SN/T 3296-2012.Criterion on detection of plant pathogenic bacteria by molecular biology.
1范围
SN/T 3296规定了植物病原细菌分子生物学检测规范。
SN/T 3296适用于植物及其产品的细菌病害、分离纯化的植物病原细菌分子检疫鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 27403实验室质量控制规范 食品分子生物学检测
SN/T1193基因检验实验室技术要求
SN/T2601植物病原细菌常规检测规范
3原理
根据不同植物病原细菌基因组中的特异序列,利用分子生物学方法对病原菌进行鉴定。
根据病原细菌侵染植物的发病程度及检测目标病原细菌的生物学特性及与近缘种区分难异程度不同,选择不同的分子生物学方法进行鉴定。
4试剂与耗材
4.1试剂
植物基因组提取试剂盒、细菌DNA提取试剂盒、Taq酶、dNTP.常用荧光抗体、尿素、去离子甲酰胺、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、琼脂糖、生理盐水等;常用细菌分离培养的培养基配方参见附录A。除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。
4.2耗材
培养皿、试管、三角瓶、研钵、离心管(1.5mL、1.0mL)、PCR管(0.2μL)量简、烧杯,剪刀、消毒缸等。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3296—2012
植物病原细菌分子生物学检测规范Criterion on detection of plant pathogenic bacteria by mofecular biology2012-10-23发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-05-01实施
本标雅按照（G3/T1.！-2009给山的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归LI。SN/T3296—2012
本标推起草单位：中华人民共和国辽宇出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局。
本标准十要起草人：邵秀玲、王有福、尼秀媚、厉艳、甘琴华、李露、刘卉秋、工晓明。1范围
植物病原细菌分子生物学检测规范木标准规定了植物病原细菌分子生物学检测规范SN/T3296-2012
本标准适用于植物及其产品的细菌病害、分离纯化的植物病原细菌分了检鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注口期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测SN/T 1193基因检验实验室技术要求SN/T2601植物病原细菌常规检测规范3原理
据不筒植物病原细基因组巾的特异序列，利用舒子生魏学方法对病原菌进行鉴定根据病原细菌侵染植物的发病程度肢检测口标病原细菌的生物学特性皮与近缘种区分难异程度不，选择不同的分子生物学方法避行鉴定，4试剂与耗树
4.1试剂
植物基因组提取试剂盒、细 DNA提取试剂盒,ddH.O,Taq 酶、dNTP.常用炭光抗体,尿素、上离子甲酰胺,丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、琼脂糖、尘理盐水等;常用细菌分离培养的培养基配方参见附录A。除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂。4.2耗材
培养、试管、角瓶、研钵,离心管(1, 5 mL、1. 0 mL)、PCR管(0. 2 μL)、量筒、烧杯,剪刀、消毒等。
5仪器设备
5.1常规设备
植物培养箱、恒温培养箱、恒温振荡培养箱，高压灭菌器、超净工作台、生物显微镜（具照树系统）、高速冷冻离心机（12000)r/min）、小型离心机、纯水仪、恒温水浴锅、低温冰箱、电动搅拌器等。5.2PCR 方法主要设备
PCR仪、荧光定量PCR仪、电泳仪，变性梯度凝胶电泳仪、电泳槽、毛细管电泳仪,凝胶成像分析1
SN/T3296-2012
