SN/T 3438-2012
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标准简介
SN/T 3438-2012.Detection and identification of southern bean mosaic virus.
1范围
SN/T 3438规定了南方菜豆花叶病毒的血清学和分子生物学检测方法。
SN/T 3438适用于可能携带南方菜豆花叶病毒的豆科种子的检疫鉴定。
2原理
南方菜豆花叶病毒( southern bean mosaite Virus,SBMV)为南方菜西花叶病毒属(sobemovirus)的
典型成员。抗原特性和基因组特征(参见附录A)是检疫鉴定的主要依据。
3仪器、设施及试剂
3.1 仪器与设施
酶联检测仪、电子天平(感量0.0001 g)、定性PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、恒温水浴、低温冰箱、普通冰箱、离心机等;微量移液器(2.5μL,10μL,20μLL,100μL,200μL,1 000μL) ;酶联板、研钵等;防虫温室。
3.2 试剂
酶联检测试剂(见附录B),RT-PCR检测试剂(见附录C)
4检疫与鉴定
4.1 制样
挑取畸形、不成熟的种子播于灭菌土中,待长出3~4片真叶后将装现症状的植株编号,未表现症状的植株分组(10株为1组)并编号。采集的叶片分成两份,分别用于酶联检测和分子生物学检测。
4.2检测
4.2.1双抗体夹心酶联免疫吸附检测
把制备的样品上清液加人已包被SBMV抗体的96孔酶联板中,进行DAS-ELISA检测。每个样品平行加到两个孔中。健康的植物组织作阴性对照，感染SBMV的植物组织作阳性对照，样品提取缓冲液作空白对照,其中阴性对照种类和材料(如:种子或叶片)应尽量与检测样品一致。不同的检测试剂或试剂盒根据试剂或试剂盒的说明操作。
具体操作见附录B。
1范围
SN/T 3438规定了南方菜豆花叶病毒的血清学和分子生物学检测方法。
SN/T 3438适用于可能携带南方菜豆花叶病毒的豆科种子的检疫鉴定。
2原理
南方菜豆花叶病毒( southern bean mosaite Virus,SBMV)为南方菜西花叶病毒属(sobemovirus)的
典型成员。抗原特性和基因组特征(参见附录A)是检疫鉴定的主要依据。
3仪器、设施及试剂
3.1 仪器与设施
酶联检测仪、电子天平(感量0.0001 g)、定性PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、恒温水浴、低温冰箱、普通冰箱、离心机等;微量移液器(2.5μL,10μL,20μLL,100μL,200μL,1 000μL) ;酶联板、研钵等;防虫温室。
3.2 试剂
酶联检测试剂(见附录B),RT-PCR检测试剂(见附录C)
4检疫与鉴定
4.1 制样
挑取畸形、不成熟的种子播于灭菌土中,待长出3~4片真叶后将装现症状的植株编号,未表现症状的植株分组(10株为1组)并编号。采集的叶片分成两份,分别用于酶联检测和分子生物学检测。
4.2检测
4.2.1双抗体夹心酶联免疫吸附检测
把制备的样品上清液加人已包被SBMV抗体的96孔酶联板中,进行DAS-ELISA检测。每个样品平行加到两个孔中。健康的植物组织作阴性对照，感染SBMV的植物组织作阳性对照，样品提取缓冲液作空白对照,其中阴性对照种类和材料(如:种子或叶片)应尽量与检测样品一致。不同的检测试剂或试剂盒根据试剂或试剂盒的说明操作。
具体操作见附录B。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3438—2012
南方菜豆花叶病毒检疫鉴定方法Detection and identification of southcrn hean mosaic virus2012-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-07-01实施
本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3438—2012
