SN/T 3433-2012.Detection and identification of Rigido porus lignosus ( Klotzsch) Imaz.
1范围
SN/T 3433规定了出人境植物检疫中橡胶白根病菌Rigidoporus lignosus ( Klotzsch) Imaz. 的检疫鉴定方法。
SN/T 3433适用于橡胶属Hevea等植物种苗及其他繁殖材料上橡胶白根病菌的检疫鉴定。
2原理
学名:Rigidoporus lignosus ( Klotzsch) Imaz.
异名: Fomes lignosus( Klotzsch) Bres.
Rigidoporus m icroporus(Fr. )Overeem
Pol yporus lignosus Klotzsch
橡胶白根病菌Rigido porus lignosus (Klotzsch) Imaz, 属于真菌界Fungi,担子菌门Basidiomycota,担子菌纲Basidiomycetes,无隔担子菌亚纲Holobasidiomycetidae, 非褶菌目Aphyllophorales, 薄孔菌科Meripilaceae ,硬孔菌属Rigidoporus真菌。
橡胶白根病菌属根部专性寄居菌,主要寄生橡胶属植物的根部,离开寄主组织在土壤中不能存活。
该病菌在侵染植物的过程中能产生粗细不一的根状菌索,天气潮湿时在病变根部长出子实体。该病菌主要通过根系接触,借根状菌索蔓延而传播,也能借子实体产生的担孢子经过气传沉降到树桩切面或根系伤口形成新的侵染源,再经过根系接触传播。该病菌的为害症状、形态特征、培养性状、致病性测定及分子生物学信息是鉴定橡胶白根病菌的依据。详细资料参见附录A和附录B.
3试剂与培养基
3.1试剂
燕麦片、琼脂粉、蔗糖。
三烃甲基氨基甲烷盐酸盐、十六烷基三甲基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮、乙二胺四乙酸、蛋白酶K、冰醋酸、溴酚蓝、氯化钠、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、DNA相对分子质量Marker、溴化乙锭、次氯酸钠。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3433—2012
橡胶白根病菌检疫鉴定方法
Detection and identification of Rigidoporus lignosus (Klotzsch) Imaz2012-12-12发布
中华民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-07-01实施
本标难按照G13/T1.1-2000 给出的规则起草，SN/T3433—2012
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。木文件的发布机构不承担识别这些专利的责任，本标准由国家认证认可监督管理委员会提山并归口。本标准负责起节单位：中华人民共和国海南山入境检验检疫局。本标参加起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局，中华人民共和国广东山人境检验检疫局bzxz.net
本标准主要起草人：韩下春,刘福秀、李伟东,徐卫、林明光、赵立荣、闻伟刚。1范围
橡胶自根病菌检疫鉴定方法
SN/T 3433--2012
本标准规定「出入境植物检疫中橡胶白根病菌Rigidoporustignosus（Klotzsch）Imaz.的检疫鉴定方法。
本标准适用于橡胶属Hevea等植物种苗及其他繁殖材料上橡胶白根病菌的检疫鉴定。2原理
