g/L)10μl37℃30min12000r/min离心5min，取上清液10μL用于PCR扩增D.2.3蜱及宿主动物标本的模板制备D.2.3.1蜱标本处理：取蜱一只（幼虫可五到十只为一组），用体积分数为70%的乙醇溶液浸泡5min~10min进行表面消毒，然后用无菌蒸馏水洗涤23次，无菌滤纸吸干水分。研磨器加TE缓冲液研磨至细粉末状，然后按照D.2.1.2至D.2.1.7程序进行。D.2.3.2宿主动物血液标本按D.2.2处理。D.3第一轮扩增
D.3.1取无菌的0.2mLPCR扩增管，设置阴性对照、阳性对照，将样品编号，按照以下加样量加样：9
SN/T3391—2012
10XPCR缓冲液（含氯化镁）
4dNTPs(1.25mmol/L)
上游引物（10μmol/L）
下游引物（10μmol/L）
聚合酶（5U/mL）
超纯水
混勾，6000r/min离心1min，将管内液体甩人管底。设置扩增反应条件：94℃5min；94℃60s，58℃60s，72℃120s.35个循环；最后72℃5min，D.3.3
进行第一轮PCR扩增
第二轮扩增
按照D.3.1体系，把上下游引物改为内引物，将第轮扩增产物作10倍到50倍稀释后作为模板，按D.3.2混勾，设置扩增反应条件：94℃5min：94℃60s55℃60s，72℃1205.35个循环；最后72℃5min.进行第二轮PCR扩增。D.5电泳
取10L扩增产物，加入2L溴酚蓝上样缓冲液，混匀，加样于1.5%琼脂糖凝胶（含0.5μg/ml漠化乙锭）胶孔中，以5V/cn稳定电压电泳30min，用凝胶成像系统观察是否出现目的条带（154bp）。D.6
结果判定
如阴性对照和空白对照末出现条带，阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条带（扩增片段大小为154bp），则可初步判定该样品巴贝西原虫核酸检验阳性，应进一步进行测序验证：如果待测样品中未出现PCR扩增产物，则判断为待测样品巴贝西原虫核酸检验阴性。10
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国境口岸巴贝西原虫检验规程
Codes of examination of Babesia at frontier port2012-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-07-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草SN/T3391—2012
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、军事医学科学院微生物流行病研究所。
本标准主要起草人：付维明、瀚文东、孙毅、杨德文、徐宁、包力、程成、王艳梅、丁淑丽。1
1范围
国境口岸巴贝西原虫检验规程
SN/T3391—2012
本标准规定了国境口岸巴贝西原虫检验对象、方法、结果报告、生物安全要求及结果判定。本标准适用于国境口岸人、蜱、宿主动物感染巴贝西原虫的检验。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少！儿是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1312国境口岸森林脑炎监测规程3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
巴贝西原虫Babesiaparasites
是一种隶属巴贝西属、寄生于血液红细胞中的原生动物，可由蜱或输血传播，引起人和动物巴贝西原虫病。
实验室生物安全防护
检测样本的采集和处理应符合无菌操作原则，进行标本检测的实验室应符合GB19489中生物安全二级实验室要求。
5对象
疑似感染巴贝西原虫的人出境人员、口岸边境人群的血液样本和其他组织样本。5.1
蜱及宿主动物标本。
试剂及器材
试剂及器材参见附录A，或购买符合要求的商品化试剂盒。7标本的采集和处理
参照附录B的方法进行。
SN/T3391—2012
8实验室检验方法
8.1形态学检验