本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国云南出人境检验检疫局、中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局。本标准士要起草人：陈青、陈岩、李晏、刘忠悔、陈红运、廖宫荣、林石明1范围
南方菜豆花叶病毒检疫鉴定方法本标准规定了南方豆花叶病毒的血清学和分子生物学检测方法。本标准适用于可能携带南方菜豆花叶病毒的豆科种子的检疫鉴定。2原理
南方菜豆花叶病毒（southernbeamSN/T3438—2012
s，SBMV)为南方菜夏花叶病毒属（sobemovirus）的典型成员。抗原特性和基因组特征（参见附录A）是检疫鉴定的主要依据。3仪器，设施及试剂
3.1仪器与设施
酶联检测仪、电子天平（感量0.0001g）、定性PCR仪电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、恒温水浴、低温冰箱、普通冰箱、离心机等：微量移液器（2.5μL，10m20μL，100L，200mL，1000L）：酶联板、研体等：防虫温室。
3.2试剂
酶联检测试剂（见附录B)，RT-PCR检测试剂见附录4检疫与鉴定
4.1制样
挑取畸形、不成熟的种子播于灭菌土中，待长出一4片真叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号。采集的叶片分成两份·分别用于酶联检测和分子生物学检测。4.2检测
4.2.1双抗体夹心酶联免疫吸附检测把制备的样品上清液加入已包被SBMV抗体的96孔酶联板中，进行DASELISA检测。每个样品平行加到两个孔中。健康的植物组织作阴性对照，感染SBMV的植物组织作阳性对照，样品提取缓冲液作空白对照，其中阴性对照种类和材料（如：种子或叶片）应尽量与检测样品一致。不同的检测试剂或试剂盒根据试剂或试剂盒的说明操作。具体操作见附录B。
4.2.2RT-PCR检测
分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增。健康的植物组织作阴性对照，感染SBMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。1
SN/T 34382012
其体操作见附录 C。
5结果判定
酶联检测阳性,使用 SBMV特异性引物进行RT-PCR检测，扩增出口的条带.判定样品是携带SEMV否则不携带
样品酶联检测阳性.使用SBMV特异性引物未扩增出日的条带，可用南方虹豆化叶病毒的特异引物对该样品进行RT-PCR检测（参见附录A），6样品保存、结果记录与资料保存6.1样品保存
经检测确定携带SI3MV的样品应在合适条件下保存，种子保存在4℃，病叶冻干保存在一20℃或者一80℃冰箱中，做好标记和登记1.作。6.2结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的米源、种类、检测时间、地点，方法和结果等，并要有经手人和检测人员的签字，酶联测定应有酶联板反应原始数据，RT-PCR检测应有扩增结果图片，生物学接种应有症状照片。
rKAoNiiKAca
A, 1分类信息
学名;southcrn hcan mosaic virus缩写：SBMV
附录A
(资料性附录）
南方菜豆花叶病毒简介
分类地位：南方菜豆花叶病毒属（sohemaviris）SN/T3438—2012
SBMV是南方菜豆花叶病毒属的典型成员.与同属的南方紅豆花叶病毒（southerncowpcamosaicvirus.SCPMV)在基因组结构、病毒粒子·稳定性和抗原特性等方面极为相似，SCPMV一度被划分为SBMV的C株系，直至病毒基因组全序列测定后，才将两者准确区分。A,2生要寄主
菜豆（Phasealusuulgaris）大豆（Glycinemar）、黑绿豆（Vignamtngo）缘豆（Vignarudiata），彭鉅（Vign sinensis）。
A. 3 病害症状
菜豆（Phasentusvutgaris）：随品种不同产生很多不同症状，坏死或系统花叶，或榄绿斑驳花叶，或皱缩和沿脉变色。
利马豆（Phaseoitusiunatus）：仅小粒品种对SBMV敏感，表现为小的坏死斑。大豆（Glycinemaz）：轻微所系统性斑驳症状，症状随品种而异。绿豆（Vigna radiata）：被黑绿豆分离物感染后出现系统花叶。千日红(Gomphrena glohosa）：ivoryCoast分离物引起千红出现系统症状。尤记录显示对其他分离物敏感。