学名:Rigidoprrus lig naus(Klaizsch) Imaz.异名:Fames lignosus(Klotzseh) Bres.Rigzdoporusmicroporus(Fr.)OvereemPotypurus tignusus Klnizsrh
橡胶内根病菌Rigidoporuslignosus（Klotzsch）Imaz.属于真界Fungi，担子菌门1Basidiomycuta。担子菌纲Basidliomyceies，无隔担子菌亚纲Holobasidiomycetidae，非裙菌口Aphyllophorales，薄孔菌科Meripilaceae，硬孔菌属Rigidaporns真菌。橡胶白根病菌属根部专性寄居菌，主要寄生橡胶属植物的根部，离开寄卡组织在十壤中不能存酒。该病菌在侵染植物的过程巾能产生粗细不一的根状菌索·天气潮湿时在病变根部长出了实体。该病菌主要通过根系接触，借根状菌索莫延而传播，也能借子实体产生的扭孢子经过气传沉降到树桩划面或根系伤口形成新的侵染源，再经过根系接触传播。该病菌的为害症状、形态特征、培养性状、致病性测定及分子牛物学信息是鉴定橡胶白根病菌的依据。详细资料参见附录A和附录B。3试剂与培养基
3.1试剂
燕麦片.琼脂粉.蔗糖，
三烃甲基氨基中烷盐酸盐、卜六烷基三甲基溴化铵.聚乙烯吡略烷酮、乙二胺四乙酸、蛋白酶K、冰醋酸、澳酚蓝、氯化钠、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇,DNA相对分了质量 Marker、溴化乙锭、次氯酸钠。10XPCR缓冲液、氟化镁、dNTP,Taq DNA聚合酶、PCR 引物、琼脂糖。3.2培养基
病菌分离和纯化采用燕麦琼脂培养基（见附录（)）燕麦琼胎平-板：将灭菌燕麦琼脂培养基熔化后倒人灭菌的培养川中.形成2mm-~3mm厚的平版燕麦琼脂斜面：将2ml.~4mL燕麦琼脂培养基装人试管中，火菌后，立即将试管摆放在一定斜度的坡面上，凝固后制成斜面培养基。4仪器和用具
4.1收器
PCR仪、超净工作台，高压灭菌锅、制冰机.核酸蛋门分析仪、高速冷冻离心机、台式小型离心机、超SN/T3433—2012
低温冰箱、常规冰箱、漩涡振荡器、电泳仪、凝胶成像系统、生物显微镜、牛物培养箱、高压灭菌锅、电子天平等。
4.2用具
酒精灯、三角瓶、培养Ⅲ、试管、载玻片、盖玻片、接种针、接种环，移液器、手术刀、剪刀、镊子、玻璃棒等。
5检疫与鉴定
5.1症状观察
仔细观察橡胶树种苗根部，看有无典型或可疑症状，症状描述参见附录A。5.2样品抽取
发现可疑植株，切取感病部位组织，或将整株可疑植株带回实验室作进一步检测。6鉴定方法
6.1病菌形态鉴定
组织保湿观察
用塑料盒作为培养器皿，在盒内铺上保湿滤纸，将采集可疑病根组织样品置于滤纸上，无菌水喷雾保持病根组织高度湿润，置培养箱内在28℃士C黑暗或期光下培养，3d后观紧病根有无菌索产生。若有菌索产生，则进一步采用培养基法进行病菌分离纯化培养。6.1.2病菌分离培养
剪取可疑的病变植物组织先用清水洗干净，用0元
5%次氯酸钠溶液表面消毒5min，灭菌水洗3次，无菌滤纸吸干表面水分，将病组织移到燕麦琼脂平板培养基中，置室温28℃士1℃培养3d。如发现可疑的
菌落，及时将菌落移植另一新的無麦琼脂平板上·进一步纯化培养，将纯化菌株移植到燕麦琼脂斜面培养基上.4℃保存备用。
6.1.3病菌形态观测
将6.1.1或6.1.2分离纯化的病菌在显微镜下进行镜检，观察形态和测量数值。6.2分子生物学鉴定
6.2.1DNA提取
将有疑似症状的植物组织或分离的菌丝，按CTAB法提取DNA(见附录D)。6.2.2特异性引物PCR凝胶电泳检测从植物病组织中抽提总DNA，用橡胶白根病菌的标准菌株作阳性对照，用健康植株抽提总核酸作阴性对照，用超纯水作为空白对照，进行特异性引物PCR凝胶电泳检测（见附录E)2