8.1.1将染色的玻片置于低倍显微镜载物台十，对准焦距。在涂片1红细胞分散均勾的部分，滴加镜油一滴，在油镜下耐心仔细按顺序观察。8.1.2红细胞被染成红褐色，巴贝西原虫细胞质被染成蓝色，细胞核染成深蓝色，但并非任何一个蓝点或蓝环即为巴贝西原虫，因为可能有染液沉渣及其他异物混淆，区别异物的主要依据是掌握显微镜的细调节器，通过它的上下移动，若蓝点或蓝环与红细胞在同一平面，而且具有定的轮廊结构是巴贝西原虫，反之则为异物。
8.1.3当确定为巴贝西原虫后，进一步辨认它为红细胞内期的某个发育阶段，在薄血片中尚可找到其他白细胞或血小板。
8.1.4对于几种常见白细胞的形态应加以区别，以免混淆：环状体：被寄生的红细胞尚无改变，原虫形似宝石戒指。核呈深蓝色点状。细胞质为蓝色环状，其大小不等，约占红细胞的直径八分之一至四分之一左右。二分体：主要特征是细胞质有伪足伸展，并形成空泡，细胞核显著增大，呈典型对称的配对排列。
四联体：细胞质开始变为致密，失去空泡及伪足，呈规则的四联排列。8.2血清学检验
参照附录C规定的方法进行，使用符合条件商品化试剂。8.3聚合酶链反应(PCR)检验
参照附录D规定的方法进行。
8.4离体培养鉴定
按照附录E规定的方法进行。
9结果判定
9.1形态学检验
9.1.1而涂片中观察到典型的环形体或四联体，报告“观察到巴贝西原虫”。9.1.2血涂片中未观察到典型的环形体或四联休，报告“米检出巴贝西原虫”。9.2
血清学检验
血清学检验阳性，报告“巴贝西原虫抗体（或抗原)阳性”。血清学检验阴性，报告“巴贝西原虫抗体（或抗原）阴性”。9.2.2
9.3聚合酶链反应(PCR)检验
PCR检验阳性，报告“巴贝西原虫核酸检验阳性”。9.3.1
PCR检验阴性.报告“巴贝西原虫核酸检验阴性”。-iiKAoNiKAca
离体培养鉴定
9.4.1标本中培养出巴贝西原虫，报告“细胞培养检出巴贝西原虫”9.4.2
言传三代未见可疑巴贝西原虫，报告“细胞培养三代，未检出巴贝西原虫”。阳性结果处置
离体培养阳性结果应出具阳性报告单。离体培养阳性结果应向上级主管部门报告。10.2
SN/T3391-2012
-iKAoNiKAca
SN/T3391—2012
A.1主要试剂
姬姆萨（Gimsa）染液
姬姆萨染料
附录A
（资料性附录）
巴贝西原虫检验主要试剂及器材08g
将0.8g染料加到50mL甘油中，混勾，置602h，不时搅拌。取出凉至与室温相同时加入甲醇50mL，用磁力搅拌过夜。用滤纸过滤，滤液即为原液。应用时用PBS(1/15mol/L，pH6.4～6.8)或蒸馏水稀释十倍。
培养基的主要成分及制备方法
PRMI-1640培养液
RPMI1640溶液
RPMI1640
高纯水或去离子水
1mol/LHEPES缓冲液
高纯水或去离子水
1800mL
注：HEPES,N-2-hydroxyethylpiperagi238.2。
N\-2-cthanesullericacid为N2羟之基哌嗪-N'-2-乙磺酸，相对分子质量（3)将（1)和(2)分别溶解后混合在起，补充二蒸水至1920mL，Www.bzxZ.net
混合后用0.22um或更小孔径
的微孔滤膜过滤除菌。分装100mL/瓶，4℃保存A.1.2.2
其他组分
200mmol/LL-谷氨酰胺溶液
L-谷氨酰胺
高纯水
溶解后过滤除菌，分装10mL./瓶，一20℃保存。抗生素配制（1万单位/mL）
青霉素
链霉素
无菌高纯水
1000000U
1000000μg
溶解后无菌操作分装1mL/瓶，一20℃保存。两性霉素B配制（25g/mL)
两性素B
高纯水
rrKAoNiKAca
过滤除菌，分装1mL瓶，一20℃保存。A.1.2.3RPMI1640完全培养基
RPMI1640培养液
L-谷氨酰胺（200mmol/L）
抗生素（青、链霉素）
两性霉素B(25μg/L）
7.5%NaHCO
灭活小牛血清
过滤除菌，分装1mL/瓶，一20℃保存A：1.2.4阿氏（Alsever）血液保存液葡萄糖
柠檬酸钠·5H,0
柠檬酸·H,O
氯化钠
加蒸馏水至100mL，溶解后过滤，分装，115体积分数1/1~1/2
A.1.2.5原虫冻存液（水溶剂，以下为体积分数）甘油
山梨醇
氯化钠
A.1.2.6原虫复苏液（水溶剂，以下为体积分数山梨醇
氯化钠
A,1.3PCR试剂
SN/T3391—2012