A,4分布地区
SBMV的发生地包括：前苏联、法国、印度、巴基斯坦，贝宁、科特迪瓦、加纳、摩洛哥、尼口利亚、塞内加尔、多哥、哥斯达黎加，尼加拉瓜，墨西再、美国、巴西、哥伦比亚、委内瑞拉。SBMV在美国分布较为广泛.阿肯色、加利福尼亚、佛罗里达等11个州都有该病毒发生的报道。A,5传播途径
SBMV和SCPMV主要通过种子传播，莱豆种传率1%~~5%，就豆种传率5K～40以。A.6抗原特性
SBMV抗原性强：容易制备高滴度的特异抗体。3
KAoNiKAca
SN/T3438—2012
粒体形态
病毒粒体为等轴对称的二十面体（T一3），无包膜，直径约30nm。A.8基因组
SBMV基因组为SsRNA，全长约4136nt，编码4个蛋白：病毒基因组5和3°端分别含有一段非编码区。SCPMV基因组结构与SBMV相同，全长约4194nt。A,9SCPMV分子检测
A.9.1SCPMV的特异性引物和RT-PCISCPMV的特异性引物见表A1
引物名称
SCPMVf
SCPMVI
引物序列
ATGTCCGGTCTATTCCAT
CCATTCGGATAGCGCTC
位置和产物
扩增产物
4178~4194
RNA提取见C.2.1、RT-PCR反体系和条件C.2.2,电泳步骤魔C.2.3。A.9.2SCPMV结果判定
8bp处有扩增片
SCPMV阳性对照经SCPMV特异号
物扩增后在97
异性扩增，样品出现与阳性对照978
段·阴性对照和空白对照无特
增条带，可判定该样品携
PMV：阳性对照、阴性对照和空
致的护
带SCE
白对照正确，样品未出现与阳性对照一致的扩增条带，判定样品不携带SCPMV
KAoNiKAca
B.1试材
B.1.1酶联板。
附录B
（规范性附录）
DAS-ELISA检测步骤
包被抗体：特异性的SBMV抗体
酶标抗体：碱性磷酸酯酶
标记的SBMV抗体
底物：对硝基苯磷酸二钠
PBST缓冲液（洗涤缓冲液PH7.4)NacI
吐温-20
蒸馏水定容至1L。
B.1.6样品抽提缓冲液（pH7.4）NasO.
PVP(MW24000~40000)
PBST定容至1L,4℃储存
B.1.7包被缓冲液（pH9.6）
蒸馏水定容至1L4℃储
B.1.8酶标抗体稀释缓冲液（pH2:4D)BSA牛血清白蛋白）或脱脂好粉
PVP(MW24000~40000)
PBST定容至1L，4℃储存。
B.1.9底物(pNPP)缓冲液(pH9.8)MgCl
三乙醇胺
溶于800mL蒸馏水中，用HCI调pH值至9.8，蒸馏水定容至1L，4℃储存。B.2程序
B.2.1包被抗体
SN/T3438—2012
用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加入酶联板的孔中，100uL/孔，25C孵育4h，清空孔中溶液，5
KAONIKAca
SN/T 3438--2012
PBST洗涤6-~8次。
B.2.2样品制备
待测样品按1：10（质量：体积)加人样品抽提缓冲液，用研钵研磨成浆7500g离心10min，上清被即为制备好的待测样品。阴性对照、阳性对照作相应的处埋或按照说明书逝行；空白对照为样品抽提缓冲濑。
根据检测需要设计96 孔(或48 孔)酶联板,包括 2 个阴性对照孔、2 个降性对照孔,2 个空白对照孔和多个待测样品孔。加样量为100μl./孔,每个样品设1个重复。4℃冰箱孵育过夜.酶联板用PBST铣涤6~-8次，
B,2.4加酶标抗体
用酶标抗体稀释缓冲液接说明将酶标抗体稀释工作浓度，并加人到酶联板中，10μL/孔，2:孵育2 h,PRST 洗涤 6~~8次。
B.2.5加底物
将底物力NPP而,人到底物缓冲液中使终浓度为1mig/ml(现配现用）,按100l./孔·加入到酶联板中，室温避光孵育。
B,2.6读数
用酶标仪在30min.1h利2h于405nm处读oD值。注：实际检测时,孵育温度、PBST洗涤次数和显色读数时间需接照检测抗体或试剂盒中说明书痫规定执行。B. 3 结果判定
B, 3. 1对照孔的 ()I)105值(缓神液孔,阴性对照及阻性对照孔),应该在质量控制范围内,即：阴性对照孔的（D值0.15；
阳性对照0Das值/阴性对照（Dx。值2；一样品的OD值应基本-致：