TTKAoNiKAca
6.3致病性测定
6.3.1供试植物材料
SN/T3433—2012
致病性测定采用栽培较为广泛分布的感病品种巴西橡胶Heueabrasiliensis。种子先用自来水冲洗干净，并用0.5%次氟酸钠表面消毒5min，无菌水冲洗5min，将处理好的种子放在人工气候箱25℃进行催芽。取萌芽种子播在30cmX×50cm的塑料盆中，种植介质为灭菌的细沙和有机土（比例为1：2）。植株在室温下生长至平均株高30cm（约2~3个月）时用于接种实验6.3.2菌丝块接种
接种前10d，将保存于4℃下的菌种移植转到新鲜麦琼脂平板上，在28℃士1℃下，12h光照/黑暗重新培养。7d后在菌落边缘初取直径约2mm的圆块，作为接种菌丝。用手术刀在供试植株的主根基部切出一个约5mm的圆形切口，次氟酸钠溶液表面消毒，再将直径2mm的菌丝块放人根部的切口中，用封口膜封好以防水分流失。同时接种无菌燕麦琼脂培养基块作为对照，实验重复3次，每个重复的菌株及对照接种至少3棵植株接种完后将植株移人温室中培养，控制环境温度准25℃~28℃，相对湿度维持在50%~90%。接种7d后观察植株叶片是否有褪绿，变小缩等症状，根部是否有菌丝菌索或了实体产生，每天观察次，接种45d后所有植株均不发病视为不致病。6.3.3病原菌再分离
检查植株是否有7.1描述的症状出现，并按6.1.1或6.1.2方法对6.3.2发病并表现典型症状的植株接种部位附近的组织进行病菌再分离按7.2插述的病原特征对分离物进行观察。7鉴定特征
7.1症状特征
7.1.1地上部分症状
叶片发病初期无明显症状，发病后期叶片开始绿变黄，失去闪亮的腊质而缺乏光泽，反卷呈舟状这种现象最初只在一条或几条枝条上出现，很快整个树冠的叶片褪色、变黄，最后落叶，枝条回枯，导致整株死亡。
7.1.2地下部分症状
感染病菌的根部表面长满白色菌丝体，并粘附有白色网状菌索，严重时散发蘑菇味。菌索在侵人树皮部位之前有菌索的附着部分，这一部分有时能延伸250cm之长。菌索的生长端白色、扁平。老菌索近圆形、淡黄色。菌索粗细不一，但粗度最多不过0.6cm，有时菌索能连结成连续的菌片，在暴露的根系上常常产生子实体，天气潮湿时尤易产生（参见附录A）。7.2病原菌特征
菌丝一般只有少数分枝。在燕麦琼脂培养基中，菌丝呈白色，具轮纹，特别是先端更明显，菌丝宽度平均3.05m2.64μm~4.29m）（参见附录B）。菌丝沿病根部表面生长，并形成网状菌索。菌索先端扁平、白色，后端呈圆形，黄褐色，直径0.6cm。组成菌索的菌丝平均宽2.31mm1.98μm~3.96μm）。3
KAONIKAca
SN/T 3433-2012
子实体檐牛、尤柄·通常单生.也有群4，难识成层，长达数尺。新鲜子实体草质或木质，长径8.2cm-8.行cm，短径5.1心m5.3rm，其上面橙黄色具轮纹，并有放射性沟纹有明显的鲜黄色边缘，下表间橙、红色或谈揭色。子实体纵切能区分出两层，上层菌内广色，厚2cm~3cm：下层管孔红褐色，厚1m~2n.
于摔状，无包，人小4.044m×1765um.3.96=m~6.27nm）)×（9.9m23.！um)，顶端荐牛4支细小的排了梗，其上着生扭孢于。在担了之间有棍捧状无色的薄堆附胞。担了产生的担泡十透明光滑，光色，细脑壁薄.内含物少.近例形或蔽圆形，顶端较尖.有一池滴·拉孢子大小为1.66m×1m(3. 3 μm~7.26 μm)
7.3PCR特异性产物
PCR扩增产物，经电泳后，只有条494bP的月的计段：8结果判定
以橡胶根病菌在橡胶上役染产生的症状、担子采、拟、扒孢了的形态特征或分离菌的PCR产物作为鉴定依据，近行综合判定。若病原岗引起的症状特征、病原菌形态特征及待异PCR检测结果与7.1、7.2和7.3的鉴逆指标符合，可鉴定为橡胶白根疾菌，否则不视为橡胶白根病菌。必要时，按6.3选行致病性试验.