仪，电子天平（感量0.0001g），恒温水浴锅等6实验室检测
6.1总则
实验室总体要求与质控应符合SN/T1193：分了生物学方法的选择可参照以下原则：对于有针对病原细菌鉴定的特异性引物·并能很好地将病原细菌与其他近似种区分开来的检a
测目标，可采用普通PCR法、巢氏PCR法，或环介导等温基因扩增法等；b）对于较难区分鉴定的病原菌可采用基因组重复序列PCR、实时荧光定量PCR、分子标记法等：有标准明确规定的分子生响学检测方法推荐参照标准方法。e
样品制备
对于病灶明显的植物样本，可分离纯化就似发病物组织中的细菌，细菌分离与培养可按照SN/T2601进行。对于病症不明显的植物样本，利用基因组提取试剂盒提取植物组织总DNA作为PCR的模版，提取方法可见基因组提取试剂盒说明。样品制备时，每个样品都应取至少2个平行样，进行重复性实验。
6.3质量控制
6.3.1总DNA样品质量控制
琼脂糖凝胶电泳检测基因组的完整性6.3.1.1
将提取的基因组DNA取2μL进行琼脂糖凝胶电泳检测·基因组完整性较好的DNA样品电泳后将显现出一条明显而清晰的条带，如果在指示前治漠盼蓝前有弥散的荧光区出现，则表明样品中存在RNA杂质，若所提总DNA样品靠0.5%琼脂糖凝胶上不能形成清薪的条带，而是弥散一片，则表明总DNA样品已严重降解。
6.3.1.2分光光度（紫外吸收）法检测DNA的浓度和纯度
将待测DNA样品按适当倍数进行稀降，在紫外分光光度计上分别读出260nm和280nm的光密度值及其比值，根据OD60/OD2的值比较所提取总DNA的纯度
DNA浓度计算公式：DNA浓度
（ng/L）=OD×50×核酸稀释信数，在紫外分光光度计下检去，纯的总DNA样品溶液的OD起/OD2o的比值约为1.8。若ODzn/OD2购比值在1.8~2.0时、表明DNA的纯度较好。若OD2/ODz80的比值大于2.0时，表明有RNA污染：若OD260/OD2的比值小于1.8时表明有蛋白质或酚污染。通过计算调整DNA的浓度，调整后用于PCR扩增的DNA模板浓度范围一般为1nguL~50ag/μL若提取的总DNA样品浓度较低.可以在后续过程中通过加人模板量，增加反应次数，或者采用二次PCR等方法来完成分子生物学检测。6.3.1.3核酸检测质控
使用内参照对核酸的扩增进行质控，用于检查提取DNA的质量，以避免实验过程中出现的假阴性。扩增检测的内参通常为细菌某个基因DNA片段。实验中一般采用能扩增所有供试材料的通用引物预防假阴性现象。当样品中存在扩增抑制物，或核酸提取中发生DNA降解，或Ta酶失活，内参照会表现为阴性结果。实验中应设有外加阴性对照、空白对照和阳性对照，阴性对照和空白对照用于检验实验过程中是否存在污染，阳性对照则用于检验试剂和实验操作上可能出现的间题。这些质控样本在检测过程中应使用与待测样品相同的反应混合液。2
KAoNiKAca
6.3.2污染的分析及处理
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细菌分子生物学检测中涉及的污染来源包括：样品间交叉污染、试剂污染，PCR扩增产物污染，实验器具污染等等，对污染的预防和处理原则可按照GB/T27403进行6.4检测方法
6.4.1普通PCR法
用细菌的保守序列如16SrDNA，ITS，gyrB基因的通用引物进行PCR检测，或者根据检测目标菌选取其特异性较强的序列设计特异性引物进行PCR检测。根据细菌16srDNA，ITS和gyrB序列设计的通用引物及反应条件参见B.1。普通PCR法的检测结果的分析有多种方法·普通检测是利用琼脂糖凝胶电泳，对于难以区分的PCR产物，可以采用毛细管电脉技术（参见B.1)。对于检测到的扩增片断
需进一步测序及比对才能进行阳性确认6.4.2巢式PCR技术（nestedPCR）巢式PCR技术基本步骤如下：
根据病原细菌某段序列（根据试验要求，可选取不同区域）设计两套引物·分别称为外侧引物和a)
内侧引物：
以提取的病原细菌或疑似发病的植物总DNA为模版，首先利用外侧引物进行PCR：b)
将首次PCR的产物稀释2一50错，作为第一次PCR的模版利用内侧引物进行二次PCR：d)电泳检测。
实时荧光PCR法（Real-time
CentPOR
GreenI检测与探针检测，其中探针检测最常用的是TagMan探针检实时荧光PCR法分为SYBR
测，TaqMan探针检测的基本步骤如下具体反应体系参