B.3. 2在满足了B. 3. 1质量要求后,结果原则上可判定如下：一样品（D值/阴性对照（L)值2.判为阳性：一样品（3L)aGs值/阴性对照（Da>值接近阈值，判为可疑样品，需重做饮或用其他方法验证；—样品（D值/阴性对照（)>D值2，判为阴性：B.3.3若满足不了 3, 3.1质量要求,则不能进行结果判定。质量控制标准和结果判定需按照检测抗体或试剂盒中说明书的规定执行。TKAONIKAca
C.1试剂
C.1. fTrizr>.裂解液。
C.1.2三氯甲烷。
C. 1. 3 异丙醇。
C. 1. 4 75%乙醇。
C.1.5去离子水(DEPC处理），
C. 1, 6 50X TAE
冰醋鞍
NaEDTA.21I.O
附录C
（规范性附录）
RT-PCR 检测步骤
57,l ml
加去离了水定容笔！。用时加水稀释至「AE，C.1.76×加样缓冲瓶
0.25%浪酚蓝
40杀（质量浓度)茂糖水溶液
C. 2 实验步骤
C. 2. 1总 RNA 提取
SN/T3438—2012
称取 0. 1 g植物组织加被鼠研磨成粉末状,迅速将其移人灭菌的1.5 mL离心管中,加,人1 ml.的TrizoL试剂,刷烈振荡摇匀后室温保持5 rnin;4℃,12 000 g 离心IC min,取上清液;加(.2 nil三氯甲烷并剧烈振荡混匀;4℃，12000g离心10min,取上清液；加0.6倍体积的异丙醇.颠倒混勾，室温保持5min：4℃.12000g离心10min弃上清液；加75%的乙醇洗涤沉淀，4℃，7500g离心2min.弃乙醇；沉淀于室温下充分干燥后,溶于30μL去离了水(DEPC,处理)中，20℃C保存备用。也可采用等效的试剂金提取总RNA
C. 2. 2 RT-PCK 反应
RT-PCR检测引物见表C.1。cLNA合成反应体系20gL：在0.2mI.反应管中加人总RNA6μL，1μ下游物（20μinol/)，去离子水4μ.10mmol/dTP1μl,65水浴5min，取出后立即放在冰I,加八5XFirstSirand缓冲液μL40U/μLRNascBlock Ribonucelease Inhibitor1μL，0.3nol/T.TT2μL，2水浴2min，然后再加人200U/μLReverseTranscriptase1uL，泥勾后42C水浴50min,70C水浴15min，合成eDNA。HirslStraud缓冲液租RtverxeTranseriptaxe的用最需要依据反转录酶的品牌逃行调整。也可采用一步法RT-PCR试剂盆进行扩增SN/T 3438—2012
引物名称
表 C. 1 引物序列、位置和产物序列5°-3*)
ATCGCGAAGAGGTTGAC
ACTTTTGGATTACGCTCCATC
3 207 ~-$ 223
4 116-~4 136
矿增产物
PCR反应体系见表 C. 2。反应参数:94 ℃ 5 min; 94 C 30 5,52 C: 15 s.72 60 s,39 个循环;72 ℃ 5 min。也可采用一步法RT-PCR 试剂盒进行扩增。表 C. 2PCR 反应体系
10>PCR缓冲液
dNTH10 mnol/L
1.游引物（20pmol/ul）
下游引物（20cl/μ）
Tag博(5 Ll)
NA模板
C.2.3电泳
C. 2. 3. 1 制备凝胶
补足反应总体积至25 μl
配制1.5%（质量浓度>的琼脂糖凝胶。漠化乙锭可直接加人琼脂糖凝胶中（浓度为0.5μg/m1.)，也可在电泳完成后使用溴化之锭染色。C.2.3.2电泳
用！μL.6X加样缓冲液与5μL样品混合，然后将其和适合的DNA相对分了质量标准物分别加到样品孔中。电泳结束后将琼脂糖凝胶置丁紫外透射仪上观察，拍照保留结果。C.3 结果判断免费标准bzxz.net
SBMV阿I性对照经SBMV持异引物扩增后在930bp处有扩增片段，阴性刘照和空白对照无特异性扩增，样品出现与阳性对照一致的扩增条带，可判定该样品SHMV阳性；阳性对照、阴性对照和空白对照正确，样品米山现与阳性对照-致的扩增条带，判定结果为阴性，
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南方菜豆花叶病毒检疫鉴定方法Detection and identification of southcrn hean mosaic virus2012-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-07-01实施