灭菌10min，4℃保存。血液与阿氏液混合比例为A.1.3.1TRIS-HCI(pH8.8):187g/LTRIS(三羟甲基氨基甲烷），浓盐酸（HCI)调整pH值。A.1.3.2TE缓冲液：10mmol/LTRIS-HC(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)。A.1.3.310×PCR缓冲液：500mmol/L氯化钾（KCI），40mmol/L氯化镁（MgClg），100mmol/LTRIS-HCI,pH 8.5。
A.1.3.4电泳缓冲液：242gTris碱.57.1ml.冰乙酸，100mL0.5mol/LEDTA（pH8.0），加蒸馏水至1000mL，使用时十倍稀释。
A.1.3.520×SSC缓冲液：在800mL蒸馏水中溶解175.3g氯化钠（NaCI)和88.2g柠檬酸钠，加人数滴10mol/L氢氧化钠（NaOH)溶液调节pH值至7.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌。A.1.3.6琼脂糖：电泳级。
A.2器材
A.2.1离体培养器材
24孔细胞培养板：滤膜滤器；旋涡振荡器：离心机；暗视野光学显微镜：解剖显微镜：全排式生物安5
-TTKAONTKACE
SN/T3391—2012
全柜：CO恒温培养箱：0.22μm除菌滤膜：高压蒸汽灭菌器：玻璃吸管（2ml.、5mL）、量筒（50ml、200mL）、三角烧瓶（200mL、100ml）；电子天平（精确到0.001g）；普通冰箱。A.2.2
PCR器材
离心机；PCR仪，电泳仪；可调移液器：1mL10μL、2μL~20uL、20μL~200μ、100mL~1000L；凝胶成像仪。
TYKAONKAca
疑似感染者标本的采集
附录B
（资料性附录）
标本的采集和处理
SN/T3391—2012
疑似感染者的血液（末梢血、静脉血、骨髓）、其他组织的印片可进行病原学检测，常规采样后立B.1.1
即送检。
2无菌方法采集血液，EDTA抗凝后无菌试管4C保存，立即送检B.1.2
3用未抗凝的真空管采集患者急性期（发病三天内）、第三周、第六周血清，用于血清学检测、B.1.3
B.2疑似感染者标本的处理
制作血涂片
B.2.1.1血液标本取1uL～3uL，置于一张洁净载玻片（甲片）的一端，涂片时用左手在拇指及食指持握该片的两端。
B.2.1.2另取一张载玻片作推片（乙片）：将其一端接触甲片血滴使血滴沿推片向两侧展开，两片之间保持45°的夹角。
B.2.1.3将乙片紧靠甲片，沿着甲片的表面轻而迅速地向前推动，直到甲片的另一端为止。推片时注意保持一定的速度和两片间的角度，切忌过分用力或中间停顿，否则将使血球破碎或涂布不勾。质量好的薄血膜应呈舌形，血细胞分布均匀。B.2.1.4将制好的血片置于空气中干燥，用甲醇一到两滴置于血片上，均勾散开，固定血膜，干透后再染色。
B.2.2血涂片染色方法
血涂片染色采用国际通用的Gimsa染液进行（1：10）稀释后（现稀释现用），染色30min，清洗，自然风十后观察。
B.2.3用于血清学试验的血液处理采集后的血液以相对离心力300g离心5min，分离出血清。3蜱及宿主动物标本采集
蜱及宿主动物采集，参照SN/T1312进行。宿主动物血液标本，应常规无菌取样，用有盖无菌或不抗凝的真空管采集保存。
蜱及宿主动物标本处理
B.4.1参照B.2.1、B.2.2、B.2.3制作血涂片。B.4.2血液采集后以相对离心力300g离心5min，分离出血清。7
SN/T3391—2012
C.1血清抗原检验
C.1.1原理
附录C
（资料性附录）
巴贝西原虫血清学检验
使用抗Babesia单克隆抗体或多克降抗体，利用阳性抗体血清与抗原的结合，通过间接免疫荧光（IFA)方法，检测病人或宿主动物或蜱中巴贝西原虫。C.1.2操作步骤
C.1.2.1将患者的血液按B.2.1方法制作薄血涂片.风于后，两酮固定15min，晾干备用。将阳性抗体血清10μL～20μL覆盖于薄血片上，37℃湿盒孵育45min。甩去多余血清，用PBSpH7.2洗涤2~3次，风干。
C.1.2.2将FTIC标记的酶标二抗-10pL-~20uL覆盖于满血片上37℃湿盒孵育45min。甩去多
余血清，用PBS(pH7.2）洗涤23次-风干后用荧光显微镜观察。C.1.3结果判断
阴性结果：荧光显微镜观察，红细胞内部或细胞间未见特异性荧光。阳性结果：荧光显微镜观察，红细胞内部或细胞间可见，呈环状体或四联体状特异性绿色较强荧光。C.2血清抗体检验
C.2.1原理