根据病原细菌的保守序刻设计
上下游引物；
b）在引物对扩增片段区间我出病菌稳定性点突变区，应用引物和探针设计软件设计特异性探针；探针采用化学合成标记方法：5端标记荧光染料为Carboxyfluorescein（FAM），3端标记率灭荧光染料为Tetramethycarbo-xyrhodamine(TAMRA)d）利用荧光定量PCR仪进行检测6.4.4变性温度梯度凝胶电泳-PCR（PCR-TGGE/DEEG）变性温度梯度凝胶电泳-PCR基本步骤如下（具体操作步骤与条件参见B.3)：a
PCR扩增：
b）变性梯度凝胶电泳：
凝胶染色与结果观察。
6.4.5基因组重复序列PCR技术(rep-PCR）基因组重复序列PCR技术基本步骤如下：a）选取分别针对基因重复序列L常用的重复序列包括：REP（基因外重复回文系列）、ERIC（肠杆菌基因间重复一致序列)和BOX对应的引物；以基因组DNA为模版进行PCR扩增：b)
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“）扩增产物经琼脂糖凝胶检测；）利用软件分析让行聚类分析。注：针对个居补的纸菌尺引物已有大望报道.可渠据带要进行定间查找。6.4.6限制性长度多态性PCRPCR-RFLP）限制性长度多态性PCR基本步骤如下：利用细菌的通用引物进行PCR(一般是I6SrDNA引物）：H
PCR产物进行纯化（INA纯化试剂盒）；h
利用不尚的限制性内切酶迹行PCR产物酶切；d)利用2%琼脂糖凝胶电泳检测酶韧产物；\）紫外戚像仪照。
6.4.7序列相关扩增多态性（SRAP)标记序列相关扩增多态性标记技术流程的基木少骤如下（具体注意事项参见B.41)：a）SRAP标记的引物设计：
b)SRAP-PCR扩增SRAPPCR扩增：
）扩增产物检测与片段测序。
6. 4.8随机引物扩增多态性PCR(RAPI-PCR)随机引物扩增多态性PR基木步骤如下：选取病原菌的随机序列的案核并酸作引物，以病原细菌或疑似发病植物组织的基因组NA）
为模板进行ICR.随机列通常为10个核甘酸；b）扩增产物经聚内烯酷胺凝胶电冰分离；）凝胶染色与结果观察。
6. 4. 9 扩增片段长度多态性 PCR(PCR-AFLP)扩增片段长度多态性PCR基木步骤如下：a）逃取特定的酶切割基因组 INA;h）利用细菌的通用引物进行PR反成：c）PCR产物逊行纯化(DNA纯化试剂盒）利用不同的内切酶逃行PCR产物酶切：d
利用2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物；e)
f）紫外成像仪拍照。
6. 4. 10环介导等温基因扩增技术(LAMP)环介导等温基内扩增技术基本步骤如下（具体反应体系与反成条件参见B，与）：a）选取病原菊的特异序列；
）登陆网站，根据网站[引物设计指导了册.利用LAMP引物自动设计软件进行引物设计；e）根据网站上引物设计规定的引物设计原则行引物的筛选：d）在60℃65条件下，进行LAMP反应。-KAoNiKAca
7结果判定
7.1普通PCR
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阴性对照和空向对照均未出现特征条带，阳性对照出现预期大小的特征条带，待测样品出现预期大小的特征条带，为疑似目标菌，需进一步确证（测序、比对）；待测样品未山现预期大小的扩增条带，为阴性结果。毛细管电泳-PCR判定结果以PCR产物与阳性对照出峰时间相同为阳性；如果样品PCR产物与阳性对照的出蜂时间交叉重叠·则需对样品 PCR产物迹行测序，并在 NCBI网站上比对确认：否则为阴性。
7. 2 巢式 PCR
荠样品PC'R扩增产物电泳出现预计大小的条带，同时阳性对照扩增产物电泳后也出现目的片段。阴性对照和空白对照铲增产物电泳后没有出现自的片段，判定结果为可凝阳性，需进一步通过测序确证，HCR扩增产物电泳无目的扩增条带，!H阳性对照扩增产物电泳后出现目的片段，阴性对照和空白对照扩增产物电泳后没有出现目的片段，判定结果阴性。7.3实时荧光 PCR法
C1值240，可判定样品结果为阴性，可直接报告米检出相对应致病菌；C1值≤35，可判定该样品结果为阳性:40>已1值>35,建议样本重做。重做结果（i值≥40 者为阴性否则为阳性。7. 4变性温度梯度凝胶电泳-PCR样品与阳性对照在梯度凝胶上的DNA迁移速率相同，空占对照及阴性对照无IDNA条带为阴性：样品与阳性对照在梯度凝胶上的DNA江移速率相似，但同步性有差异、则需进·步回收片断测序确定；以上两种情况之外的结果直接判为阴性。7.5基因组重复序列PCR