本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3438—2012
本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国云南出人境检验检疫局、中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局。本标准士要起草人：陈青、陈岩、李晏、刘忠悔、陈红运、廖宫荣、林石明1范围
南方菜豆花叶病毒检疫鉴定方法本标准规定了南方豆花叶病毒的血清学和分子生物学检测方法。本标准适用于可能携带南方菜豆花叶病毒的豆科种子的检疫鉴定。2原理
南方菜豆花叶病毒（southernbeamSN/T3438—2012
s，SBMV)为南方菜夏花叶病毒属（sobemovirus）的典型成员。抗原特性和基因组特征（参见附录A）是检疫鉴定的主要依据。3仪器，设施及试剂
3.1仪器与设施
酶联检测仪、电子天平（感量0.0001g）、定性PCR仪电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、恒温水浴、低温冰箱、普通冰箱、离心机等：微量移液器（2.5μL，10m20μL，100L，200mL，1000L）：酶联板、研体等：防虫温室。
3.2试剂
酶联检测试剂（见附录B)，RT-PCR检测试剂见附录4检疫与鉴定
4.1制样
挑取畸形、不成熟的种子播于灭菌土中，待长出一4片真叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号。采集的叶片分成两份·分别用于酶联检测和分子生物学检测。4.2检测
4.2.1双抗体夹心酶联免疫吸附检测把制备的样品上清液加入已包被SBMV抗体的96孔酶联板中，进行DASELISA检测。每个样品平行加到两个孔中。健康的植物组织作阴性对照，感染SBMV的植物组织作阳性对照，样品提取缓冲液作空白对照，其中阴性对照种类和材料（如：种子或叶片）应尽量与检测样品一致。不同的检测试剂或试剂盒根据试剂或试剂盒的说明操作。具体操作见附录B。
4.2.2RT-PCR检测
分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增。健康的植物组织作阴性对照，感染SBMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。1
SN/T 34382012
其体操作见附录 C。
5结果判定
酶联检测阳性,使用 SBMV特异性引物进行RT-PCR检测，扩增出口的条带.判定样品是携带SEMV否则不携带
样品酶联检测阳性.使用SBMV特异性引物未扩增出日的条带，可用南方虹豆化叶病毒的特异引物对该样品进行RT-PCR检测（参见附录A），6样品保存、结果记录与资料保存6.1样品保存
经检测确定携带SI3MV的样品应在合适条件下保存，种子保存在4℃，病叶冻干保存在一20℃或者一80℃冰箱中，做好标记和登记1.作。6.2结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的米源、种类、检测时间、地点，方法和结果等，并要有经手人和检测人员的签字，酶联测定应有酶联板反应原始数据，RT-PCR检测应有扩增结果图片，生物学接种应有症状照片。
rKAoNiiKAca
A, 1分类信息
学名;southcrn hcan mosaic virus缩写：SBMV
附录A
(资料性附录）
南方菜豆花叶病毒简介
分类地位：南方菜豆花叶病毒属（sohemaviris）SN/T3438—2012
SBMV是南方菜豆花叶病毒属的典型成员.与同属的南方紅豆花叶病毒（southerncowpcamosaicvirus.SCPMV)在基因组结构、病毒粒子·稳定性和抗原特性等方面极为相似，SCPMV一度被划分为SBMV的C株系，直至病毒基因组全序列测定后，才将两者准确区分。A,2生要寄主
菜豆（Phasealusuulgaris）大豆（Glycinemar）、黑绿豆（Vignamtngo）缘豆（Vignarudiata），彭鉅（Vign sinensis）。
A. 3 病害症状
菜豆（Phasentusvutgaris）：随品种不同产生很多不同症状，坏死或系统花叶，或榄绿斑驳花叶，或皱缩和沿脉变色。