利用抗体血清与阳性抗原的结合，通过间接免疫荧光（IFA）方法.检测病人或宿主动物中巴贝西原虫抗体。
C.2.2操作步骤
C.2.2.1将患者的血液按B.2.3方法制备血清，或直接采血置于紫帽促凝血清分离管中分离血清。C.2.2.2将患者血清10μL～20μL覆盖于阳性抗原片上.37℃湿盒孵育45min。甩去多余血清，用PBS(pH7.2)洗涤2~3次.风十。
C.2.2.3将FTIC标记的酶标二抗.10μl20μL覆盖于阳性抗原片上，37℃湿盒孵育45min。甩去多余血清，用PBS(pH7.2)洗涤2~3次，风干，风干后用荧光显微镜观察。C.2.3结果判断
阴性结果：荧光显微镜观察，未见特异性荧光。阳性结果：荧光显微镜观察，可见特异性荧光呈环状体或四联体，如阳性荧光太强可将患者血清梯度稀释测定其抗体滴度。
D.1扩增引物
附录D
（资料性附录）
巴贝西原虫聚合酶链反应检验
SN/T3391—2012
下列是根据巴贝西原虫基因18SrRNA设计的-对引物，在GenBank中参考序列号为M93660，具有高度特异性，供使用时参考。阳性标本可扩增出154bp的片即外引物
上游引物：5-CTTAGTATAAGCTTTTATACAGC-3下游引物：5-ATAGGTCAGAAAGTTGAATGATACA-3内引物
上游引物：5-GTTATAGTTTATTTGATGTTCGTT下游引物：5'-AAGCCATGCGATTCGCTAAT-3D.2
模板制备
原虫虫株的模板制备
D. 2. 1. 1
待测。
溶于90μLTE缓冲液中。
取原虫虫株感染率超过10%的红细胞10L加人溶菌酶（20g/L)10μl
C水浴30mina
SDS)10L.60℃水浴10
加入10%十二烷基硫酸钠溶液
加人蛋白酶K（10g/L）10μL3
加人RNA酶（10g/L10
加人150L酚、三氯甲烷、
30mina
戊醇混勾液，抽提三次
min（变清为止），室温冷却。
加人冰乙醇，12000r/min离心10min，弃上水相，自然干爆，加入1×SSC100μL，4℃保存临床标本的模板制备
取血2mL5000r/min，5min.弃上清液，加TE缓冲液300uL100℃煮沸30min，室温冷却。
加人RNA酶（10g/L)10μl37℃30min12000r/min离心5min，取上清液10μL用于PCR扩增D.2.3蜱及宿主动物标本的模板制备D.2.3.1蜱标本处理：取蜱一只（幼虫可五到十只为一组），用体积分数为70%的乙醇溶液浸泡5min~10min进行表面消毒，然后用无菌蒸馏水洗涤23次，无菌滤纸吸干水分。研磨器加TE缓冲液研磨至细粉末状，然后按照D.2.1.2至D.2.1.7程序进行。D.2.3.2宿主动物血液标本按D.2.2处理。D.3第一轮扩增
D.3.1取无菌的0.2mLPCR扩增管，设置阴性对照、阳性对照，将样品编号，按照以下加样量加样：9
SN/T3391—2012
10XPCR缓冲液（含氯化镁）
4dNTPs(1.25mmol/L)
上游引物（10μmol/L）
下游引物（10μmol/L）
聚合酶（5U/mL）
超纯水
混勾，6000r/min离心1min，将管内液体甩人管底。设置扩增反应条件：94℃5min；94℃60s，58℃60s，72℃120s.35个循环；最后72℃5min，D.3.3
进行第一轮PCR扩增
第二轮扩增
按照D.3.1体系，把上下游引物改为内引物，将第轮扩增产物作10倍到50倍稀释后作为模板，按D.3.2混勾，设置扩增反应条件：94℃5min：94℃60s55℃60s，72℃1205.35个循环；最后72℃5min.进行第二轮PCR扩增。D.5电泳
取10L扩增产物，加入2L溴酚蓝上样缓冲液，混匀，加样于1.5%琼脂糖凝胶（含0.5μg/ml漠化乙锭）胶孔中，以5V/cn稳定电压电泳30min，用凝胶成像系统观察是否出现目的条带（154bp）。D.6
结果判定
如阴性对照和空白对照末出现条带，阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条带（扩增片段大小为154bp），则可初步判定该样品巴贝西原虫核酸检验阳性，应进一步进行测序验证：如果待测样品中未出现PCR扩增产物，则判断为待测样品巴贝西原虫核酸检验阴性。10
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