9样品保存与复核
9.1样品保存
病根样品经登记和签字后置了不“冰箱或阴凉燥、防虫防鼠处妥善保存；伴品中分离出的稼校白根病菌·在燕变原脂斜而培养基28℃十1℃培养7心后-置丁4℃冰箱保存或将菊种用冷冻十燥机制成冻1粉置于一29低温冰箱保存。对鉴定为像胶凹根病菌的病根样品套少成保存1年，以备复检淡判和仲裁，样品保存期满后-需经无害化处理，
9.2结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类，时问，实验的时间、地点，方法和结果等，并要有实验人员和市核人员签字。
9.3复核
出国家质量监臀检验检疫总局指定的单位或人员负责。土要考察实验记录、照片等资料的完整性和真实性.必要时进行复核实验，4
KAoNiKAca
A.1名称及分类地位
附录A
（瓷料性附录）
橡胶白根病菌相关信息
学名:Rigidoporu Jitmnss(Kloizseh)Imaz异名：Fonestigmusts(Klutzsch)Bres.Rigidoporus microporus(Fr.JOvereemPutyporus ligrosus Kiotzsch
英文名: White root diseasce of Hevea rubben中文名：橡胶白根病
SN/T3433—-2012
橡胶白根满菌Rigidupurus ligmmsus(Klotzseh)Imaz,属丁菌物界Fungi,扭了菌门Basidiomycota担子菌纲Hasidiurycetes，无隔担子菌亚纲Hulobasidioniytlitae，作裙菌HAphyllopliotralch：薄孔菌科Meripilaceae,硬孔菌属Rigidoporus真菌A, 2 为害症状
橡胶根部由于受到病原菌侵染，导致植株水分、养料吸收受到「扰而在地上部分表现叫片变位、尖绿、蕊和枝枯等症状，最后整株死亡。病树根表层紧贴有根状菌素，沿根生长时分枝.形成网状。典型的根状菌索先端白色、扁平，老熟时形,黄色至嗒黄色。刚被杀死的木质部褐色，白色或淡黄色：坚硬,仅在湿十4膚根可吴果酱状：亡根病根状菌紫与腐牛菌产生的根状菌索有区到·前者紧贴根表，根皮有坏死后者菌索松散附着在根上，根部表皮完好。4.3寄主范围
豫胶自根病菌的寄主植物范围非常广泛，除像胶属植物外，还有番荔枝Antumaquamosa,印度麻Apocynumcamnabinun、萝蜜Ariocurpusheterophyllus茶Camelliasinersis，桔Citrusreticututa、i啡Coffeaarubica、椰-fCocasmucifera，樟树Cinncrmomumcamphnra，龙脑树Dryobilanopsarornaiicu、i棕Flueis guiensis，细叶按 Euculypus leraricrnis，删 桐Erythrinm uriegata，木棉树Gosampinumalaharicus、银合欢Leucaena glauca、果Mangiferuimicu，人心果Munilkarazapotu、木薯Manihonescutenta、胡椒Pipermgrun槟榔recacathiecu、可可Thecbromdcacaro及京科植物等。4.4发病规律
橡胶凹根病菌属根部专性寄居菌。该病闲主要以丛林病树的留树桩或各种灌木等野生寄主为侵染来源，如带病校树的不断生长，根系纵横交替相互按触时借助病根上已形成的根状菌索的蔓延传播，使其发病；此外，病菌的子实体产生的分生孢子也能通过气流、雨水传播到胶树伤口、树桩切面或根部。在适监环境下·拖了萌发产生侵人丝侵人胶树，扩展致使其发病，又形成新侵染源，再由根系接触传给其他胶两造成根系感染而发病，如此而逐渐地莞延到周围健康胶树形成病区。5
rKAoNiKAca
SN/3433--2012
A.5传播途径
主要依靠病株残体或带病种苗进行远距离传播A.6地理分布