利马豆（Phaseoitusiunatus）：仅小粒品种对SBMV敏感，表现为小的坏死斑。大豆（Glycinemaz）：轻微所系统性斑驳症状，症状随品种而异。绿豆（Vigna radiata）：被黑绿豆分离物感染后出现系统花叶。千日红(Gomphrena glohosa）：ivoryCoast分离物引起千红出现系统症状。尤记录显示对其他分离物敏感。
A,4分布地区
SBMV的发生地包括：前苏联、法国、印度、巴基斯坦，贝宁、科特迪瓦、加纳、摩洛哥、尼口利亚、塞内加尔、多哥、哥斯达黎加，尼加拉瓜，墨西再、美国、巴西、哥伦比亚、委内瑞拉。SBMV在美国分布较为广泛.阿肯色、加利福尼亚、佛罗里达等11个州都有该病毒发生的报道。A,5传播途径
SBMV和SCPMV主要通过种子传播，莱豆种传率1%~~5%，就豆种传率5K～40以。A.6抗原特性
SBMV抗原性强：容易制备高滴度的特异抗体。3
KAoNiKAca
SN/T3438—2012
粒体形态
病毒粒体为等轴对称的二十面体（T一3），无包膜，直径约30nm。A.8基因组
SBMV基因组为SsRNA，全长约4136nt，编码4个蛋白：病毒基因组5和3°端分别含有一段非编码区。SCPMV基因组结构与SBMV相同，全长约4194nt。A,9SCPMV分子检测
A.9.1SCPMV的特异性引物和RT-PCISCPMV的特异性引物见表A1
引物名称
SCPMVf
SCPMVI
引物序列
ATGTCCGGTCTATTCCAT
CCATTCGGATAGCGCTC
位置和产物
扩增产物
4178~4194
RNA提取见C.2.1、RT-PCR反体系和条件C.2.2,电泳步骤魔C.2.3。A.9.2SCPMV结果判定
8bp处有扩增片
SCPMV阳性对照经SCPMV特异号
物扩增后在97
异性扩增，样品出现与阳性对照978
段·阴性对照和空白对照无特
增条带，可判定该样品携
PMV：阳性对照、阴性对照和空
致的护
带SCE
白对照正确，样品未出现与阳性对照一致的扩增条带，判定样品不携带SCPMV
KAoNiKAca
B.1试材
B.1.1酶联板。
附录B
（规范性附录）
DAS-ELISA检测步骤
包被抗体：特异性的SBMV抗体
酶标抗体：碱性磷酸酯酶
标记的SBMV抗体
底物：对硝基苯磷酸二钠
PBST缓冲液（洗涤缓冲液PH7.4)NacI
吐温-20
蒸馏水定容至1L。
B.1.6样品抽提缓冲液（pH7.4）NasO.
PVP(MW24000~40000)
PBST定容至1L,4℃储存
B.1.7包被缓冲液（pH9.6）
蒸馏水定容至1L4℃储
B.1.8酶标抗体稀释缓冲液（pH2:4D)BSA牛血清白蛋白）或脱脂好粉
PVP(MW24000~40000)
PBST定容至1L，4℃储存。
B.1.9底物(pNPP)缓冲液(pH9.8)MgCl
三乙醇胺
溶于800mL蒸馏水中，用HCI调pH值至9.8，蒸馏水定容至1L，4℃储存。B.2程序
B.2.1包被抗体
SN/T3438—2012
用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加入酶联板的孔中，100uL/孔，25C孵育4h，清空孔中溶液，5
KAONIKAca
SN/T 3438--2012
PBST洗涤6-~8次。
B.2.2样品制备
待测样品按1：10（质量：体积)加人样品抽提缓冲液，用研钵研磨成浆7500g离心10min，上清被即为制备好的待测样品。阴性对照、阳性对照作相应的处埋或按照说明书逝行；空白对照为样品抽提缓冲濑。
根据检测需要设计96 孔(或48 孔)酶联板,包括 2 个阴性对照孔、2 个降性对照孔,2 个空白对照孔和多个待测样品孔。加样量为100μl./孔,每个样品设1个重复。4℃冰箱孵育过夜.酶联板用PBST铣涤6~-8次，
B,2.4加酶标抗体
用酶标抗体稀释缓冲液接说明将酶标抗体稀释工作浓度，并加人到酶联板中，10μL/孔，2:孵育2 h,PRST 洗涤 6~~8次。
B.2.5加底物
将底物力NPP而,人到底物缓冲液中使终浓度为1mig/ml(现配现用）,按100l./孔·加入到酶联板中，室温避光孵育。
B,2.6读数
用酶标仪在30min.1h利2h于405nm处读oD值。注：实际检测时,孵育温度、PBST洗涤次数和显色读数时间需接照检测抗体或试剂盒中说明书痫规定执行。B. 3 结果判定