样品与阳性对照具有同样的多态性条带、空白刘照及阴性对照无条带，为疑似阳性，利用软件对梢品进行聚类分析，与日标菌相似水平达到98%以上的相似性既为阳性，否则为阴性。7.6限制性长度多态性PCR(PCR-RFLP）样品与阳性对照PCR产物酶切结果具有同样的多态性，空口对照及阴性对照无条带为附I性，否则为阴性。
7.7序列相关扩增多态性(SRAP）样品PCR产物测序.测序结果在Genbank上进行基因序列比对.确定检测对象种类。7.B随机引物扩增多态性 PCR(RAPI-PCR)样品与阳性对照PCR产物具有同样的多态性，空白对照及阴性刘照无条带为阳性，否则为阴性。7. 9扩增片段长度多态性 PCR(PCR-AFL.P)样品与阳性对照PCR结果具有同样的多态性，空对照及阴性对照无条带为阳性，否则为阴性TTKAoNiKAca
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环介导等温基因扩增技术
判定结果以空白对照及阴性对照无条带，反应产物琼脂糖凝胶电泳为梯状条带为阳性，如果出现条带但条带单一，则需优化电泳条件进一步确认，直至出现梯状条带，否则为阴性。检测结果的综合判定与复核
对于用一种分子生物学方法检测结果为阳性的样品应用第二种方法进行验证，两种方法都为阳性可判定检测结果为阳性。对首次检出的病原细菌必要时需经专家进行复核。9样品处理与菌株保存
验余样品121℃高压灭菌15in.然后弃掉将从检测样品中分离到的阳性病原细菌菌株转接到试管斜面上，适宜的温度培养。然后置于4℃冰箱中保存，定期30d～60d）转接，防止病菌死亡：或在菌悬液中加人15%～30%的甘油于一80℃下保存：必要时将菌株用真空冷冻干燥机制成冻干粉，一80℃下长期保存。
irKAoNiKAca
A.1523培养基
酵母膏
MgSO.7H.0
蛋白陈
附录A
（资料性附录）
常用培养基配方
调整pH值至7.0~~7.1.121℃湿热灭菌15min-%A2
NA营养琼脂
牛肉浸膏
蛋白藤
酵母膏
蒸馏水
10000ml
调整pH值至7.4121C湿热灭菌
LB培养基
胰蛋白陈
酵母粉www.bzxz.net
蒸馏水
调整pH值至7.2.121C湿热灭菌15min~20min。SN/T3296-—2012
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B.1普通 PCR
附录B
（资料性附录
部分分子生物学方法反应的体系，条件和操作步骤H. 1. 1细菌 16S rDNA 序列引物上游引物5\-AGAGTTTGATCATGGCTCAC: 3下游物5\-ACGGTTACCTIGTIACGAGTT-3';反应条件：94℃5inin,94℃1min.57℃1min，72℃2min35个循环.72℃10min.4保存，B.1. 2细菌 ITS 序列引物
上游引物5*-AGTCGTAACAAGGTAGCCGT-3'；下游引物5°-GTGCCAAGGCATCCACC-3”;反应条件:94 C 5 min,94 ℃:1 min,57℃ 1 min,72 ℃ 2 min,35个循环,72 ℃ 10 ni,4 t保存B. 1. 3细菌促旋酶 gyrB基因的通用引物F游引物5-ATGACNCARYTNCAYGCNCGN3'；下游引物5’SAYGATCTTGTKRTASCGMAAYTT-3';反应条件945min,94℃1min.56.1C1.5min.72℃2min,35个循环.72℃7min，1保存。
B.1.4毛细管电泳技术
毛细管电泳技术检测 PCR产物基本步骤如下：A)PCR 扩增靶 INA:
b）将特的PCR扩增产物与含有高纯甲酰胺混合(混合比例一般为：10)加人毛细管电泳仪中.同时设立阻性对照·逆行电泳，注：！体电泳操作改江意事项可根毛细管电脉仪的使用说虏进行。B, 2荧光定蛋 PCR 反应体系
PCR 体系为 25 μl-,其中 2X PCR MasterMix 12, 5 μL,引物(10 μol/L)各 1 μL,探针(10 μnol/L)1μl.,模板 1 μl.,dd.O 8.5 μ.。B. 3温度梯度 PCR 引物及检测方法B.3.1引物序列