橡胶亡根最先子1904年在新加坡发现·之后在马来西亚、印尼（爪哇.苏门答腊）),泰国、印度、斯坐兰卡、缅甸、尼日利亚、刚果.安码拉、塞拉利昂、乌干达，中非、埃塞俄比亚、加藿、萍律宾、越南、阿根廷、巴西、秘鲁、望西哥、新赫布里底群岛等地陆续发现。热带胶区大多都是该菌为害的常发区，KAoNiKAca
a）叶片变黄
附录B
（资料性附录）
橡胶白根病菌侵染症状及形态示意图b)根状菌索
图B.1橡胶白根病菌侵染橡胶症状菌落形态
担孢子
b）丝
橡胶白根病菌形态示意图
子实体
SN/T3433—2012
根部形成的子实体
SV/T 3433—2012
C.1　配方　
见表C.1，
燕麦片
蒸馏水
2配制方法
附录C
（规范性附录）
燕麦琼脂培养基的配制
表C.1配方
1 000 mL
将燕麦片加600ml.水，制成句浆，在沸水浴上加热！h，纱布过滤后加人琼脂炼化，加水补至1000mJ..分装灭菌待用21C,20ini)。D.1试剂制备
D.1.1总核酸抽提缓冲液
附录D
（规范性附录）
DNA提取方法
SN/T 3433—2012
3%十六烷基三甲基漠化铵（CTAB）、100mmnl/l.三烃甲基氨基中烷盐酸盐（Tris-HCI)pII8.0、20mmo1/L乙二胺四乙酸（EID)TA)pH8.0.1.4mol/L氯化钠、1聚乙烯吡咯烷酶（PVP）、2%3巯基乙醇。
D. 1. 2TE 缓冲液(plI 8. 0)
1 nmal/LTris-HC],pII 8. 0
0.1 mnol/L ED'IA.
D.1.350 ×TAE电泳缓冲液(pH 8. 0)2.42g
6×上样缓冲液
冰醋酸
0.5mol/LEDTA(pH8.C)
0.25片溴酚蓝40杀蔗糖。
I3. 2总 1NA 提取
样品为橡胶属根部纽织时，取！多植物组织洗净消毒后切成小块，冷冻加液氮研磨.放人1.5mL离心管中待用；样品为病原菌时，收集菌丝放人1.5ml.浸在液氮出的高心管中，用塑料杆碾碎待用。样品管中入1000l.CTAB缓冲液（缓冲液中加0.蛋白酶K)混勺,65℃水浴1ht13000g离心15min，保留上清液：加500ulTrig饱和酚：三氯甲烷：异戊醇（体积为2，：241）混匀.13000g心15inin，保留上消液，再加500ul，二氯中烷：异戊醇（体积为24：1）混匀.13000g离心15min，取1.清液；加人1mL异内醇混13000g离心30min，可见T)NA沉淀；70%乙醇洗DNA沉淀两次，无水乙醇洗漆两次，并倒置离心管1min;加人 100 μl TE缓冲液悬浮总核酸,用260 ntr紫外线检测DNA纯度,置于一20 下保存备用。
其他的DNA提取方法也可以借鉴，也可以选择使用商业DNA提取试剂盒，提取的DNA在一80℃的条件下可以冻存1年。
SN/T3433—2012
E.1特异性引物序列
见表E.1。
特异性引物
附录E
（规范性附录）
特异性引物PCR凝胶电泳检测
PCR检测的特异性引物序列及扩增产物引物择列
5-GAG CCTCTCTTG CCOTCT CC-3
5TCCTCCGCTTATTGALATGC3
E.2PCR反应体系及参数
E.2.1PCR反应体系
见表E.2。
试剂名称
10XPCR反应缓冲液
正向引物
反向引物
TaqDNA聚合酶
DNA模板
超纯HO
反应条件
PCR反应体系（25L体系
终浓度
20ml/L
20Amol/L
扩增产物
94℃预变性5min，然后进行30个循环：94℃变性30s.62℃退火30s.72℃延伸1min。最后一个循环结束后72℃继续延伸6min。E.3
琼脂糖凝胶电泳
PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电冰分析。每个样品取5L的PCR产物与1uL的6×上样缓冲液10
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