B, 3. 1对照孔的 ()I)105值(缓神液孔,阴性对照及阻性对照孔),应该在质量控制范围内,即：阴性对照孔的（D值0.15；
阳性对照0Das值/阴性对照（Dx。值2；一样品的OD值应基本-致：
B.3. 2在满足了B. 3. 1质量要求后,结果原则上可判定如下：一样品（D值/阴性对照（L)值2.判为阳性：一样品（3L)aGs值/阴性对照（Da>值接近阈值，判为可疑样品，需重做饮或用其他方法验证；—样品（D值/阴性对照（)>D值2，判为阴性：B.3.3若满足不了 3, 3.1质量要求,则不能进行结果判定。质量控制标准和结果判定需按照检测抗体或试剂盒中说明书的规定执行。TKAONIKAca
C.1试剂
C.1. fTrizr>.裂解液。
C.1.2三氯甲烷。
C. 1. 3 异丙醇。
C. 1. 4 75%乙醇。
C.1.5去离子水(DEPC处理），
C. 1, 6 50X TAE
冰醋鞍
NaEDTA.21I.O
附录C
（规范性附录）
RT-PCR 检测步骤
57,l ml
加去离了水定容笔！。用时加水稀释至「AE，C.1.76×加样缓冲瓶
0.25%浪酚蓝
40杀（质量浓度)茂糖水溶液
C. 2 实验步骤
C. 2. 1总 RNA 提取
SN/T3438—2012
称取 0. 1 g植物组织加被鼠研磨成粉末状,迅速将其移人灭菌的1.5 mL离心管中,加,人1 ml.的TrizoL试剂,刷烈振荡摇匀后室温保持5 rnin;4℃,12 000 g 离心IC min,取上清液;加(.2 nil三氯甲烷并剧烈振荡混匀;4℃，12000g离心10min,取上清液；加0.6倍体积的异丙醇.颠倒混勾，室温保持5min：4℃.12000g离心10min弃上清液；加75%的乙醇洗涤沉淀，4℃，7500g离心2min.弃乙醇；沉淀于室温下充分干燥后,溶于30μL去离了水(DEPC,处理)中，20℃C保存备用。也可采用等效的试剂金提取总RNA
C. 2. 2 RT-PCK 反应
RT-PCR检测引物见表C.1。cLNA合成反应体系20gL：在0.2mI.反应管中加人总RNA6μL，1μ下游物（20μinol/)，去离子水4μ.10mmol/dTP1μl,65水浴5min，取出后立即放在冰I,加八5XFirstSirand缓冲液μL40U/μLRNascBlock Ribonucelease Inhibitor1μL，0.3nol/T.TT2μL，2水浴2min，然后再加人200U/μLReverseTranscriptase1uL，泥勾后42C水浴50min,70C水浴15min，合成eDNA。HirslStraud缓冲液租RtverxeTranseriptaxe的用最需要依据反转录酶的品牌逃行调整。也可采用一步法RT-PCR试剂盆进行扩增SN/T 3438—2012
引物名称
表 C. 1 引物序列、位置和产物序列5°-3*)
ATCGCGAAGAGGTTGAC
ACTTTTGGATTACGCTCCATC
3 207 ~-$ 223
4 116-~4 136
矿增产物
PCR反应体系见表 C. 2。反应参数:94 ℃ 5 min; 94 C 30 5,52 C: 15 s.72 60 s,39 个循环;72 ℃ 5 min。也可采用一步法RT-PCR 试剂盒进行扩增。表 C. 2PCR 反应体系
10>PCR缓冲液
dNTH10 mnol/L
1.游引物（20pmol/ul）
下游引物（20cl/μ）
Tag博(5 Ll)
NA模板
C.2.3电泳
C. 2. 3. 1 制备凝胶
补足反应总体积至25 μl
配制1.5%（质量浓度>的琼脂糖凝胶。漠化乙锭可直接加人琼脂糖凝胶中（浓度为0.5μg/m1.)，也可在电泳完成后使用溴化之锭染色。C.2.3.2电泳
用！μL.6X加样缓冲液与5μL样品混合，然后将其和适合的DNA相对分了质量标准物分别加到样品孔中。电泳结束后将琼脂糖凝胶置丁紫外透射仪上观察，拍照保留结果。C.3 结果判断免费标准bzxz.net
SBMV阿I性对照经SBMV持异引物扩增后在930bp处有扩增片段，阴性刘照和空白对照无特异性扩增，样品出现与阳性对照一致的扩增条带，可判定该样品SHMV阳性；阳性对照、阴性对照和空白对照正确，样品米山现与阳性对照-致的扩增条带，判定结果为阴性，
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