基丁细菌16S rDVA基因V3可变区所设计的特异性引物F357GC和R518,它们的序列分别为：F337:(5°-CC TAC GGG AGG CAG CAG-3');R518(5'-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3');GC 发+结构(S'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GCG GGG GCG GGG GCA CGC GGG G 3').B, 3. 2扩增条件
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PCR反应同普通PCR操作方法，对于F357GC和R518引物对应的PCR扩增条件：95C预变性4 min,前20个循环为95℃40 5,58℃40×和72℃1. 5min,后10个循环为94℃ 40、55℃40s和72℃1.5min，最后在72C下延伸10min。其中上游引物加40bpLG门发夹结构序列。B. 3.3变性梯度凝胶电泳
变性梯度凝胶电泳分为：
a）垂直变性梯度凝胶电泳：变性梯度递增的方间与电泳方向垂直。所使用的胶为6%聚丙烯酰胺凝胶，变性浓度为0为～100%，其中，含7ma1/L.尿素和40%去离子甲酰胺的胶为1010为变性，不含尿素和去离了甲酰胺的胶为0%变性。垂直变性梯度凝胶电冰出要是检测引物的最适解链条件（即变性浓度）;PCR产物加I样缓冲液后1样，每孔300μT.～:400μI，电压150V，温度60℃.时间2h1 h；
b）平行变性梯度凝胶电泳：变性梯度递增的方向与电泳方向平行。根据垂直变性梯度凝胶电泳检测的解链区域的变性浓度，制备相应变性浓度的平行变性梯度凝胶，检测各标本是否存在突变；
PCR产物加L样缓冲液后，每孔25μl~30μl.，电压150V，温度60℃，时间3h~6hB.3.4结果观察
染色5 mil,凝胶成像仪分析结果。B.4SRAP标记操作步骤
B.4.1SRAP标记的引物设计
SRAP标记分析中共有两套引物，长为17bp的正间引物和长为18bp的反间引物，也有用19bp反间引物的，这些是由Li等在发展SRAP流程时对引物大小进行实验发现的。引物设让时有一个原则,就是引物之间不能形成发夹结构或其他的二级结构，G的含量在10关～50%之间，正向和反向引物的填充序列在成「应不同，长度为10b～11叫P。试验表明，用单引物扩增具能铲增儿条大药0.5bp~1bp的片段：使用较短引物，10bpRAPD引物，及含有SRAP引物核心序列的14bp~15bp大小的引物，这些引物组合可得到多种扩增片段，恒是扩增产物不稳定，特异性不强；20b～22b引物放射白显影的结果背景太强；合适的引物大小在17 hp~18bp。B, 4,2SRAP-FCR 扩增
采用复性变温法，扩增程序为94℃预变性5min，然后光按94℃变性1min，35℃退火1min，72℃延伸1.5min的顺序,进行5个循环，然后将退火温度升至50℃,其他温度仍然不变，再进行30~35个循环；最后,72℃再延伸5min。即前5个循环复性温度35℃,后35个循环复性温度采用50℃，扩增开始时采用低的遐火湿度有利于两引物与DVA靶位点的结合，随后循环中采用较高复性温度叫保证产物以指数方式扩增。
B.4.3扩增产物检测与片段测序
扩增产物在变性聚内烯酰胺凝胶上电冰分离后、从胶上割下获得SRAP标记差异片段，回收后，用相应引物直接测序，必要时可采用克隆测序。由于SRAP产生高强带.很少有重叠，而H引物较长·故比传统方法更易测序。
SN/T3296—2012
5LAMP反应体系与条件
反应体系20mmol/l.Tris-HC1(pH8.8);10mmol/LKCl;8mmol/1.MgS0：10mmol/l(NH4):S)0. 8 mmol/L. Betain;1.4 mmol/1. dNTP; 1. 6 μmol/L FiP,1.6 μmol/L BIP,0. 2 μmol/1.F3;0.2 umol/L F3:0.1% Triton X-10u;8 UJ3st palyrmase;反应条件：95℃5min.冰浴迅速降温，加入8UBs1DNApolymerase，60℃~65℃1h，80℃10 min
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